專利名稱：Ccr5自體多肽疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及基因合成、蛋白疫苗的構(gòu)建、動物免疫實驗、誘導(dǎo)抗血清的體外檢測等技術(shù)，特別是CCR5自體多肽疫苗及其制備方法。
背景技術(shù)：
艾滋病(acquired immunodeficiency syndrome簡稱AIDS)是由人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus簡稱HIV)感染所導(dǎo)致的一種病死率極高的慢性傳染病，正在全球肆虐。全球艾滋病病毒感染者人數(shù)已達4030萬，死亡2500萬，2005年度新增艾滋病病毒感染者490萬，其中成人達到420萬，310萬人因艾滋病死亡。目前艾滋病的治療和預(yù)防并沒有非常有效的措施，治療主要集中在抗病毒治療而預(yù)防則主要是宣傳教育和切斷HIV傳播的途徑。抗病毒藥物主要包括逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、蛋白酶抑制劑、HIV進入/融合抑制劑、整合酶抑制劑等等，雖然高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法(highly activeanti-retroviral therapy，HARRT)在臨床上取得了很好的效果，但抗病毒藥物的應(yīng)用容易引起了HIV基因的突變，進而產(chǎn)生耐藥性，遠期治療效果并不是很肯定，并且由于艾滋病感染人數(shù)巨大，且大都集中在發(fā)展中國家，多數(shù)AIDS患者支付不起昂貴的抗病毒藥物治療，因此抗病毒治療并不能有效地控制AIDS的傳播。切斷HIV傳播的途徑雖然對預(yù)防HIV感染有意義重大，但不能從根本上解決問題。由于疫苗在疾病的預(yù)防和治療中發(fā)揮了重要的作用，因此AIDS自發(fā)現(xiàn)之日起，人們都一直嘗試研制一種艾滋病疫苗來控制和預(yù)防HIV感染，如滅活疫苗、減毒活疫苗、病毒顆粒樣(VLP)疫苗、重組亞單位疫苗、重組活載體病毒疫苗、DNA疫苗等，已有近35種的HIV疫苗進入臨床實驗但均未達到預(yù)期的效果。分析失敗的主要原因是HIV高度遺傳變異性所致，因此以HIV為靶標(biāo)的疫苗設(shè)計和研制陷入困境。隨著對HIV感染機制研究的深入，HIV輔助受體的發(fā)現(xiàn)為新型抗病毒藥物和HIV疫苗的研制提供了新的靶點。CCR5是HIV的重要輔助受體，參與HIV與細胞膜融合過程，是早期HIV進入細胞所需要的最重要分子之一。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)CCR5 Δ32突變的純合子幾乎不被感染，突變的雜合子則明顯延長了AIDS的發(fā)病時間。CCR5缺失或突變對機體的正常生理功能幾乎沒有影響但直接影響著HIV病毒對機體的感染水平。因此近年來，以CCR5為靶點的抗HIV策略越來越受到重視，其中包括CCR5拮抗劑，CCR5單克隆抗體，RNAi干涉，CCR5自體疫苗等，其中以CCR5為靶點的自體疫苗的研究為設(shè)計和研制新型AIDS疫苗提供了一條新的思路。
本發(fā)明在分析CCR5結(jié)構(gòu)和計算機抗原表位預(yù)測的基礎(chǔ)上設(shè)計了1種CCR5自體多肽疫苗候選抗原，并利用基因工程手段和蛋白質(zhì)純化技術(shù)，獲得純化的重組蛋白樣品，以純化的蛋白免疫動物，檢測抗體滴度，和進行抗血清對表達CCR5受體的細胞結(jié)合實驗，為下一步動物模型免疫和抗HIV感染研究奠定一定的基礎(chǔ)。
1 CCR5分子與HIV感染的關(guān)系1.1 抗HIV感染新的靶點-CCR51.1.1 CCR5的發(fā)現(xiàn)艾滋病自1981年發(fā)現(xiàn)以來，人們不斷地研究它的發(fā)病原因、傳播途徑及防治方法。雖然已發(fā)現(xiàn)T細胞表面的CD4分子是HIV進入靶細胞的受體，但僅用CD4分子未能充分解釋HIV是如何入細胞的，直到1996年人趨化因子受體CCR5的克隆成功，人們才發(fā)現(xiàn)在感染初期，HIV-I感染人體除通過結(jié)合T細胞表面的CD4分子外，還需結(jié)合CCR5這一輔助受體，才可感染并進入體內(nèi)。輔助受體的發(fā)現(xiàn)，使得人們對HIV感染及作用機制的了解邁進了一大步。
1.1.2 CCR5基因結(jié)構(gòu)及其多態(tài)性CCR5基因定位于3p21，編碼蛋白長352個氨基酸。CCR5基因由一個啟動子區(qū)域兩個外顯子和中間分隔的1.9kb內(nèi)含子組成。外顯子1含有43bp的5’非翻譯區(qū)(5’UTR)，外顯子2含有11bp的5′-UTR和完整的開放閱讀框。目前，在此基因的編碼區(qū)和啟動子區(qū)域發(fā)現(xiàn)了多種有意義的突變，現(xiàn)就幾種常見的類型加以闡述。
1.1.3 CCR5基因在編碼區(qū)的突變CCR5Δ32是指當(dāng)CCR5基因編碼區(qū)域第185位氨基酸以后發(fā)生了32個堿基缺失，稱之為CCR5Δ32突變。CCR5Δ32包括純合子和雜合子兩種，CCR5Δ32純合子即其兩條鏈均發(fā)生了32個堿基的缺失，而雜合子則是指只有其中一條鏈發(fā)生堿基缺失。到目前為止，已有許多研究者對CCR5Δ32的作用進行了分析，一致認(rèn)為其純合性突變能有效地抵制HIV病毒的感染，其原理可能是突變后導(dǎo)致讀碼框架移位，造成翻譯的多肽提前終止，在淋巴細胞膜表面產(chǎn)生截短的、無功能的跨膜蛋白質(zhì)，從而使HIVgp120的V3環(huán)不能與CCR5Δ32有效的結(jié)合，使HIV不能進入宿主細胞，進而影響AIDS的發(fā)展。另外有些研究者認(rèn)為存在CCR5Δ32突變時，CCR5的配體即趨化因子RANTES、MIP-1α、MIP-1β會增加，與HIV競爭結(jié)合CCR5從而在抵制病毒侵人及延緩疾病進展方面起作用。CCR5Δ32雜合子可以顯著延遲AIDS的發(fā)生，原因可能是CCR5Δ32雜合子會減少CCR5在細胞表面的表達，從而減少進入體內(nèi)的病毒量，并在慢性感染早期，可減少病毒復(fù)制，明顯減少HIV病毒RNA在血清或血漿中的含量。但是CCR5Δ32雜合性突變也有其局限性，在一些研究中人們發(fā)現(xiàn)，其延緩AIDS進程的作用只不過是在血清轉(zhuǎn)陽性后的2～4年。目前，各國學(xué)者都已在CCRSΔ32多態(tài)性方面進行了研究。經(jīng)鑒定，在美國白人和歐洲后裔中，CCR5Δ32等位基因頻率約為10％，在全歐洲、中東和印度次大陸為2％～5％。王福生等研究測定中國漢族人群CCR5Δ32等位基因頻率為0.119％(n＝1267)，由此可見，在不同人種中CCR5基因突變具有相對特異性。CCR5基因編碼區(qū)中還存在7個以上易發(fā)生突變的位點，如CCR5m303、CCR5-164A、664T、668A、894C、996T、1004T和1016T等。在日本和中國人中，發(fā)現(xiàn)有CCR5-668A和CCR5-893-894C突變頻率均為4％。CCR5m303是指在編碼區(qū)第303位點由T到A的點突變，這一突變會使終止密碼提前產(chǎn)生，從而導(dǎo)致CCR5翻譯的提前終止，導(dǎo)致無功能的CCR5穿膜蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，因此也可起抵制病毒感染的作用。但這一突變的頻率遠低于CCR5Δ32，Ometto等對不同人種進行檢測，發(fā)現(xiàn)CCR5m303突變頻率僅為0.0001％～0.1％，認(rèn)為此突變并不是抵抗病毒感染的主要因素，它可能是和CCR5Δ32純合性突變協(xié)同作用的。
1.1.4 CCR5基因在啟動子區(qū)域的突變對世界各地人群的鑒定還發(fā)現(xiàn)，在CCR5啟動子的調(diào)控區(qū)域，也有多種基因多態(tài)性，有些研究者認(rèn)為這些啟動子區(qū)域的點突變，與CCR5Δ32之間存在著連鎖不平衡，因此它們之間可能存在著協(xié)同作用。對不同人群CCR5基因整個序列進行測定、比較，也許會找到不同人群所具有的不同突變，這樣將更有利于深入研究不同人群對HIV的遺傳易感性。
1.1.5 CCR5的分子結(jié)構(gòu)和功能CCR5是細胞內(nèi)β趨化因子的受體，該類受體的第一和第二個半胱氨酸緊靠在一起，因而被稱為CC趨化因子，CCR5也因此得名。CCR5表達于記憶性的靜止期的T淋巴細胞、單核細胞、未成熟的樹突狀細胞等的細胞膜上，分子量為40.6kD，由352個氨基酸殘基組成?？煞譃橐韵聨撞糠职釴末端，3個胞外環(huán)(ECL1-3)，3個胞內(nèi)環(huán)(ICL1-3)，7個跨膜α螺旋和胞內(nèi)C末端，如圖6所示[42]。CCR5的胞外結(jié)構(gòu)中最重要的就是其N末端。N末端含有幾個硫酸化修飾的酪氨酸殘基，帶有負電荷，這些負電荷在CCR5與其天然配體以及HIV病毒的表面糖蛋白gp120的結(jié)合過程中起關(guān)鍵作用。CCR5的胞外區(qū)含有4個Cys殘基，分別位于N末端的20位，第一胞外環(huán)的101位，第二胞外環(huán)的178位，第三胞外環(huán)的269位，這些Cys殘基是維持其胞外結(jié)構(gòu)所必需的。一般認(rèn)為第101和第178位的Cys之間形成了二硫鍵，而第20位和第269位的Cys之間是否形成二硫鍵則存在爭論。CCR5在細胞膜上的位置并非固定不變。在病毒與細胞接觸時，受胞內(nèi)信號的指導(dǎo)，CCR5可以迅速向細胞膜上膽固醇含量豐富的“巢”附近遷移。在那里，CD4分子已經(jīng)被“招募”過來。HIV病毒以其表面糖蛋白(gp120和gp41)與CD4和CCR5分子在“巢”附近相互作用，并最終引起病毒和細胞的膜融合。
1.1.6 CCR5與HIVgp120的相互作用HIV和細胞的融合過程可分為三步第一步，gp120與CD4分子高親和力結(jié)合，病毒吸附到宿主細胞上；第二步，gp120與共同受體(CCR5/CXCR4等)相互作用后構(gòu)象進一步發(fā)生變化，并與gp41分離，gp41形成融合前構(gòu)象；第三步，gp41產(chǎn)生一系列構(gòu)象變化，自身形成螺旋六聚體結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致病毒包膜與細胞膜的融合，病毒的遺傳物質(zhì)進入細胞。上述的融合過程中，gp120和共同受體的結(jié)合是其中關(guān)鍵的一步。這一步使得gp41暴露出來形成融合前構(gòu)象，并直接導(dǎo)致病毒和細胞的膜融合，但是gp120與CCR5的具體結(jié)合機制尚不清楚。HIVgp120/17b/CD4復(fù)合物和SIV病毒gp120核心晶體結(jié)構(gòu)的解析為我們認(rèn)識gp120與CCR5的結(jié)合機制提供了較為直接的認(rèn)識。根據(jù)解析的復(fù)合物結(jié)構(gòu)，研究者發(fā)現(xiàn)17b結(jié)合于gp120上的β2、β3、β20和β21四個β片層共同組成的“bridging sheet”結(jié)構(gòu)域。該結(jié)構(gòu)域可能也是CCR5的結(jié)合位點，因為17b的重鏈CDR3與CCR5富含硫酸化的酪氨酸和酸性氨基酸殘基的N端很相似。無配體的SIV病毒gp120核心結(jié)構(gòu)中β2、β3和β20、β21在空間上存在2.0～2.5nm的距離，該結(jié)構(gòu)域的形成推測與CD4與gp120的結(jié)合直接相關(guān)。除了“bridging sheet”結(jié)構(gòu)域外，CCR5還同gp120的V3環(huán)相互作用。證據(jù)主要有針對V3環(huán)的抗體可以有效地抑制gp120-CD4復(fù)合物與CCR5的結(jié)合；V3環(huán)的缺失或者突變可使病毒利用CCR5作為共同受體的能力削弱或消失；衍生于V3環(huán)的多肽能同CCR5結(jié)合，抑制病毒和細胞的融合。最近在一些病程進展緩慢的人血液中檢測到可溶性的CCR5，其表達水平甚至超過存在于細胞膜上的CCR5分子。抗體結(jié)合試驗表明，其僅包含有正常分子的N末端和第一、二胞外區(qū)及第一到四個跨膜螺旋區(qū)。這種可溶性的CCR5可能通過與正常表達的CCR5競爭同gp120的結(jié)合而起到延緩病程的作用。因其基因結(jié)構(gòu)并未發(fā)生改變，推測可能是一種未知的酶降解正常表達的CCR5的結(jié)果。研究發(fā)現(xiàn)，將CXCR4的N末端與CCR5的N末端互換后二者均不能支持R5嗜性的病毒進入細胞。另外，單獨替換人CCR5的任何區(qū)段為鼠的相應(yīng)區(qū)段并不能顯著地影響人CCR5的功能，而鼠與人類的CCR5有82％的序列相同。由此推測，可能CCR5的多個區(qū)域參加了與的gp120結(jié)合。目前認(rèn)為，gp120和CCR5的相互作用可能遵循兩步結(jié)合機制第一步，CCR5的N末端區(qū)域采取恰當(dāng)?shù)臉?gòu)象識別并結(jié)合gp120；第二步，gp120與CCR5的構(gòu)象發(fā)生變化，CCR5的第二胞外區(qū)與gp120的V3區(qū)相互作用，最終導(dǎo)致膜融合和病毒遺傳物質(zhì)進入細胞。
1.1.7 CCR5與HIV嗜性HIV感染靶細胞時，其胞膜蛋白gp120首先和細胞膜上CD4結(jié)合，在CD4的誘導(dǎo)下，gp120的V3環(huán)(位于可變區(qū))與CCR5的胞外環(huán)間形成靜電相互作用，驅(qū)動CCR5的N-TERM結(jié)合gp120的保守區(qū)。gp120與趨化因子受體CCR5的結(jié)合最終導(dǎo)致了HIV穿膜蛋白gp41與細胞的融合和病毒進入細胞。單核細胞/巨噬細胞嗜性的病毒株利用β-趨化因子受體CCR5侵入細胞，稱為R5嗜性；T細胞嗜性的病毒株利用α-趨化因子受體CXCR4侵入細胞，稱為X4嗜性；還有一些病毒株即能利用CCR5，又能利用CXCR4侵入細胞，稱它們?yōu)镽5X4嗜性。HIV在感染一個新的個體時，首先感染單核細胞/巨噬細胞，以及部分的初生的T細胞，未分化成熟的DC細胞，通常是R5嗜性的，隨著病程的發(fā)展，HIV既利用CCR5又可以利用CXCR4受體演化成為R5X4嗜性，一般是典型病程感染4-5年后，病毒株在個體中約50％發(fā)生衍變進化，不僅感染初生的T-細胞還能感染T-細胞系，并介導(dǎo)其表達細胞與T細胞的融合，成為T-tropic病毒株，即X4嗜性病毒株。這種變化的發(fā)生機制一般認(rèn)為有以下可能(1)早期HIV感染的靶細胞之一DC，其表面有CCR5的表達，它們被感染后可激活T細胞，使之表達CCR5而成為HIV敏感的靶細胞，這樣，DC等有效的介導(dǎo)了M-tropic病毒的擴散。(2)HIV包膜蛋白Env V3 loop是協(xié)同受體利用的主要決定族，HIV利用協(xié)同受體的改變可能是由于位于Env V3 loop(148-155)的幾個氨基酸殘基的突變而導(dǎo)致發(fā)生的，EnvV3的突變是HIV易感染難治療的根本原因之一。(3)疾病后期，外周淋巴器官遭到破壞，這些器官的基質(zhì)細胞分泌高水平的SDF-1，而SDF-1又是CXCR4的特異配體可競爭HIV對CXCR4的利用，SDF-1分泌的減少必然導(dǎo)致HIV利用CXCR4的增多，HIV即逐漸演變?yōu)镽4病毒株。因此，通過降低或缺失CCR5的作用，是阻斷HIV進入機體，阻止病毒株演變轉(zhuǎn)化，對抑制HIV的傳染，控制病程發(fā)展將是非常有效的方法。
1.2以CCR5為靶標(biāo)的抗HIV藥物研究進展CCR5是HIV感染初期最主要的HIV輔助受體，HIV感染過程中，病毒膜蛋白與HIV第一受體CD4及輔助受體CCR5結(jié)合是病毒融合進入靶細胞的關(guān)鍵。HIV輔助受體的發(fā)現(xiàn)為抗HIV治療提供了新的作用靶點。針對輔助受體的AIDS治療法具有以下優(yōu)點①針對保守的細胞表面受體，可在一定程度上避免高度的病毒變異的影響；②可阻止病毒進入靶細胞，并非干擾病毒復(fù)制和成熟，因而在細胞存活率及功能保持上優(yōu)于其他療法。
1.2.1受體拮抗劑以CCR5為靶點的HIV受體拮抗劑主要包括以下幾種1.2.1.1趨化因子衍生物β趨化因子RANTES，MIP-1α及MIP-1β作為CCR5的天然配體是HIV受體當(dāng)然的拮抗劑，在一定程度上可以保護細胞免受HIV的感染，其主要作用機制是誘導(dǎo)了CCR5的內(nèi)吞。實驗表明，RANTES誘導(dǎo)的CCR5內(nèi)吞作用是可逆的，即去除RANTES的作用后，CCR5可再回到細胞表面。并且，天然配基具有誘導(dǎo)趨化的功能，會給自身造成損傷，因此人們對天然配基作了一些修飾，AOP(氨基氧戊烷)-RANTES是通過將AOP基團偶聯(lián)到RANTES的氨基末端得到的1個很強的CCR5拮抗劑，在AOP(氨基氧戊烷)-RANTES的作用下，CCR5被修飾后內(nèi)吞，通過內(nèi)體的再循環(huán)被阻斷，細胞表面的表達量不可逆地減少，因此具有抑制R5嗜性HIV感染的作用，并且沒有誘導(dǎo)趨化的功能。LD78β是MIP-1β的同種型，兩者的區(qū)別是僅有3個氨基酸不同，但是它可以下調(diào)CCR5在人類單核細胞和巨噬細胞上的表達，抑制R5感染，最近，有實驗室應(yīng)用基因工程技術(shù)，把RANTES，MIP-1α和MIP-1β在原核和真核表達系統(tǒng)中分別融合表達，得到融合蛋白，動物實驗表明，融合蛋白對CCR5受體也具有較強的抑制作用。
1.2.1.2低分子量非肽類化合物低分子量非肽類CCR5拮抗劑主要有TAK-779，SCH-C，E-913和AD101。TAK-779屬于季銨衍生物，可以阻斷膜融合階段gp120與CCR5的結(jié)合，其作用位點在受體的細胞外側(cè)面，跨膜α螺旋1.2.3.7形成的袋狀結(jié)構(gòu)內(nèi)。SCH-C是小分子肟哌啶類化合物，對CCR5有很高的親和性，嚙齒類和靈長類動物的體內(nèi)實驗表明，R5病毒株的復(fù)制顯著減少，具有良好的應(yīng)用前景。E-913屬于螺旋二酮哌啶衍生物，與CCR5的ECL2結(jié)構(gòu)域C末端結(jié)合，造成gp120與CCR5相互作用的空間阻礙，切斷R5的感染。AD101是與SCH-C結(jié)構(gòu)類似的一種小分子，能特異地與人CCR5和短尾猿CCR5結(jié)合但不產(chǎn)生鈣流信號，對各種基因亞型的R5 HIV都有強烈的抑制活性。其抑制活性約為TAK-779的500倍，IC50約為1nM，是一種很有前途的HIV抑制劑。
1.2.1.3單克隆抗體己知的單克隆抗體類的CCR5拮抗劑主要有PRO140，2D7和CCR-02[59-60]，PRO140是鼠源的單克隆抗體，結(jié)合位點覆蓋CCR5的多個細胞外結(jié)構(gòu)域，在不影響CCR5趨化因子受體功能的情況下，能封閉CCR5的輔助受體功能，有效抑制HIV的粘附，2D7與CCR5的ECL2結(jié)構(gòu)域N端特異性結(jié)合，阻塞gp120的結(jié)合位點，起到抗R5病毒侵襲的作用，CCR-02是CCR5的N末端結(jié)構(gòu)域特異性單克隆抗體，能使CCR5形成二聚體，不干擾趨化因子、gp120，與CCR5的結(jié)合，但是，二聚體形成所引發(fā)的受體構(gòu)象細微變化阻止了gp120與CCR5的進一步相互作用，從而有效拮抗HIV感染。
1.2.1.4肽類化合物具有抑制gp120-CCR5相互作用的肽類化合物也是拮抗劑研究的一個方向[63].S肽含有CCR5的N末端22個氨基酸，不同的是只有10和14位的Tyr被硫化，而20位的Cys換成了Ser。實驗結(jié)果提示，S肽的結(jié)合位點可能位于gp120表面的CCR5結(jié)合區(qū)，它通過干擾gp120與CCR5的結(jié)合而阻斷HIV的侵入。噬菌體表面呈現(xiàn)技術(shù)是將編碼外源多肽或蛋白的基因片斷與噬菌體衣殼蛋白的基因融合，使外源多肽或蛋白呈現(xiàn)于噬菌體衣殼蛋白表面的一項技術(shù)。這項技術(shù)已被廣泛的應(yīng)用到生物技術(shù)的許多領(lǐng)域。應(yīng)用噬菌體表面肽呈現(xiàn)技術(shù)，人們篩選出CCR5配體的模擬多肽，競爭結(jié)合CCR5而達到抑制HIV感染的目的。
1.2.2基因治療藥物核酶是分子簡單，具有催化活性的小分子RNA。它能識別和切割特定的RNA分子并且具有很高的特異性和切割效率，早期核酶主要針對HIV，但HIV的特點是高度變異，因此HIV靶向核酶受到一定限制，人們逐漸把目標(biāo)轉(zhuǎn)向基因比較保守穩(wěn)定的HIV輔助受體CCR5，動物實驗顯示CCR5基因剔除的小鼠幾乎沒有任何的病理改變，進一步研究還發(fā)現(xiàn)CCR5失活對淋巴細胞沒有明顯的副作用淋巴細胞保持正常的發(fā)育速率和存活率；細胞表面標(biāo)志CD3，CD4，CCR2保持正常；對抗原的再刺激，淋巴細胞能夠正常發(fā)育和分泌。人們同時還發(fā)現(xiàn)CCR5突變的純合子個體生理活動和正常人一樣，不會引起機體免疫缺陷和其他臨床癥狀，但對HIV具有較強的抵抗能力甚至可以不感染，因此靶向的CCR5核酶研究已經(jīng)進入一個新的階段。目前國外核酶的研究已進入臨床II期。國外幾家實驗室已經(jīng)嘗試應(yīng)用RNAi技術(shù)來干預(yù)細胞膜上CCR5分子的表達水平，從而達到預(yù)防和治療HIV感染的目的。
1.2.3細胞因子趨化因子分泌和趨化因子受體表達之間存在復(fù)雜的相互作用，它們之間的平衡使靶細胞對感染具有一定的抗性，人們在研究細胞因子的時候發(fā)現(xiàn)，細胞因子在調(diào)節(jié)兩者的平衡方面具有重要的作用，于是細胞因子在抑制CCR5方面的研究出現(xiàn)了一定的進展，雖然相關(guān)的報道不多，但一些研究顯示，TNF-α和IL-2，IL-4，IL-13能夠誘導(dǎo)CCR5 mRNA下調(diào)，抑制CCR5的表達，同時TNF-α，INF-γ可以一起促進β趨化因子RANTES，MIP-1α及MIP-1β的分泌，而β趨化因子可以與HIVgp120競爭結(jié)合CCR5，達到抑制HIV感染的目的。臨床上已經(jīng)嘗試應(yīng)用IL-2來治療HIV感染的患者，其作用的機理一定程度上是抑制了細胞表面CCR5的表達，應(yīng)用細胞因子來調(diào)節(jié)CCR5的表達，開辟了預(yù)防和治療HIV感染的另一條途徑。
1.2.4以CCR5為靶點的自體疫苗研究早期HIV疫苗的免疫策略主要針對HIV病毒的衣殼蛋白gp120，gp41，以及gp120，gp41與CD4結(jié)合的復(fù)合物，但由于HIV高度變異的特性，疫苗雖然誘導(dǎo)出較高的抗體，但動物實驗顯示治療效果不顯著，因此新型疫苗的研究成為抗HIV的目標(biāo)和熱點。隨后相繼出現(xiàn)了核酸疫苗，基因工程疫苗等等。以CCR5為靶點的疫苗策略為預(yù)防和治療HIV感染提供了一條新的途徑。其中幾種CCR5的自體疫苗在動物模型試驗中已顯示了很好的效果。隨著對CCR5結(jié)構(gòu)和功能的進一步認(rèn)識，發(fā)現(xiàn)CCR5膜外片斷N-TERM，和ECL2是與HIVgp120結(jié)合最為關(guān)鍵的片斷，CCR5膜外片斷偶聯(lián)抗原肽成為HIV疫苗設(shè)計的一個重要策略，MAP(multiple antigen peptide)是多聚賴氨酸的多肽，本身沒有免疫原性，MAP與ECL2偶聯(lián)構(gòu)建了CCR5靶向的多肽抗原疫苗，動物實驗誘導(dǎo)出高滴度，高親合力的特異構(gòu)象的CCR5抗體。在此基礎(chǔ)上人們合成CCR5膜外N-TERM片斷與HSP70偶聯(lián)已取得了很好的免疫效果。為了打破B細胞的免疫耐受，誘導(dǎo)出高滴度的抗體，Chackerian，B等人把CCR5膜外片斷與牛乳頭狀病毒衣殼蛋白L1 VLPs(papillomavirus-like particles)偶聯(lián)，免疫小鼠獲得了小鼠CCR5的保護性抗體，接著Chackerian，B等人以短尾猿為動物模型，先把短尾猿CCR5四膜外片斷用GGGGS連接，和SA(streptavidin，鏈菌素)融合表達，后再與VLPs偶聯(lián)免疫小鼠得到針對短尾猿CCR5的抗體，構(gòu)建的抗原免疫短尾猿，誘導(dǎo)出高滴度CCR5特異性的抗體，以SHIV感染動物模型，構(gòu)建的抗原誘導(dǎo)出的抗體表現(xiàn)出很好的保護作用，阻斷了SHIV的感染。最近文獻報道日本科學(xué)家應(yīng)用隨機肽庫篩選CCR5單克隆抗體，得到的多肽可直接誘導(dǎo)產(chǎn)生針對CCR5的抗體。以CCR5為靶標(biāo)的多肽疫苗抗原的設(shè)計和多肽疫苗的研究雖然起步較晚，但發(fā)展比較迅速，效果也比較顯著，已成為HIV疫苗的研究新的方向。
以HIV輔助受體CCR5為靶標(biāo)的抗HIV藥物取得了很大的進展，受體拮抗劑，RNAi技術(shù)，核酸疫苗等應(yīng)用開辟了阻斷HIV感染的新的途徑，但有研究表明強拮抗劑的應(yīng)用會加劇HIV R5病毒株向R4病毒株轉(zhuǎn)化。RNAi技術(shù)對整個生物體的影響仍不明確，RNAi的安全性等仍待有進一步研究。核酸疫苗等基因疫苗的長期效果和安全性有待證實。以CCR5為靶點的自體疫苗的研究由于其較高的安全性，動物實驗顯示預(yù)防和治療效果比較明顯，相信隨著研究的進一步深入，以CCR5為靶標(biāo)的自體疫苗將有一個非常好的應(yīng)用前景。
2自體疫苗的研究進展用預(yù)防性疫苗誘導(dǎo)抗體以治療感染性疾病是人類歷史上最有效的治療方法。最近，針對人類自身蛋白的單克隆抗體在治療急、慢性疾病的過程中顯示出了良好的效果。但是，造價的昂貴和使用上的不便限制了單克隆抗體的廣泛應(yīng)用，因此，由被動地接受這種抗體蛋白轉(zhuǎn)向?qū)で筢槍θ祟愖陨淼鞍椎闹鲃用庖咭呙绯蔀榈鞍姿幬锏陌l(fā)展方向，因為后者造價較低，病人容易接受并產(chǎn)生良好的順應(yīng)性。
目前，自體疫苗的研究已成為一個熱點，涉及很多疾病，如慢性病毒感染、過敏、腫瘤、阿爾海默茨病、糖尿病、高血壓、肥胖癥以及風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等。
絕大多數(shù)的預(yù)防性疫苗都是通過誘導(dǎo)抗體的產(chǎn)生來保護機體的，這就證明通過誘導(dǎo)抗體來治療感染性疾病是一種有效的治療方法。與預(yù)防性疫苗相比，自體疫苗的發(fā)展就要緩慢的多，直到近幾年自體疫苗才看到成功的希望。但是，單克隆抗體在治療疾病方面所取得的巨大成功預(yù)示著能夠在體內(nèi)誘導(dǎo)自身抗體產(chǎn)生的疫苗有著廣闊的發(fā)展前景。實際上，已經(jīng)有動物試驗表明誘導(dǎo)出一定水平的內(nèi)源性特異性抗體來治療疾病是可能的，如阻斷TNF-α以治療炎癥性疾病就是一個很好的例子。
人源化的抗TNF-α單克隆抗體已經(jīng)被證明在治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和Crohn’s病方面十分有效。目前已經(jīng)有幾種TNF-α的阻斷劑上市，包括兩種單克隆抗體(infliximab，adalimumab)和一種受體阻斷劑etanercept，它們正在幫助成千上萬的病人減輕痛苦，而且年收入達到20億美元。所以阻斷過量表達的TNF-a能夠達到治療疾病的效果。在動物試驗中已經(jīng)證實通過主動免疫可以特異性誘導(dǎo)出TNF-α的中和性抗體，而且誘導(dǎo)的抗體滴度足以治療動物關(guān)節(jié)炎模型。
其他的動物試驗表明可以通過誘導(dǎo)體內(nèi)產(chǎn)生高滴度抗體來治療以下疾病針對血管緊張素的疫苗可以治療高血壓；針對IL-9的疫苗可以治療病原體引起的嗜酸性細胞增多癥，針對IL-5的疫苗可以治療哮喘；針對N-methyl-D-aspartate receptor-1(NMDAR1)的疫苗可以治療中風(fēng)。另外，針對一些性激素如人絨毛膜促性腺激素(human chorionicgonadotro-pin HCG)的免疫可以降低婦女體內(nèi)的激素水平而達到避孕效果；針對促性腺素釋放激素(GnRH)的疫苗可以治療晚期前列腺病人。在晚期胰腺癌病人中，利用自體疫苗誘導(dǎo)出針對胃泌素(gastrin)的抗體可以延長病人的生命。
針對自身蛋白的自體疫苗是如何誘導(dǎo)自身免疫系統(tǒng)產(chǎn)生針對自身蛋白的抗體呢？要產(chǎn)生足夠高的滴度的特異性抗體以治療相關(guān)疾病，自體疫苗必須克服三個障礙T細胞耐受、B細胞耐受、在沒有佐劑和抗原長效制劑的情況下誘導(dǎo)出抗體。眾所周知，人體免疫系統(tǒng)主要是對外來入侵者發(fā)動攻擊的，而對機體本身是不攻擊的，這可能是由于機體具有能夠識別“非我”與“自我”的能力。免疫系統(tǒng)的這種特性通常被稱為耐受或無反應(yīng)性。耐受發(fā)生在B細胞和T細胞水平。一般來說，T細胞耐受更嚴(yán)格一些。對許多抗原來說，在發(fā)生T細胞耐受的同時，正常的B細胞株卻在體內(nèi)存在。實際上，有三種機制導(dǎo)致了免疫耐受細胞株剔除，即特異性的淋巴細胞從淋巴細胞群中被徹底剔除；免疫無能，即特異性的淋巴細胞存在，但其功能不能被激活；免疫忽略，即具有免疫功能的淋巴細胞存在，但是由于沒有遇到以抗原形式存在的自身抗原，所以不能被激活。對T細胞來說，誘導(dǎo)耐受和無能的主要器官是胸腺(中心耐受)，但誘導(dǎo)耐受也可以在外周進行。B細胞耐受主要在骨髓中誘導(dǎo)，但也可在外周誘導(dǎo)。通常，對于普遍表達的豐富抗原的免疫耐受更容易闡明。三個例子可以幫助我們區(qū)分不同那些只在隔離區(qū)表達的抗原，比如大腦中的抗原，不能誘導(dǎo)T、B細胞耐受而是被免疫忽略；相反，在大部分外周細胞豐富表達的膜蛋白(比如I類組織相容性抗原)能有效地誘導(dǎo)B、T細胞的剔除；可溶性抗原是第三個例子，能誘導(dǎo)T細胞的剔除或無能，而卻被B細胞忽略。這就使針對自身可溶性抗原的疫苗的研制成為可能。
在針對外來抗原的免疫反應(yīng)中，T細胞和B細胞互相配合才能有效地產(chǎn)生抗體當(dāng)受到外來抗原免疫時，特異性的B細胞結(jié)合抗原，產(chǎn)生起始的激活信號。另外，B細胞內(nèi)吞抗原，在其表面呈現(xiàn)抗原肽和MHC II類分子的復(fù)合物。通常，B細胞不能激活TH細胞。要激活TH細胞，樹突狀細胞是必不可少的，樹突狀細胞攝取抗原，并在其細胞表面呈遞抗原肽和MHC II類分子的復(fù)合物，激活TH細胞。激活后的TH細胞識別B細胞表面呈現(xiàn)的抗原肽和MHC II類分子的復(fù)合物，引起B(yǎng)細胞增殖、抗體的產(chǎn)生以及抗體類別的轉(zhuǎn)換。如果因為免疫耐受而缺乏TH細胞的協(xié)同作用，那么就不會產(chǎn)生抗體。在針對自身蛋白的疫苗的設(shè)計過程中，如果將自身抗原與外源蛋白或多肽載體融合或偶聯(lián)在一起，就有可能繞過TH細胞耐受自身抗原特異性的B細胞就能夠攝取該自身抗原以及與其相連的載體蛋白，并在其表面呈現(xiàn)載體肽與MHC II類分子的復(fù)合物，由于TH細胞對載體蛋白沒有免疫耐受，所以能夠被激活，從而協(xié)同自抗原特異性的B細胞產(chǎn)生針對自身抗原的特異性抗體。
與T細胞耐受相比，B細胞耐受要寬松得多。實際上，在許多情況下，自身特異性B細胞在體內(nèi)以正常的頻率出現(xiàn)，如果受到抗原和TH細胞的共同作用就會被激活。所以對許多可溶性自身蛋白來講，體內(nèi)存在其特異性B細胞株，尤其當(dāng)這種蛋白不是非常富余表達的時候更是這樣。對于這類蛋白或多肽，將其與載體蛋白相連，繞過T細胞耐受，就有可能產(chǎn)生有效的疫苗。實際上，利用這種策略，針對多種自身激素的抗體反應(yīng)已經(jīng)被誘導(dǎo)出來了。
膜結(jié)合蛋白和以多價形式存在的蛋白能誘導(dǎo)B細胞免疫無能，即在通常情況下對抗原刺激無反應(yīng)，有的甚至可以導(dǎo)致特異性B細胞克隆的剔除。雖然不可能刺激被剔除的特異性B細胞克隆，但是通過適當(dāng)?shù)拿庖卟呗?，B細胞免疫無能有可能被打破。高拷貝數(shù)的抗原能有效地和B細胞受體交聯(lián)，提供強烈的激活刺激，從而打破B細胞耐受。有人已經(jīng)證實與病毒樣顆粒(VLPs)偶聯(lián)的多拷貝TNF-α誘導(dǎo)的抗體反應(yīng)比單體TNF-α誘導(dǎo)的要強得多。這說明使抗原能夠被高度識別，從而打破B細胞耐受是可能的。這一方法還有可能解決利用佐劑的問題，因為與VLPs偶聯(lián)的抗原在沒有佐劑的情況下可以誘導(dǎo)出強的抗體反應(yīng)。與VLPs偶聯(lián)的抗原不僅在小鼠體內(nèi)具有高度的抗原性，而且在人體內(nèi)也具有高度的抗原性。50μg與VLPs偶聯(lián)的多肽或化學(xué)物質(zhì)在沒有佐劑的情況下就可以在人體內(nèi)誘導(dǎo)出較強的抗體反應(yīng)。
目前，有大約500種生物制品藥物正在進行臨床研究，其中有近100種疫苗，主要是針對腫瘤和感染性疾病的。目前，有許多針對自身抗原的自體疫苗臨床前試驗進展順利，有理由相信會有更多的自體疫苗進入人們的研究范圍。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，構(gòu)建能夠在體內(nèi)誘導(dǎo)出針對CCR5特異性抗體的CCR5自體多肽疫苗及其制備方法，為研制新型的HIV疫苗以預(yù)防艾滋病提供新的思路和途徑。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是構(gòu)建一種CCR5自體多肽疫苗，其特征在于，制得的該疫苗含有模擬CCR5胞外段結(jié)構(gòu)的rCCR5氨基酸片段和一個為增強疫苗免疫原性的T細胞輔助表位PADRE，所述的模擬CCR5胞外段結(jié)構(gòu)片段(rCCR5)的氨基酸序列如下Met Asp Tyr Gln Val Ser Ser Pro Ile Tyr Asp Ile Asn Tyr Tyr Thr Ser Glu Pro Cys Gln LysIle Asn Val Lys Gln Ile Ala Ala Arg Gly Gly Gly Gly Ser Tyr Ala Ala Ala Gln Trp Asp Phe GlyAsn Thr Met Cys Gln Gly Gly Gly Gly Ser Arg Ser Gln Lys Glu Gly Leu His Tyr Thr Cys SerSer His Phe Pro Tyr Ser Gln Tyr Gln Phe Trp Lys Asn Phe Gln Thr Leu Lys Gly Gly Gly GlySer Asn Thr Phe Gln Glu Phe Phe Gly Leu Asn Asn Cys Ser Ser Ser Asn Arg Leu Asp Gln AlaMet。
T細胞輔助表位PADRE的氨基酸序列如下
Ala Lys Phe Val Ala Ala Try Thr Leu Lys Ala Ala Ala該疫苗能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生高滴度的CCR5特異性的抗體，應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測免疫抗血清對表達CCR5細胞株U937結(jié)果顯示，平均結(jié)合率達到75.8％上述CCR5自體多肽疫苗的制備方法，其特征在于，根據(jù)CCR5的結(jié)構(gòu)應(yīng)用linker(氨基酸序列為GGGGS)將CCR5胞外段四個片段連接起來，模擬CCR5胞外段結(jié)構(gòu)，將其稱為rCCR5，同時在rCCR5的N端插入T細胞輔助表位PADRE，應(yīng)用人工合成的方法獲得了PADRE-rCCR5的基因，目的基因克隆入pBV-220原核表達載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，在大腸桿菌中高效表達，經(jīng)包涵體洗滌，凝膠柱層析，透析復(fù)性和純化，即可獲得純化的目的蛋白PADRE-rCCR5，該疫苗能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生高滴度的CCR5特異性的抗體，應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測免疫抗血清對表達CCR5的細胞株U937的結(jié)合，其結(jié)果顯示平均結(jié)合率達到75.8％以上。
制備的具體內(nèi)容是1合成rCCR5基因序列分析Swiss-Pro蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫CCR5的結(jié)構(gòu)，結(jié)合文獻，截取CCR5胞外4個片斷N-TERM ECL1，ECL2，ECL3氨基酸序列，應(yīng)用柔性linker分別串聯(lián)，獲得模擬CCR5胞外片段的氨基酸序列(命名為rCCR5)，其氨基酸序列為MDYQVSSPIYDINYYTSEPCQKINVKQIAARGGGGSYAAAQWDFGNTMCQGGGGSRSQKEGLHYTCSSHFPYSQYQFWKNFQTLKGGGGSNTFQEFFGLNNCSSSNRLDQAM。
按照Gene-bank公布的人CCR5的基因序列，5端插入BamHI酶切位點，3端引進終止密碼子TGA并插入PstI酶切位點，依據(jù)大腸桿菌偏愛的密碼子，合成目的基因。合成的基因序列如下BamHIGATCCGACTACCAGGTTTCTTCTCCGATTTACGACATCAACTACTACACTTCTGAACCGTGCCAGAAGATCAACGTTAAGCAGATCGCAGCTGGACCAAGCTATGGGCGGTGGTGTAACACTATGTGCCAAGGCGGCGGTGGTTCTCGTTCTCAGAAAGAAGGTCTGCACTACACCTGCTCTTCTCACTTTCCGTACTCTCAGTACCAATTCTGGAAGAACTTCCAGACTCTGAAGGGTGGCGGTGGCAGCAACACCTTCCAGGAATTTTTTGGCCTGAACAACTGCTCTTCTTCTAACCGTCCCGCGGTGGCGGCGGTTCTTACGCTGCTGCACAGTGGGACTTTGTGACPstI
同時合成T細胞輔助表位PADRE的基因序列并在兩端引入EcoRI和BamHI酶切位點，在5’端引入起始密碼子ATG。合成的序列如下EcoR ICGAATTCATGGCTAAATTCGTTGCTGCTTGGACTCTGAAAGCTGCTGCTGGATCCGBamHI2構(gòu)建重組質(zhì)粒pBV-220/PADRE-rCCR5以EcoRI和BamHI兩個酶切位點對合成的PADRE基因片斷和原核表達質(zhì)粒pBV-220分別進行酶切，2.0％瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物，分別回收酶切后的PADRE基因片斷和原核表達質(zhì)粒的大片斷，回收后用T4連接酶在16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，鋪板、培養(yǎng)，挑取單克隆，進行酶切鑒定。得到含有PADRE基因片斷的陽性克隆，稱為pBV-220/PADRE。而后提取該陽性克隆所含有的質(zhì)粒，用BamHI和PstI雙酶切，回收大片段。與合成的rCCR5基因片斷共同建立連接體系，16℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α細胞，提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定和DNA測序，獲得含有PADRE和rCCR5融合基因原核克隆載體，命名pBV-220/PADRE-rCCR5。
3重組蛋白的誘導(dǎo)表達、純化與鑒定3.1 pBV-220/PADRE-rCCR5/DH5α工程菌的誘導(dǎo)表達含重組表達質(zhì)粒的大腸桿菌DH5α單菌落接種于5ml新鮮LB培養(yǎng)液(含氨芐青霉素100mg/L)中，搖床30℃2培養(yǎng)過夜，次日以1∶100的比例接種于新鮮LB培養(yǎng)液(含氨芐青霉素100mg/L)中，30℃繼續(xù)培養(yǎng)至細菌密度達到OD600＝0.4～0.6，迅速升溫至42℃，誘導(dǎo)表達后分別1h，2h，3h，4h，5h，6h收集菌體，以確定合適的誘導(dǎo)后時間，小規(guī)模培養(yǎng)及誘導(dǎo)后離心收集菌體，用SDS-PAGE檢測目的蛋白的表達和存在形式。
3.2 pBV-220/PADRE-rCCR5/DH5α工程菌的發(fā)酵從活化的LB平板上挑選單菌落接種于含LB的試管中，30℃培養(yǎng)10h，然后轉(zhuǎn)種至含200ml LB的三角瓶中，30℃培養(yǎng)過夜。次日，將種子液接種于5L發(fā)酵罐?？刂瓢l(fā)酵溫度30℃、轉(zhuǎn)速250～450rpm/min、通氣量3～5L/min、pH7.3。培養(yǎng)至OD600＝8左右時，迅速升溫至42℃進行誘導(dǎo)，繼續(xù)培養(yǎng)4h，終止發(fā)酵，收集菌體、稱重，-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。取少量菌體處理后，用SDS-PAGE檢測目的蛋白的表達。
3.3 目的蛋白包涵體的分離和洗滌取10g發(fā)酵菌體，按1g濕重對7ml的比例，用裂解緩沖液STE(50mmol/L Tris.ClpH8.0，50mmol/L NaCI，1mmol/L EDTA)重懸，-20℃凍過夜。次日于室溫水浴中融化，參照分子克隆第三版溶菌酶法裂菌，接著再采用400W超聲破菌，其中超聲5s，間隔10s，共進行100次。超聲完成后，12000rpm/min，4℃離心20min，棄除上清，沉淀用包涵體洗滌液A(1％TritonX-100，1mmol/L EDTA，1％DOC，50mmol/LTris.ClpH8.5，100mmol/L NaCl)重懸，12000r/min，4℃離心20min，棄上清。接著再用包涵體洗滌液B(50mmol/L Tris.ClpH8.5，2.5mol/L尿素，100mmol/L NaCl，5mmol/L β-巰基乙醇，1mmol/L EDTA)重復(fù)洗滌3次，直至離心后的上清液澄清為止。最后用包涵體洗滌液C(50mmol/L Tris.ClpH8.5，1mmol/L EDTA)洗滌一次后離心，離心條件不變。
3.4 表達產(chǎn)物變性條件下的純化經(jīng)洗滌的包涵體以1g濕重對10ml的比例，溶于50mmol/L Tris.ClpH8.5，5mmol/L β-巰基乙醇，1mmol/L EDTA，8mol/L尿素的緩沖液中，4℃攪拌過夜，12000r/min離心30min，收集上清，即為目的蛋白粗提液。SephacrylS-300(1.6cm×80cm)凝膠層析，以工作液(8mol/L尿素，50mmol/L Tris.Cl pH8.5，1mmol/L EDTA，100mmol/L NaCl)充分平衡后，目的蛋白粗提液2ml上柱，以工作液洗脫，流速1ml/min，分部收集，測定蛋白質(zhì)含量，并以SDS-PAGE確定目的蛋白所在位置，收集純度較高的洗脫組分。
3.5目的蛋白的復(fù)性應(yīng)用包涵體溶解液稀釋SephacrylS-300凝膠柱層析后樣品，使蛋白濃度約為0.1mg/ml，梯度透析，透析外液加入CuSO4和β-巰基乙醇作為氧化還原系統(tǒng)，4℃透析，每6小時換液一次，梯度為，4M尿素，2M尿素，1M尿素，最后透析到雙蒸水，離心留上清，凍干。凝膠層析柱上復(fù)性SephacrylS-100凝膠柱(1.6cm×60cm)，以工作液(50mmol/L Tris.Cl pH8.5，1mmol/L EDTA，100mmol/L NaCl)充分平衡后，取SephacrylS-300凝膠層析目的蛋白樣品，用凝膠柱工作液調(diào)整蛋白樣品濃度為20mg/ml，用蛋白復(fù)性液(50mmol/L Tris.Cl，1mmol/L EDTA，100mmol/L NaCl，1.25mmol/L GSH，and0.25mmol/L GSSG，pH8.5)洗脫，流速0.5ml/min，分部收集，測定蛋白質(zhì)含量，并以SDS-PAGE確定目的蛋白所在位置，收集純度較高的洗脫組分，目的蛋白洗脫峰直接對水透析，4℃，24小時，其中換液3次。透析后樣品12000rpm/min，4℃離心30min，凍干上清，收集樣品。HPLC檢測蛋白純度。
本發(fā)明的CCR5自體疫苗抗原免疫動物顯示，可以在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)出針對該蛋白的抗血清，且免疫抗血清具有結(jié)合表達CCR5細胞的能力，為下一步抗血清阻斷HIV感染細胞試驗奠定了基礎(chǔ)。


圖1是重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建。為了獲得目的蛋白PADRE-rCCR5，首先構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pBV220/PADRE-rCCR5，構(gòu)建的質(zhì)粒示意圖如圖A，重組質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoRI和PstI酶切鑒定，得到相應(yīng)的片斷與預(yù)期大小相一致圖B。質(zhì)粒送交上海華諾公司測序，質(zhì)粒測序結(jié)果完全正確。
圖2是蛋白質(zhì)的表達純化與鑒定。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，經(jīng)誘導(dǎo)表達，穩(wěn)定篩選，構(gòu)建工程菌。經(jīng)發(fā)酵后，收集大量菌體，裂菌顯示目的蛋白以包涵體形式存在，經(jīng)對包涵體洗滌，SephacrylS-300凝膠柱層析(圖A)，SDS-PAGE顯示蛋白單一條帶(圖B)，SephacrylS-100凝膠層析復(fù)性，獲得純化的目的蛋白(圖C)，HPLC純度鑒定蛋白純度達到95％以上(圖D)，Western-blot鑒定顯示能與CCR5單克隆抗體特異性結(jié)合(圖E)。
圖3是以ELISA檢測免疫小鼠血清抗體滴度。在實驗的過程中由于沒有商品化的CCR5作為標(biāo)準(zhǔn)抗原來進行免疫抗血清抗體滴度的檢測，在實驗的過程中，表達和純化了CCR5胞外段蛋白rCCR5在檢測大腸桿菌殘存蛋白的基礎(chǔ)上，進行抗體滴度的檢測。在構(gòu)建CCR5自體多肽疫苗PADRE-rCCR5的同時，還構(gòu)建了其它三種CCR5自體多肽疫苗候選抗原作為比較，經(jīng)免疫動物，抗血清抗體滴度檢測顯示，PADER-rCCR5免疫抗血清抗體滴度最高(圖A)，應(yīng)用CCR5單克隆抗體最為陽性對照抗體滴度達到1∶100000以上(圖B)。
圖4是應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測免疫抗血清結(jié)合細胞試驗。應(yīng)用CCR5單克隆抗體篩選出表達CCR5細胞株U937和不表達CCR5的Wish細胞株。經(jīng)對抗血清的流式細胞術(shù)檢測，發(fā)現(xiàn)免疫抗血清與表達CCR5的U937結(jié)合率達到75％以上。
以下結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步的詳細描述。
具體實施例方式
1 CCR5自體多肽疫苗PADRE-rCCR5的構(gòu)建，表達及純化1.1 rCCR5基因的構(gòu)建分析Swiss-Pro蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫CCR5的結(jié)構(gòu)，結(jié)合文獻，截取CCR5胞外4個片斷N-TERM ECL1，ECL2，ECL3氨基酸序列，應(yīng)用柔性linker分別串聯(lián)，獲得模擬CCR5胞外片段的氨基酸序列(命名為rCCR5)，截取受體CCR5膜外四個氨基酸片段及Linker序列如下


1.1.1 rCCR5基因的合成按照Gene-bank公布的人CCR5的基因序列，5端插入EcoRI酶切位點，3端引進中止密碼子TGA并插入BamHI酶切位點，依據(jù)大腸桿菌偏愛的密碼子，送交上海生工生物技術(shù)公司合成目的基因。合成的基因序列如下，目的基因被克隆入pUC57載體(上海生工生物技術(shù)公司合成并提供)。
1.1.2 感受態(tài)細胞的制備取DH5α甘油菌種按1∶100的比例接種入的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，次日轉(zhuǎn)接一次，繼續(xù)培養(yǎng)至OD600約0.4左右。(無菌操作)將菌液冰浴10min，離心(3000rpm×5min，4℃)后棄去上清，加入1/2體積預(yù)冷的100mmol/L CaCl2，輕輕吹起沉淀，冰浴40min，離心(3000rpm×5min，4℃)，棄上清后加入1/25體積的含25％甘油的100mmol/L CaCl2，吹起沉淀，分裝入Eppendorf管中，-70℃保存?zhèn)溆谩?br> 1.1.3 感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)將大腸桿菌感受態(tài)細胞從-70℃中取出，冰浴融解5-10分鐘，加入含有目的基因的pUC57，輕微混勻，繼續(xù)冰浴30分鐘，然后鋪板，37℃培養(yǎng)過夜。
1.1.4 質(zhì)粒的提取與鑒定在質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后37℃過夜培養(yǎng)的培養(yǎng)皿上挑取邊緣整齊，生長狀態(tài)良好的克隆，接種到10ml含Amp的LB培養(yǎng)基中，37℃、200rpm培養(yǎng)8小時，用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，用EcoRI和BamHI雙酶切后，行瓊脂糖凝膠電泳觀察是否有插入片斷以及插入的片斷是否與預(yù)期的長度一致，將酶切鑒定陽性的克隆送上海博亞公司進行DNA測序。
1.2 pBV-220/PADRE-rCCR5/DH5a工程菌的構(gòu)建、表達及目的蛋白的純化鑒定1.2.1 PCR擴增為了將rCCR5基因克隆入表達載體pBV-220/PADRE中，需要將兩端的酶切位點突變成BamHI和PstI，設(shè)計PCR引物如下Primer15’GCGGATCCATGGACTACCAGGTTTCTTCTCC3’Primer25’GCCTGCAGTCACATAGCTTGGTCCAGAC3’PCR擴增rCCR5基因取1μL含有目的基因的克隆質(zhì)粒pUC-57為模板，加入10×PCR緩沖液5μL，25mmol/L MgCl23μL。25mmol/L 4×dNTPs 4μL，25μmol/L的引物1、2各0.5μL，加入TaqDNA聚合酶0.5μL，用水補足體積至50μL。95℃預(yù)變性5min后，按下列參數(shù)循環(huán)30次94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，最后一個循環(huán)72℃延伸10min。
1.2.2 pGEM-3zf/PADRE-rCCR5克隆載體的構(gòu)建PCR產(chǎn)物用2.0％瓊脂糖凝膠電泳分離，回收。回收后PCR產(chǎn)物與T載體用T4連接酶在16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，鋪板、培養(yǎng)，挑取單克隆，進行酶切鑒定?；厥彰盖械哪康钠瑪啵瑫r用BamHI和PstI雙酶切pGEM-3zf(-)/PADRE，回收大片段。建立連接體系，16℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α細胞，提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定和DNA測序，獲得含有PADRE-rCCR5融合基因原核克隆載體，命名pGEM-3zf/PADRE-rCCR5。
1.2.3 pBV-220/PADRE-rCCR5/DH5α工程菌的構(gòu)建上述pGEM-3zf/PADRE-rCCR5經(jīng)EcoRI和PstI雙酶切，回收大約400bP左右的小片斷和用EcoRI和PstI酶處理過的pBV220質(zhì)粒連接，16℃過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α細胞，提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定和DNA測序獲得含有PADRE-rCCR5融合基因原核表達載體，命名pBV220/PADRE-rCCR5。
1.2.4 pBV-220/PADRE-rCCR5/DH5α工程菌的誘導(dǎo)表達含重組表達質(zhì)粒的大腸桿菌DH5α單菌落接種于5ml新鮮LB培養(yǎng)液(含氨芐青霉素100mg/L)中，搖床30℃培養(yǎng)過夜，次日以1∶100的比例接種于新鮮LB培養(yǎng)液(含氨芐青霉素100mg/L)中，30℃繼續(xù)培養(yǎng)至細菌密度達到OD600＝0.4～0.6，迅速升溫至42℃，誘導(dǎo)表達后分別1h，2h，3h，4h，5h，6h收集菌體，以確定合適的誘導(dǎo)后時間，小規(guī)模培養(yǎng)及誘導(dǎo)后離心收集菌體，用SDS-PAGE檢測目的蛋白的表達和存在形式。
1.2.5 pBV-220/PADRE-rCCR5/DH5α工程菌的發(fā)酵從活化的LB平板上挑選單菌落接種于含LB的試管中，30℃培養(yǎng)10h，然后轉(zhuǎn)種至含200ml LB的三角瓶中，30℃培養(yǎng)過夜。次日，將種子液接種于5L發(fā)酵罐。控制發(fā)酵溫度30℃、轉(zhuǎn)速250～450rpm/min、通氣量3～5L/min、pH7.3。培養(yǎng)至OD600＝8左右時，迅速升溫至42℃進行誘導(dǎo)，繼續(xù)培養(yǎng)4h，終止發(fā)酵，收集菌體、稱重、-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｈ∩倭烤w處理后，用SDS-PAGE檢測目的蛋白的表達。
1.2.6 目的蛋白包涵體的分離和洗滌取10g發(fā)酵菌體，按1g濕重對7ml的比例，用裂解緩沖液STE(50mmol/L Tris.Cl pH8.0，50mmol/L NaCI，1mmol/L EDTA)重懸，-20℃凍過夜。次日子室溫水浴中融化，參照分子克隆第三版溶菌酶法裂菌，接著再采用400W超聲破菌，其中超聲5s，間隔10s，共進行100次。超聲完成后，12000rpm/min，4℃離心20min，棄除上清，沉淀用包涵體洗滌液A(1％TritonX-100，lmmol/L EDTA，1％DOC，50mmol/LTris.Cl pH8.5，100mmol/LNaCl)重懸，12000r/min，4℃離心20min，棄上清。接著再用包涵體洗滌液B(50mmol/LTris.Cl pH8.5，2.5mol/L尿素，100mmol/L NaCl，5mmol/L β-巰基乙醇，1mmol/L EDTA)重復(fù)洗滌3次，直至離心后的上清液澄清為止。最后用包涵體洗滌液C(50mmol/L Tris.ClpH8.5，lmmol/L EDTA)洗滌一次后離心，離心條件不變。
1.2.7 表達產(chǎn)物變性條件下的純化經(jīng)洗滌的包涵體以1g濕重對10ml的比例，溶于50mmol/L Tris.Cl pH8.5，5mmol/L β-巰基乙醇，1mmol/L EDTA，8mol/L尿素的緩沖液中，4℃攪拌過夜，12000r/min離心30min，收集上清，即為目的蛋白粗提液。SephacrylS-300(1.6cm×80cm)凝膠層析，以工作液(8mol/L尿素，50mmol/L Tris.Cl pH8.5，1mmol/L EDTA，100mmol/L NaCl)充分平衡后，目的蛋白粗提液2ml上柱，以工作液洗脫，流速1ml/min，分部收集，測定蛋白質(zhì)含量，并以SDS-PAGE確定目的蛋白所在位置，收集純度較高的洗脫組分。
1.2.8 目的蛋白的復(fù)性凝膠層析柱上復(fù)性SephacrylS-100凝膠柱(1.6cm×60cm)，以工作液(50mmol/LTris.Cl pH8.5，1mmol/L EDTA，100mmol/L NaCl)充分平衡后，取SephacrylS-300凝膠層析目的蛋白樣品，用凝膠柱工作液調(diào)整蛋白樣品濃度為20mg/ml，用蛋白復(fù)性液(50mmol/L Tris.Cl，1mmol/L EDTA，100mmol/L NaCl，1.25mmol/L GSH，and 0.25mmol/LGSSG，pH8.5)洗脫，流速0.5ml/min，分部收集，測定蛋白質(zhì)含量，并以SDS-PAGE確定目的蛋白所在位置，收集純度較高的洗脫組分，目的蛋白洗脫峰直接對水透析，4℃，24小時，其中換液3次。透析后樣品12000rpm/min，4℃離心30min，凍干上清，收集樣品。HPLC檢測蛋白純度。
1.2.9 目的蛋白的鑒定SDS-PAGE結(jié)束后，拆下凝膠，按照Bio-Rad產(chǎn)品說明，將凝膠靠近陰極一側(cè)、硝酸纖維(NC)膜靠近陽極一側(cè)，在預(yù)冷的轉(zhuǎn)移緩沖液(25mmol/L Tris，192mmol/L Glycine，20％甲醇)中100V恒壓1小時電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上。電泳結(jié)束后，取出NC膜，洗滌液TBST(20mmol/L Tris.HCl pH7.5，150mmol/LNaCl，0.05％Tween20)清洗后浸入封閉液(含2％BSA的TBST)中37℃1小時，用小鼠抗人CCR5單克隆抗體(1∶1000稀釋)孵育膜，室溫，3小時，TBST洗膜3次，每次10min，再以HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG抗體(1∶1000稀釋)孵育膜，室溫，3h，TBST洗膜3次，用DAB顯色液顯色5-10min，觀察結(jié)果。
2. 動物免疫及免疫抗血清生物學(xué)活性檢測2.1 小鼠免疫方法將30只BALB/c小鼠分成5組，每組6只，分別為陰性對照組、PADRE-rCCR5組、和其它三組對照rCCR5組、GST-C1組、GST-C2組。所有蛋白都溶解于生理鹽水中，背部皮下多點注射，劑量為20μg/只，第一次免疫后每兩周進行一次加強免疫，一共兩次加強免疫。第一次免疫用弗氏完全佐劑，后兩次加強免疫用弗氏不完全佐劑，佐劑與抗原1∶1充分混合。最后一次免疫后一周進行摘眼球取血，收集血清。
2.2 大腸桿菌菌體蛋白殘留量測定因為沒有商品化的CCR5標(biāo)準(zhǔn)品作為包被抗原來進行抗血清滴度的檢測，所以我們采用在檢測大腸桿菌菌體蛋白殘留量的基礎(chǔ)上，以純化的rCCR5作為包被抗原進行檢測。檢測大腸桿菌菌體蛋白殘留量采用夾心ELISA法，具體步驟如下用包被液稀釋兔抗大腸桿菌菌體蛋白抗體至10ug/ml，以100μl/孔加至96孔酶標(biāo)板中，4℃過夜(16-18h)；次日清晨，洗板后每孔加入200ul的1％牛血清白蛋白，37℃2h；用稀釋液稀釋菌體蛋白標(biāo)準(zhǔn)品至下列濃度梯度500ng/ml、250ng/ml、125ng/ml、62.5ng/ml、31.25ng/ml、15.625ng/ml、7.8125ng/ml；同時用稀釋液稀釋待測樣品至250ug/ml左右。將封閉好的酶標(biāo)板洗板3次，標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品均以100μl/孔加至板內(nèi)，37℃2h；用稀釋液按1∶1000稀釋HRP標(biāo)記的兔抗大腸桿菌菌體蛋白抗體，以100μl/孔加至板內(nèi)，37℃1h；以100μl孔加入臨時配制的底物液，37℃40min；再以50μl/孔加入終止液終止反應(yīng)；最后將酶標(biāo)板放入酶標(biāo)儀中，選擇490nm波長測OD值。以標(biāo)準(zhǔn)品OD值對標(biāo)準(zhǔn)品濃度作曲線，并以待測樣品OD值在曲線上讀出相應(yīng)菌體蛋白含量，按以下公式計算待測樣品中菌體蛋白殘留含量。
2.3 ELISA法測定血清抗體滴度所需溶液的配制包被緩沖液碳酸鹽緩沖液Na2CO30.32g(終濃度0.015mol/L)NaHCO30.59g(終濃度0.035mol/L)純水定容至200ml(pH9.6) 有效期兩周洗滌液含0.05％Tween-20的PBS(pH7.4)封閉液含1％BSA的洗滌液稀釋液含0.5％BSA的洗滌液底物緩沖液Na2HPO4.12H2O 1.84g檸檬酸 0.51g純水定容至100ml(pH5.0)底物顯色液OPD8mg30％H2O230μl底物緩沖液 10ml終止液H2SO41mol/L操作方法包被取96孔ELISA板，將抗原溶解于包被緩沖液中(2-5μg/ml)，加入板孔中(100μl/孔)，4℃包被過夜。
↓倒掉包被液，加入封閉液，37℃封閉2小時；↓棄去封閉液，用洗滌液洗6次，每次2分鐘；↓加入10倍倍比稀釋的抗血清(從100倍起)，100μl/孔，37℃孵小時；↓棄去抗血清，用洗滌液洗6次，每次2分鐘；↓加入HRP標(biāo)記的抗小鼠的二抗，100μl/孔，37℃孵育1小時；↓棄去二抗，用洗滌液洗6次，每次2分鐘；↓加入底物顯色液，100μl/孔，37℃，顯色10-20分鐘；↓加入終止液，100μl/孔，終止反應(yīng)；↓酶標(biāo)儀讀數(shù)，測定每孔在490nm的吸光值。
2.4 流式細胞儀分析樣品制備將凍存的U937和Wish細胞復(fù)蘇，孵箱培養(yǎng)后，1000rpm離心收集細胞，1640培養(yǎng)液洗滌2次后，重懸細胞為5×106～1×107/mL。
取40μL細胞懸液加入預(yù)先有工作濃度特異性CCR5mAb(5-50μL)小玻璃管中，用50μL 1∶20(用DPBS稀釋)正常兔血清，4℃封閉30分鐘。
用洗滌液洗滌2次，每次加入2 mL(1000rpm×5min)。
棄上清，加入50μL工作濃度的羊抗小鼠FITC熒光標(biāo)記物，4℃30分鐘。
洗滌液洗滌2次，棄上清，加入適量的固定液，進行FCM分析。
試劑配制如下DPBS(10×，貯存液)NaCl 80gKCl2gNa2HPO411.5gKH2PO4 2g蒸餾水加至1000mL，臨用前稀釋；洗滌液DPBS×1900mLFCS50mL4％NaN350mL；固定液DPBS×11000mLGlucose20gFormaldehyde 10mLNaN30.2g。
權(quán)利要求
1.一種CCR5自體多肽疫苗，其特征在于，制得的該疫苗含有模擬CCR5胞外段結(jié)構(gòu)的rCCR5氨基酸片段和一個為增強疫苗免疫原性的T細胞輔助表位PADRE，所述的CCR5自體多肽疫苗即PADRE-rCCR5的氨基酸序列如下Met Ala Lys Phe Val Ala Ala Try Thr Leu Lys Ala Ala Ala Gly Ser Asp Tyr Gln Val Ser Ser Pro Ile Tyr AspIle Asn Tyr Tyr Thr Ser Glu Pro Cys Gln Lys Ile Asn Val Lys Gln Ile Ala Ala Arg Gly Gly Gly Gly Ser TyrAla Ala Ala Gln Trp Asp Phe Gly Asn Thr Met Cys Gln Gly Gly Gly Gly Ser Arg Ser Gln Lys Glu Gly LeuHis Tyr Thr Cys Ser Ser His Phe Pro Tyr Ser Gln Tyr Gln Phe Trp Lys Asn Phe Gln Thr Leu Lys Gly GlyGly Gly Ser Asn Thr Phe Gln Glu Phe Phe Gly Leu Asn Asn Cys Ser Ser Ser Asn Arg Leu Asp Gln Ala MetT細胞輔助表位PADRE的氨基酸序列如下AlaLysPheValAlaAlaTryThrLeuLysAlaAlaAla。
2.權(quán)利要求1所述的CCR5自體多肽疫苗的制備方法，其特征在于，根據(jù)大腸桿菌偏愛密碼子應(yīng)用人工合成的方法獲得該自體疫苗的基因，基因編碼CCR5胞外的四個結(jié)構(gòu)域，并且彼此應(yīng)用氨基酸序列為GGGGS的linker連接，同時在rCCR5的5’端插入T細胞輔助表位PADRE的基因序列，目的基因克隆入pBV-220原核表達載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，在大腸桿菌中高效表達，經(jīng)包涵體洗滌，凝膠柱層析，透析復(fù)性和純化，即可獲得目的蛋白PADRE-rCCR5，該疫苗能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生高滴度的CCR5特異性的抗體，應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測免疫抗血清對表達CCR5的細胞株U937的結(jié)合，其結(jié)果顯示平均結(jié)合率達到75.8％以上。
3.如權(quán)利要求2所述的CCR5自體多肽疫苗的制備方法，其特征在于，具體按照以下步驟完成1)pBV-220/PADRE-rCCR5/DH5a工程菌的誘導(dǎo)表達含重組表達質(zhì)粒pBV-220/PADRE-rCCR5的大腸桿菌DH5a單菌落接種于5ml新鮮LB培養(yǎng)液中，其中含氨芐青霉素100mg/L，搖床30℃培養(yǎng)過夜，次日以1∶100的比例接種于新鮮LB培養(yǎng)液中，30℃繼續(xù)培養(yǎng)至細菌密度達到OD600＝0.4～0.6，迅速升溫至42℃，誘導(dǎo)表達后分別1h，2h，3h，4h，5h，6h收集菌體，以確定合適的誘導(dǎo)后時間，小規(guī)模培養(yǎng)及誘導(dǎo)后離心收集菌體，用SDS-PAGE檢測目的蛋白的表達和存在形式；2)pBV-220/PADRE-rCCR5/DH5α工程菌的發(fā)酵從活化的LB平板上挑選單菌落接種于含LB的試管中，30℃培養(yǎng)10h，然后轉(zhuǎn)種至含200ml LB的三角瓶中，30℃培養(yǎng)過夜，次日，將種子液接種于5L發(fā)酵罐，控制發(fā)酵溫度30℃、轉(zhuǎn)速250～450rpm/min、通氣量3～5L/min、pH7.3，培養(yǎng)至OD600＝8左右時，迅速升溫至42℃進行誘導(dǎo)，繼續(xù)培養(yǎng)4h，終止發(fā)酵，收集菌體、稱重、-20℃冰箱保存?zhèn)溆?，取少量菌體處理后，用SDS-PAGE檢測目的蛋白的表達；3)目的蛋白包涵體的分離和洗滌取10g發(fā)酵菌體，按1g濕重對7ml的比例，用裂解緩沖液STE重懸，解緩沖液STE配方為50mmol/L Tris.Cl pH 8.0，50mmol/L NaCl，1mmol/L EDTA，-20℃凍過夜，次日于室溫水浴中融化，參照分子克隆第三版溶菌酶法裂菌，接著再采用400W超聲破菌，其中超聲5s，間隔10s，共進行100次；超聲完成后，12000rpm/min，4℃，離心20min，棄除上清，沉淀用包涵體洗滌液A重懸，包涵體洗滌液A為1％TritonX-100，1mmol/L EDTA，1％DOC，50mmol/LTris.ClpH8.5，100mmol/L NaCl，12000r/min 4℃、離心20min，棄上清，接著再用包涵體洗滌液B重復(fù)洗滌3次，包涵體洗滌液B為50mmol/L Tris.Cl pH 8.5，2.5mol/L尿素，100mmol/LNaCl，5mmol/L β-巰基乙醇，lmmol/L EDTA，直至離心后的上清液澄清為止，最后用包涵體洗滌液C洗滌一次后離心，離心條件不變，包涵體洗滌液的配方為C50mmol/LTris.Cl pH 8.5，1mmol/L EDTA；4)表達產(chǎn)物變性條件下的純化經(jīng)洗滌的包涵體以1g濕重對10ml的比例，溶于50mmol/L Tris.Cl pH 8.5，5mmol/L β-巰基乙醇，1mmol/L EDTA，8mol/L尿素的緩沖液中，4℃攪拌過夜，12000r/min離心30min，收集上清，即為目的蛋白粗提液；凝膠層析柱以工作液充分平衡后，目的蛋白粗提液2ml上柱，以工作液洗脫，工作液為8mol/L尿素，50mmol/L Tris.Cl pH 8.5，1mmol/L EDTA，100mmol/L NaCl，流速1ml/min，分部收集，測定蛋白質(zhì)含量，并以SDS-PAGE確定目的蛋白所在位置，收集純度較高的洗脫組分的目的蛋白樣品；5)目的蛋白的復(fù)性凝膠層析柱以工作液充分平衡后，取洗脫組分目的蛋白樣品，用凝膠柱工作液調(diào)整蛋白樣品濃度為20mg/ml，用配制的蛋白復(fù)性液洗脫，蛋白復(fù)性液為50mmol/L Tris.Cl，1mmol/L EDTA，100mmol/L NaCl，1.25mmol/L GSH，and 0.25mmol/L GSSG，pH 8.5，流速0.5ml/min，分部收集，測定蛋白質(zhì)含量，并以SDS-PAGE確定目的蛋白所在位置，收集純度較高的洗脫組分，目的蛋白洗脫峰直接對水透析，4℃，24小時，其中換液3次，透析后樣品12000rpm/min 4℃離心30min，凍干上清，收集樣品，HPLC檢測蛋白純度；6)目的蛋白的鑒定SDS-PAGE結(jié)束后，拆下凝膠，按照Bio-Rad產(chǎn)品說明，將凝膠靠近陰極一側(cè)、硝酸纖維NC膜靠近陽極一側(cè)，在預(yù)冷的轉(zhuǎn)移緩沖液中100V恒壓1小時電泳，轉(zhuǎn)移緩沖液為25mmol/L Tris，192mmol/L Glycine，20％甲醇，將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維NC膜上，電泳結(jié)束后，取出硝酸纖維NC膜，洗滌液TBST清洗后浸入含2％BSA的TBST封閉液中，37℃ 1小時，用1∶1000稀釋的小鼠抗人CCR5單克隆抗體孵育膜，室溫，3小時，TBST洗膜3次，每次10min，再以1∶1000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗小鼠1gG抗體孵育膜，室溫，3h，TBST洗膜3次，用DAB顯色液顯色5-10min，觀察結(jié)果，鑒定結(jié)果表明純化的蛋白為目的蛋白PADRE-rCCR。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種CCR5自體疫苗及其構(gòu)建方法，根據(jù)CCR5的結(jié)構(gòu)應(yīng)用氨基酸序列為GGGGS的linker將CCR5胞外段四個片段連接起來，模擬CCR5胞外段結(jié)構(gòu)，將其稱為rCCR5，同時在rCCR5的N端插入T細胞輔助表位PADRE，應(yīng)用人工合成的方法獲得了PADRE－rCCR5的基因，目的基因克隆入pBV－220原核表達載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，在大腸桿菌中高效表達，經(jīng)包涵體洗滌，凝膠柱層析，透析復(fù)性獲得了純化的目的蛋白，以經(jīng)純化后得到目的蛋白PADRE－rCCR5作為CCR5自體多肽疫苗抗原免疫動物顯示，PADRE－rCCR5能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生高滴度的CCR5特異性的抗體，應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測免疫抗血清對表達CCR5細胞株U937結(jié)果顯示，平均結(jié)合率達到75.8％。表明免疫抗血清對表達CCR5受體的細胞具有一定的結(jié)合能力，為構(gòu)建新型的CCR5自體疫苗和艾滋病疫苗研究奠定了一定的基礎(chǔ)。
文檔編號A61P31/00GK1994465SQ200610104729
公開日2007年7月11日 申請日期2006年10月13日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月13日
發(fā)明者張英起, 吳孔田, 韓葦, 李萌, 薛曉暢, 孟潔如, 包春杰, 郝強, 李維娜, 王增祿 申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)