專利名稱：從催吐蘿芙木和酸橙中分離的抗糖尿病提取物及其使用方法
技術領域：
本發(fā)明屬于藥學領域。具體地，它涉及用于預防和治療疾病的抗糖尿病藥物領域。
背景技術：
胰島素是由胰腺產(chǎn)生的激素，它使得葡萄糖可被人體內(nèi)的細胞利用以獲得能量。糖尿病主要是機體葡萄糖或碳水化合物代謝紊亂。在I型糖尿病中，胰腺幾乎不產(chǎn)生胰島素，或者它根本不產(chǎn)生胰島素。治療需要每天注射胰島素，以使得糖尿病患者能夠存活。在II型糖尿病中，胰腺產(chǎn)生胰島素，但由于細胞抗性，胰島素的數(shù)量不足夠或者不夠有效，或者既不足夠也不有效。在這些形式的每一種中，存在各種異常，但這些異?？赡軐儆诘幕救毕菔?1)進入各種“外周”組織的葡萄糖減少；和(2)從肝釋放到血流中的葡萄糖增加(增加的肝糖生成)。
據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)評估，每100個人中，有2至10個人將在其一生中形成該病癥，且他們中有90％將為II型，遲發(fā)性非胰島素依賴型糖尿病。Nathan(1993)New Eng.J.Med.3281676-1685。在II型糖尿病中，在肝、骨骼肌和脂肪組織中，由胰島素刺激的葡萄糖攝取和利用受到損害。Zimmet(1982)Diabetologia 22399-411。通過限制熱量和鍛煉，能夠改善這些缺陷。在該疾病的后期階段，患者的唯一出路是終生的降血糖治療。
目前對II型糖尿病的改進治療包括給藥磺胺類、雙胍類(Turner和Clapham(1998)Prog.Drug.Res.5133-94)和噻唑烷二酮類。Kohlroser等人(2000)Am.J.Gast.96272-276。目前可用藥物的缺點包括有害的副作用和許多相反的指示(例如不可能在妊娠中和哺乳期應用)，以及它們不能有效地阻止因長期II型糖尿病引起的組織并發(fā)癥。因此，正在開發(fā)新的療法，例如給藥草藥提取物。
例如美國專利公開20030206976公開了來自組合物的草藥提取物，所述組合物包含Centaurii umbellatum、Gentianaceae(矢車菊植物)、Teraxacum officinale、Asteraceae(蒲公英根)、歐洲刺柏(Junipericommunis L)、Cupresaceae(杜松)、Urticae dioica L、Urticeae(蕁麻植物)、Urticae dioica L、蕁麻科(Urticaceae)(蕁麻根)、菊苣(Cichorium intybusL.)、Cichoriaceae(菊苣根)、黑桑(Morus nigra L)、?？?Moraceae)(桑葉)、歐蓍草(Achilleae millefolium L)、Asteraceae(西洋蓍草花)、歐洲越桔(Vaccinium myrtillus L)、杜鵑花科(Ericaceae)(越桔葉)、Phaseolusvulgaris L、Fabaceae(豆莢)、Valeriana officinalis L、Valerlanaceae(纈草根)。所述提取物被用于治療II型糖尿病。
美國專利公開20030086985公開了用于從Argyrobium roseum中分離提取物的方法，Argyrobium roseum包含黃酮苷并具有降血糖活性。包含該提取物的組合物對治療多種高血糖癥有用，包括非胰島素依賴型糖尿病。美國專利公開20020187201公開了使用從翡翠貽貝(Perna viridis)中分離的天然產(chǎn)物來控制糖尿病的方法。
但是，仍然需要發(fā)現(xiàn)具有長期作用的組合物和療法。在此描述的本發(fā)明滿足了這種需要，而且還提供了相關的優(yōu)點。
發(fā)明公開本發(fā)明提供了一種方法，其用于從催吐蘿芙木(Rauvolfia vomitoria)的葉部(葉和莖)和/或根以及酸橙(Citrus aurantium)的果實中提取藥用活性部分。在一方面，所述方法要求通過過濾催吐蘿芙木葉部和/或根以及酸橙果實的煮沸茶并濃縮上清液，從所述煮沸的茶中提取活性部分。在一個實施方案中，通過凍干上清液濃縮所述部分。
本發(fā)明還提供了一種方法通過向受試者給藥治療有效量的所述提取物或包含所述提取物的藥物組合物，來治療與受試者中異常升高的葡萄糖水平相關的疾病。這樣的疾病包括但不限于II型糖尿病、異常的硬脂酰輔酶A去飽和酶活性、飲食過多、異常的脂質動員、受試者眼睛的異常脂肪酸譜(fatty acid profile)、潰瘍和糖尿。
附圖簡述

圖1比較了分別來自消瘦、肥胖和糖尿病C57BL小鼠的脂肪組織(A)、眼(B)、骨骼肌(C)、胰腺(D)、肝-甘油三酯部分(E)和肝-磷脂部分(F)中的總脂肪酸(總FA)和不同脂肪酸子類含量(飽和脂肪酸，SFA；MUFA和PUFA)。數(shù)據(jù)表示為平均數(shù)±SEM值。將來自肥胖和糖尿病小鼠與消瘦對照小鼠的數(shù)據(jù)的顯著性差異表示為*＝P＜0.05；**＝P＜0.01；***＝P＜0.001。
圖2比較了分別在消瘦、肥胖和糖尿病小鼠的脂肪組織(A)、眼(B)、骨骼肌(C)、胰腺(D)、肝-甘油三酯部分(E)和肝-磷脂部分(F)中評估的硬脂酰輔酶A去飽和酶活性(計算為油酸與硬脂酸的比率)。數(shù)據(jù)表示為平均數(shù)±SEM值。將肥胖和糖尿病小鼠與消瘦對照小鼠的數(shù)據(jù)的顯著性差異表示為*＝P＜0.05；**＝P＜0.01；***＝P＜0.001。
圖3比較了分別來自消瘦、肥胖和糖尿病小鼠的脂肪組織(A)、眼(B)、骨骼肌(C)、胰腺(D)、肝-甘油三酯部分(E)和肝-磷脂部分(F)中必需脂肪酸的含量(亞油酸，LA；α-亞麻酸，α-LE；花生四烯酸，AA；和二十二碳六烯酸，DHA)。數(shù)據(jù)表示為平均數(shù)±SEM值。將肥胖和糖尿病小鼠與消瘦對照小鼠的數(shù)據(jù)的顯著性差異表示為*＝P＜0.05；**＝P＜0.01；***＝P＜0.001。
圖4比較了分別在消瘦、肥胖和糖尿病小鼠的脂肪組織(A)、眼(B)、骨骼肌(C)、胰腺(D)、肝-甘油三酯部分(E)和肝-磷脂部分(F)中Δ6去飽和酶的活性(計算為α-亞麻酸、二高γ亞麻酸和花生四烯酸的總和與亞油酸含量的比率)。數(shù)據(jù)表示為平均數(shù)±SEM值。將肥胖和糖尿病小鼠與消瘦對照小鼠的數(shù)據(jù)的顯著性差異表示為*＝P＜0.05；**＝P＜0.01；***＝P＜0.001。
圖5顯示在單次給藥70倍人類日劑量后，蘿芙木-橙提取物對11周大的消瘦C57BL/6J小鼠的體重的影響。
圖6顯示在單次給藥70倍人類日劑量后，蘿芙木-橙提取物對11周大的消瘦C57BL/6J小鼠的水(A)攝取和食物(B)攝取的影響。
圖7顯示在用每日給藥7倍人每日劑量治療6周后，蘿芙木-橙提取物對11周大的糖尿病肥胖C57BL/KsBom-db/db小鼠的體重的影響。
圖8顯示在用每日給藥7倍于最大的人類日劑量治療6周后，蘿芙木-橙提取物對11周大的糖尿病C57BL/KsBom-db/db小鼠的食物(A)和水(B)攝取的影響。
圖9顯示在6周的治療時間后，在對照(n＝9)和經(jīng)治療(n＝10)飼養(yǎng)的糖尿病C57BL/KsBom-db小鼠的眼睛中，蘿芙木-橙提取物治療對(A)脂肪酸含量；(B)必需脂肪酸含量和(C)評估的硬脂酰輔酶A和Δ6去飽和酶活性的影響。數(shù)據(jù)表示為平均數(shù)±SEM值。將治療小鼠與未治療對照小鼠的數(shù)據(jù)的顯著性差異表示為*＝P＜0.05；**＝P＜0.01。
圖10顯示人類病例研究的血糖水平進程，將其表達為治療時間的函數(shù)。
實施本發(fā)明的方式在本公開的全文中，通過鑒別引用來參考各種公開、專利和公開的專利說明書。這些公開、專利和公開專利說明書的內(nèi)容據(jù)此被引入本公開作為參考，以更充分地描述本發(fā)明涉及的領域狀態(tài)。
除非另有說明，本發(fā)明的實施使用有機化學、分析化學、生物化學和生理學的常規(guī)技術，這些在本領域的技術范圍內(nèi)。文獻中充分解釋了這些技術。
定義在用于本文時，某些術語可以具有下面定義的含義。
在用于本說明書和權利要求書時，除非文章另有清楚地說明，單數(shù)形式“一個”、“一種”和“所述”包括復數(shù)指代物。例如術語“一個細胞”包括多個細胞，包括其混合物。
在用于本文時，術語“包括”用于指所述組合物和方法包括所引用的要素，但不排除其他要素。當用于定義組合物和方法時，“基本上由...組成”應意味著排除對所述組合具有任何基本重要性的其他要素。因此，基本上由本文所定義的要素組成的組合物將不排除來自分離和純化方法的痕量污染物，以及藥學可接受的載體，例如磷酸鹽緩沖鹽水、防腐劑等?！坝?..組成”應意味著排除痕量元素以外的其他成分和用于給藥本發(fā)明組合物的基本方法步驟。由每個這些過渡術語定義的實施方案在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
所有用數(shù)字表示的指代物，例如pH、溫度、時間、濃度和分子量，包括范圍，都是近似值，它們以(+)或(-)0.1的增量變化。應理解的是，盡管沒有經(jīng)常明確地說明，但所有用數(shù)字表示的指代物均由術語“約”引導。還應理解的是，盡管沒有經(jīng)常明確地說明，但本文所述的試劑僅僅是示例性的，它們的等效形式在本領域中是公知的。
術語“分離的”是指與化合物、組合物或提取物通常與之天然伴隨的組分、細胞和其他物質分離的。
“受試者”或“宿主”是脊椎動物，優(yōu)選走獸或哺乳動物，更優(yōu)選人類患者。哺乳動物包括但不限于鼠類、大鼠、猿、人類患者、農(nóng)場動物、運動動物(sport animal)和寵物。
在用于本文時，“治療”包括全身改善與病理學相關的癥狀和/或延遲癥狀的發(fā)作?！爸委煛钡呐R床和亞臨床跡象將隨著病理學、個體和治療而變化。例如給藥對糖尿病病癥的治療能夠導致降低血糖水平和停止糖尿。在一方面，“治療”還包括“治愈”。申請人說明在例如約30天至約180天時間(或可替代為約60天至約120天)內(nèi)服用提取物的患者，通常不再需要重復治療。他們保持無癥狀，不再需要連續(xù)治療。
“組合物”用于指活性劑與另一種惰性(例如可檢測的試劑或標記物)或活性的化合物或組合物如輔劑的組合。
“藥物組合物”用于包括活性劑與惰性或活性載體的組合，從而使得組合物適合體外、體內(nèi)或離體的診斷或治療使用。
在用于本文時，術語“藥學可接受的載體”包括任何標準的藥用載體，例如磷酸鹽緩沖鹽水溶液、水和乳劑，例如油/水或水/油乳劑，以及多種類型的潤濕劑。所述組合物還可包括穩(wěn)定劑和防腐劑。對于載體、穩(wěn)定劑和防腐劑的例子，參見Martin REMINGTON′S PHARM.Sd.，15thEd.(Mack Publ.Co.，Easton(1975))。
“有效量”是足以實現(xiàn)有益或所需結果的量。例如治療量是指該量能獲得所需的治療效應。該量可與預防有效的量相同或不同，后者指防止疾病或疾病癥狀發(fā)作所必需的量?？稍谝淮位蚨啻谓o藥、施用或劑量中給予有效量。
“I型糖尿病”(過去稱為I型、IDDM或幼年型糖尿病)的特征是由自身免疫過程引起的β細胞破壞，通常導致胰島素的絕對缺乏。Report ofthe Expert Committee on the Diagnosis and Classification of DiabetesMellitus.Diabetes Care(1997)201183-97(下文中“Expert Report(1997)”)。National Diabetes Data Group.Diabetes in America.2d ed.Bethesda，Md.National Institutes of Health，National Institute of Diabetesand Digestive and Kidney Diseases，(1995)NIH Publication No.95-1468(下文中“NIH(1995)”)。該發(fā)作通常是急性的，在幾天到幾周的時間內(nèi)形成。超過95％的I型糖尿病患者在25歲以前形成該疾病，在兩種性別中發(fā)病率相等，在白種人群中的患病率增加。通常發(fā)現(xiàn)I型糖尿病、麩質性腸病(乳糜瀉)或其他內(nèi)分泌疾病的家族史。這些患者中大多數(shù)具有I型糖尿病的“免疫調節(jié)形式”，具有胰島細胞抗體，且?；加衅渌陨砻庖呒膊?，例如橋本甲狀腺炎、艾迪生病、白斑或惡性貧血。少數(shù)患者，通常是那些非洲或亞洲血統(tǒng)的患者不具有抗體，但具有相似的臨床表現(xiàn)；因而，也將他們包括在該類中，他們的疾病被稱為I型糖尿病的“自發(fā)形式”。Expert Report(1997)和NIH(1995)。
“2型糖尿病”(過去稱為NIDDM、II型或成年型發(fā)病)的特征是外周組織中的胰島素抗性和β細胞的胰島素分泌缺陷。Expert Report(1997)和NIH(1995)。這是最常見的糖尿病形式，與糖尿病的家族史、較老的年齡、肥胖和缺乏鍛煉高度相關。它在婦女中更常見，尤其是具有妊娠糖尿病史的婦女、黑人婦女、西班牙婦女和土著美洲婦女。胰島素抗性和高胰島素血癥最終導致?lián)p害葡萄糖耐受性。缺陷的β細胞被耗盡，進一步加劇葡萄糖不耐受和高血糖的循環(huán)。II型糖尿病的病因學是多因素的，可能基于遺傳，但它也具有強烈的行為成分。
將多種已知病因學的糖尿病類型分成一類，形成名為“其他特殊類型”的類別。這個組包括具有β細胞功能基因遺傳缺陷的人(這類糖尿病以前被稱為MODY或青年成熟型糖尿病)或具有胰島素作用缺陷的人；具有胰腺外分泌疾病的人，例如胰腺炎或囊性纖維化?。痪哂信c其他內(nèi)分泌病(例如肢端肥大癥)相關的功能障礙的人；和具有由藥物、化學品或感染引起的胰腺功能障礙的人。Expert Report(1997)和NIH(1995)。
本申請人已確定從催吐蘿芙木的葉部(葉和莖)和/或根以及酸橙的果實中提取藥用活性部分的方法。在一方面，所述方法要求通過過濾煮沸的茶并濃縮上清液，從催吐蘿芙木的葉部和/或根以及酸橙果實的煮沸茶中提取活性部分。在一個實施方案中，通過凍干上清液濃縮所述部分。
催吐蘿芙木廣泛分布在熱帶西非的沿海和內(nèi)陸部分。該物種是公知的藥用植物，被非洲的不同人群用作調和物(concoction)的主要或次要部分，用于治療多種疾病。Sofowora，Medicinal Plants and TraditionalMedicine in Africa，Wiley and Sons，Chichester(1 982)；Burkill，The UsefulPlants of Tropical West Africa，Vol.1(1985)。以前研究了催吐蘿芙木的生物堿含量，尤其是那些具有降壓和抗炎性質的生物堿。Chatterjee&Bandyopadhyay(1979)Ind.J.Chem.28B87-88；Amer&Court(1980)Phytochemistry 191833-1836；Kweifio-Okai(1991)J.EthnoPharmacology 33263-267。據(jù)報告，當結合飲食控制時，酸橙具有減少體重的作用。Preuss等人(2002)J.Med.33247-264。此外，酸橙已經(jīng)顯示出輻射防護性，因為它富含具有抗氧化活性的黃酮。Hosseinimehr等人(2003)J.Rad.Res.(Tokyo)44237-241。
本發(fā)明提供了基本上由從催吐蘿芙木和酸橙中獲得的液體提取物組成的生物學活性組合物。在一方面，所述提取物是從煮沸的催吐蘿芙木的葉和莖以及煮沸的酸橙果實中分離的。該提取物能夠與載體如藥學可接受的載體組合。作為替代的和/或另加的，可向所述組合物中添加降低血糖水平的有效量的試劑。
本發(fā)明還提供了一種方法通過向受試者給藥治療有效量的所述提取物或包含所述提取物的藥物組合物，來治療與受試者中異常升高的葡萄糖水平相關的疾病。在用于本文時，“治療”意味著減清與異常高的葡萄糖水平相關的癥狀。這樣的癥狀包括但不限于II型糖尿病、異常的硬脂酰輔酶A去飽和酶活性、飲食過多、異常的脂質動員、受試者眼睛的異常脂肪酸譜、潰瘍和糖尿。本領域技術人員能夠通過注意到患者血液或尿中葡萄糖的減少或癥狀的改善例如血壓正?；⑶鷱堨o脈周圍的球狀腫塊的消失等而注意到何時已實現(xiàn)所述方法的目標。
可使用任意給藥模式遞送所述提取物。可能將提取物添加到藥學可接受的載體中，全身、口服、經(jīng)皮或局部給藥至受試者。可憑經(jīng)驗確定治療量，它將根據(jù)被治療的病理學、被治療的受試者和治療方法中所用的活性部分形式的毒性而改變?？赏ㄟ^口服、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)或經(jīng)皮遞送各種形式的活性提取物、部分、化合物或包括一種或多種活性提取物、部分、化合物的組合物。當遞送至動物時，所述方法用于進一步確認所述提取物、部分、化合物或包括一種或多種活性提取物、部分、化合物的組合物對所治療疾病的效能。合適的動物模型在本領域中是已知的。僅僅為了說明的目的，在下面實驗1中描述了適當?shù)膭游锬Ｐ汀Ｊ褂脤嶒?中描述的動物模型，申請人注意到，當通過口服施用到6周大的遠交繁殖(outbred)NMRI消瘦小鼠或6周至11周大的近交繁殖C57BL/6J消瘦小鼠時，發(fā)現(xiàn)對應于70倍人每日劑量的單次劑量是無毒的。治療方案包括在6周內(nèi)，通過向C57BL/KsBom-db(db/db)小鼠口服施用相當于7倍人每日劑量的每日劑量。在治療期間，將實驗動物和對照動物保持缺乏碳水化合物和脂肪的Altromin C1009飲食。提取物降低了經(jīng)治療的II型糖尿病小鼠模型的飲食過多并促進體重減輕。盡管體重減輕不是統(tǒng)計學顯著性的，但是與對照組相比，經(jīng)治療的動物具有顯著更高的血清甘油三酯含量，這顯示在經(jīng)受嚴格熱量限制的動物中，所述治療能誘導體內(nèi)儲存的脂質動員。此外，經(jīng)治療動物眼睛的脂肪酸譜顯示總脂肪酸和所有主要的脂質子類的顯著減少，評估硬脂酰輔酶A去飽和酶活性減少33％(與未治療的對照相比，P＝0.039)。有趣的是，如果將經(jīng)治療動物保持在熱量限制下，則在中斷治療另5周后，它們保持了在6周治療結束時觀察到的脂肪酸動員。這與在db/db小鼠中觀察到的“脆弱”胰腺的保護是一致的。相反，在治療后被喂以更豐富的標準Altromin 1314飲食的經(jīng)治療小鼠卻損失了這些優(yōu)點。
在整個療程中，能夠以一個劑量連續(xù)或間歇地實現(xiàn)體內(nèi)給藥。確定最有效的給藥方式和劑量的方法對本領域技術人員是熟知的，它們將根據(jù)用于治療的組合物、治療的目的、被治療的靶細胞和被治療的受試者而變化。能夠用由醫(yī)生選定的劑量水平和模式進行單次或多次給藥。下文能夠找到用于給藥試劑的合適劑量制劑和方法。
本發(fā)明的提取物、部分、化合物、組合物和藥物制劑能夠用于制造藥物、食品和健康補充劑，并通過常規(guī)方法給藥，例如作為藥物組合物中的活性成分，用于治療人和其他動物。
會理解的是，本發(fā)明的化合物和組合物的適當劑量可取決于疾病類型和嚴重性以及階段，且會隨患者而異。最佳劑量的確定通常將包括平衡治療益處的水平與本發(fā)明治療的任何危險或有害副作用。例如提取物、部分、化合物或包括一種或多種提取物、部分、化合物的組合物可通過口服、鼻內(nèi)、胃腸外或通過吸入療法給藥?？梢詫⑺渲瞥扇魏魏线m的遞送形式(means)，所述形式的例子包括但不限于片劑、錠劑、顆粒劑、膠囊、藥丸、安瓿劑、栓劑或氣霧劑形式。它們也可以采用糖漿劑、顆粒物、散劑或者活性成分在水性或非水稀釋劑中的混懸劑、溶液劑和乳劑的形式。除了本發(fā)明的活性劑或提取物外，所述藥物組合物還可包含其他藥用活性化合物或多種本發(fā)明的化合物。
通過任選地與一種或多種助劑壓制或模制，可以制備片劑。可以如下制備壓制片將自由流動形式的活性成分如粉末或顆粒任選地與粘合劑(例如聚維酮、明膠、羥丙基甲基纖維素)、潤滑劑、惰性稀釋劑、防腐劑、崩解劑(例如淀粉羥乙酸鈉、交聯(lián)聚維酮、交聯(lián)羧甲基淀粉鈉)、表面活性劑或分散劑混合，在合適的機器中壓片。通過將潤濕的粉末化合物與惰性液體稀釋劑的混合物在合適的機器中制模，可制備模制片。所述片劑可以任選地被包衣或壓痕，通過使用例如不同比例的羥丙基甲基纖維素來提供所需的釋放曲線，可將片劑配制成提供其中所含活性成分的緩釋或控釋。可以任選地為片劑提供腸溶包衣，以在胃以外的腸的部分提供釋放。
用于局部給藥的本發(fā)明藥物組合物可被配制成軟膏劑、乳膏、混懸劑、洗劑、散劑、溶液劑、糊劑、凝膠、噴霧劑、氣霧劑或油?；蛘?，制劑可以包括浸滲活性成分和任選地一種或多種賦形劑或稀釋劑的貼片或敷料如繃帶或膏藥。適合在口中局部給藥的制劑還包括錠劑，其包括在調味基質中的活性成分，調味基質通常為蔗糖和阿拉伯膠或黃芪膠；軟錠劑，其中包括在惰性基質如明膠和甘油、或蔗糖和阿拉伯膠中的活性成分；以及口腔洗劑，其包括在合適的液體載體中的活性成分。
適合陰道給藥的制劑可作為陰道栓劑、止血栓、乳膏、凝膠、糊劑、泡沫或噴霧制劑出現(xiàn)，除了活性成分外，所述制劑還包含例如本領域已知的合適載體。
適合鼻腔給藥的制劑(其中載體為固體)包括粒度為例如在約20至約500微米范圍內(nèi)的粗粉，其給藥為采用鼻吸的形式，即從舉到靠近鼻子的粉末容器迅速吸入通過鼻腔通道。其中所述載體為液體的用于給藥的合適制劑例如鼻腔噴霧、滴鼻劑或通過噴霧器氣霧給藥，所述制劑包括活性成分的含水溶液或油溶液劑。
適合胃腸外給藥的制劑包括含水和非水等滲無菌注射液，其可包含抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑和溶質，它們致使所述制劑與預計的接受者的血液等滲；和含水與非水滅菌混懸劑，它們可以包括助懸劑和增稠劑，以及脂質體或其他微粒系統(tǒng)，它們被設計成將化合物靶向至血液組分或一個或多個器官。所述制劑可存在于單位劑量或多劑量的密封容器如安瓿和小瓶中，可以貯存在冷凍干燥(凍干)條件中，這僅需要在就要使用前加入無菌液體載體，例如注射用水。即用注射溶液和混懸劑可以從前述種類的無菌粉末、顆粒劑和片劑中制得。
優(yōu)選的單元劑量制劑是那些包含本文上述的藥物成分或其適當部分的每日劑量或單元、每日亞劑量的制劑。
應該理解，除了上面具體提及的成分外，考慮到所述的制劑類型，本發(fā)明的制劑還可包括本領域常規(guī)的其他生物活性劑。僅為了說明的目的，這些額外的生物活性劑包括但不限于磺酰脲類，例如氯磺丙脲(商品名Meldijan等)、氨磺丁脲(大約40個商品名)、格列本脲(商品名Euglukon、Glibenklamid、Genericon等)和雙胍類，其包括例如苯乙雙胍(商品名Phenformin、DB-Comb等)以及二甲雙胍(商品名Gluchopage等)。在又一實施方案中，可以在組合物和制劑中包括適合口服給藥的另外的試劑如甜味劑、增稠劑和調味劑。
所述提取物、部分、化合物或包括一種或多種提取物、部分、化合物的組合物也可以作為獸藥制劑的形式使用，這些制劑可以通過例如本領域的常規(guī)方法制得。
本發(fā)明還提供了一種方法通過比較潛在治療的活性與本發(fā)明提取物的治療活性，篩選治療劑來治療或改善與異常的血糖水平，例如異常高的血糖水平相關的癥狀，例如糖尿病患者所經(jīng)歷的癥狀。在一方面，所述患者患有II型糖尿病。所述測定還可用于篩選所述提取物與另一種活性劑或治療的新的或可替代的制劑或組合。所述篩選需要(a)將潛在試劑給藥到合適的動物模型中，和(b)向另一合適的動物給藥有效量的提取物或包含所述提取物的藥學可接受的組合物。比較步驟(a)動物和步驟(b)動物的治療響應的生物標記。如果步驟(a)的任何試劑提供的治療響應與步驟(b)的模型中提供的響應程度相同或類似，則它就是用于治療或改善與動物體內(nèi)異常的血糖相關的癥狀的治療劑。合適的動物模型包括但不限于下面實驗1中所述的動物模型或人類患者，例如糖尿病人類患者。
本發(fā)明還提供了所述提取物在制備用于治療糖尿病的藥物中的用途。
本發(fā)明還提供了一種試劑盒，用于治療或改善與異常的血糖，例如異常高的血糖水平相關的癥狀。所述試劑盒包括治療有效量的提取物和使用說明。所述試劑盒可用于治療選自下列疾病的疾病II型糖尿病、異常硬脂酰輔酶A去飽和酶活性、飲食過多、異常脂質動員、受試者眼睛的異常脂肪酸譜、潰瘍和糖尿。
下列實施例用于說明，而非限制本發(fā)明。
實施例實驗1-新穎的動物模型脂質組成活細胞的主要部分，在那里它們提供物理屏障來隔室化細胞，并作為能量在肝和脂肪組織中的主要貯存形式。膜脂不僅形成細胞的惰性框架。而且，現(xiàn)在認識到膜脂及其生物活性衍生物在細胞功能，尤其是在細胞對來自激素、神經(jīng)遞質和生長因子的外部刺激的響應中具有基本作用。因此，膜脂組成的改變與特定的疾病病癥如囊性纖維化(Freedman等人(2004)New Eng.J.Med.350560-569)、糖尿病和肥胖相關就不奇怪了。Vessby B.(2000)Brit.J.Nutr.83 Suppl.S91-96。
但是，關于變化程度和哪些組織或器官最佳地呈現(xiàn)修飾，文獻中的報告相互矛盾。盡管在人體中，飽和脂肪酸(SFA)和較低分子量多不飽和脂肪酸(PUFA)含量的增加與改變的骨骼肌胰島素響應相關，但Clore等人((2000)MetabolismClinical and Experimental 492332-238)發(fā)現(xiàn)，與從健康對照中采集的樣品相比，在糖尿病患者的血清中，長鏈PUFA(例如花生四烯酸)和低級亞油酸的含量增加了。
為了在II型糖尿病模型小鼠中建立與脂質內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定相關的一些參數(shù)狀態(tài)，研究了小鼠中的糖尿病病理生理學涉及的組織的脂肪酸(FA)含量。研究遺傳繁殖糖尿病(db/db)和肥胖(ob/ob)小鼠、以及相同年齡并用相同飲食喂養(yǎng)的消瘦小鼠的組織脂肪酸組成。研究其FA特征的組織包括脂肪組織、眼、肝、胰腺和骨骼肌。結果顯示，盡管在肥胖小鼠的大多數(shù)不同組織中存在脂質積累，但是在糖尿病小鼠的脂肪組織、眼睛和肌肉中，脂質的沉積存在選擇性，并顯示在后兩種組織中硬脂酰輔酶A去飽和酶活性增加。
實驗1-步驟動物在由Danish Animal Care and Use license批準的指導原則下進行所述研究。實驗動物是雄性遺傳繁殖的C57BL/6Jbom-ob/ob(肥胖，n＝4)、C57BL/KsBom-db/db(糖尿病，n＝3)小鼠和消瘦的C57BL/6J純系(n＝4)。當動物13周大時，從Bomholtgaard Breeding and Research Centre Ltd.，Ry，Denmark購得。將動物保持為每組3-4只小鼠/籠，保持Altromin 1320標準維持飲食，居住在保持為25℃、具有12h黑暗和12h光線循環(huán)的屋子中。
樣品收集當動物23周大時，將它們禁食過夜。第二天，將動物稱重，用醚麻醉，通過眼眶穿刺收集血樣，然后將動物處死。使血樣在室溫下凝結(約1小時)，并在4℃高速(3000g)離心30min后，收集干凈的血清樣品。使用放射免疫分析法(“RIA”)試劑盒(Linco Research，Inc.Missouri，USA)確定血清胰島素和胰高血糖素含量。從每只動物采集眼睛、肝(左前葉)、胰腺、腿骨骼肌和脂肪組織(睪丸周圍)的樣品，立即冷凍在液氮中，保存在-70℃。
FA分析用氯仿/甲醇萃取組織中的總脂質，甲基化并在具有火焰離子化檢測器的Hewlett Packard 5890系列II色譜儀(Hewlett-Packard GmbH，Waldbronn，Germany)中，通過氣相-液相色譜法分析，基本上如由Staarup和Hoy(2000)J.Nutr.1302802-2808所述。簡言之，給所述儀器安裝60m熔凝硅石毛細管柱(SP-2380)，進樣器和檢測器溫度處于270℃。載氣為氦。烘箱初始溫度為70℃，保持0.5min，接著程序升溫如下15℃min-1至160℃，1.5℃min-1至200℃，保持15min，及30℃min-1至225℃，保持5min。
定量不同組織中每種脂肪酸類型的數(shù)量(脂肪酸的重量百分比含量乘以μg總脂肪/mg組織)。計算每個樣品的飽和脂肪酸(SAT)、單不飽和脂肪酸(MUFA)和PUFA的總和，表示為μg脂肪/mg組織(或者對于脂肪組織，mg脂肪/mg組織)。對于單個脂肪酸的百分比，將參與脂肪酸生物合成的選定酶的活性評估為產(chǎn)物與前體的比率。所評估的脂肪酸涉及的代謝過程包括A9或硬脂酰輔酶A去飽和酶活性和Δ6去飽和酶，將前者評估為油酸[C18:1(n-9)]與硬脂酸(C18:0)的比率，將后者計算為γ-亞麻酸(LNA，[C18:3(n-6)]、二高γ亞麻酸(DGLA，[C20:3(n-6)]和花生四烯酸(AA，[C20:4(n-6)])的總和與亞油酸[C18:2(n-6)]的比率。
統(tǒng)計將數(shù)值表示為平均數(shù)±標準誤差。使用ANOVA(非雙側t檢驗)在Microsoft Excel中測試數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學差異。認為p＜0.05的數(shù)值是顯著的。
結果體重、血清胰島素和胰高血糖素水平在表1中顯示小鼠的體重、血清胰島素和胰高血糖素水平。正如預期的，當與消瘦小鼠相比時，ob/ob小鼠顯示出體重顯著增加。在糖尿病小鼠與其消瘦對照物的平均體重之間不存在顯著性差異。ob/ob和db/db小鼠顯示胰島素和胰高血糖素水平增加，這對于品種(5)是典型的；比較標準禁食范圍分別為胰島素0.5-2ng/ml，胰高血糖素50-150pg/ml。
表1小鼠的體重、血清胰島素和胰高血糖素(表示±SEM)
*P＜0.05。
a在從僅2只db/db小鼠中獲得的血清上進行分析。
遺傳肥胖小鼠和糖尿病小鼠組織在單不飽和脂肪酸如何積累中的不同在圖1的A、B、C、D、E和F中分別表示不同小鼠的脂肪組織、眼、骨骼肌、胰腺、肝-甘油三酯(肝-TAG部分)和肝-磷脂(肝-PL部分)中主要脂肪酸類別的相對量。通常，與在消瘦小鼠和糖尿病小鼠組織中相比，在肥胖小鼠的組織中的總脂肪酸尤其是SFA和MUFA增加。因此，除了眼睛外，與消瘦小鼠中的數(shù)值相比，在肥胖小鼠組織中觀察到SFA和MUFA積累顯著增加。有趣的是，當與消瘦小鼠組織中的FA含量相比時，遺傳糖尿病小鼠僅在脂肪組織、骨骼肌和眼中顯示FA積累(尤其是MUFA)的顯著增加(圖1B)。
在ob/ob和db/db小鼠組織中評估的硬脂酰輔酶A去飽和酶活性的不同增加與上面觀察的MUFA積累一致，在肥胖小鼠的大多數(shù)組織中，計算的硬脂酰輔酶A去飽和酶活性有增加(圖2的A、B、C、D、E和F)。對于糖尿病小鼠，Δ9不飽和度的顯著增加僅與眼和骨骼肌相關，它們還具有顯著的MUFA積累(參見上述)。
遺傳肥胖小鼠和糖尿病小鼠在多不飽和脂肪酸如何在組織中積累和何種多不飽和脂肪酸在組織中積累的不同當與消瘦小鼠中的水平相比時，ob/ob小鼠胰腺、肝-TAG部分和骨骼肌的PUFA部分顯著增加(參見圖1和3)。在db/db小鼠中，PUFA的顯著增加在骨骼肌中也顯而易見。盡管長鏈和短鏈形式的PUFA都在肥胖小鼠組織中積累，但PUFA部分在糖尿病小鼠肌肉中的增加主要來自短鏈LA和α-亞麻酸的積累(圖3)。雖然與消瘦小鼠相比，在db/db小鼠中前體n-6 LA的積累與較長鏈n-6產(chǎn)物花生四烯酸(AA)的顯著減少不一致，但在db/db小鼠的骨骼肌和其他組織中，長鏈n-3 DHA顯著減少。這里唯一的例外是db/db胰腺，與從消瘦對照動物的胰腺中觀察到的相比，其中包含顯著更高數(shù)量的DHA(參見圖3)。
評估Δ6去飽和酶活性在db/db小鼠的眼和骨骼肌中降低除了胰腺和肝PL部分外，評估Δ6去飽和酶活性在db/db小鼠的組織中減少(圖4的A、B、C、D、E和F)。不能用評估Δ4不飽和度(計算為DHA[C22:6(n-3)]對二十二碳六烯酸DPA[C20:5(n-3)]的比率)來確證Δ6不飽和度的減少，因為糖尿病小鼠的幾個組織缺乏可檢測的DPA水平。但是，在糖尿病小鼠中，Δ6不飽和度的減少確實與DHA水平的顯著減少是一致的。在肥胖小鼠中，還預測胰腺和肝-TAG部分的評估Δ6活性減少，而預期脂肪組織和肝-PL部分的評估Δ6活性增加(圖4的D和E)。
結果討論肝和脂肪組織構成哺乳動物中貯存、處理和分布熱量燃料(caloricfuel)的主要組織。在正常條件下，這些組織與體內(nèi)對某些激素和輔因子有高度響應的其他組織之間存在動態(tài)的相互影響，從而即使在間歇的禁食期，也能確保哺乳動物組織保持富含高能的燃料的穩(wěn)定流動。II型糖尿病或NIDDM來自機體能量代謝的機能障礙。NIDDM的代謝紊亂特征與脂質動員和肥胖日益密切相關。Vessby(2000)New Eng.J.Med.350560-569；McGarry(1992)Science 258766-770。肥胖的特征是組織脂質的蓄積增加。
該實驗顯示，當與其消瘦對照物相比時，在具有嚴重NIDDM形式的遺傳糖尿病db/db小鼠和具有較溫和的II型糖尿病形式的遺傳肥胖ob/ob小鼠中，組織脂質分布明顯不同。盡管除了眼睛外，ob/ob小鼠在所檢查的全部組織中都積累了SFA和MUFA，但MUFA在db/db小鼠中的積累限于脂肪組織、眼和骨骼肌。因此，嚴重糖尿病小鼠的肝顯得缺少脂質積累。相反，過度產(chǎn)生的MUFA沉積在其他非脂肪組織上，例如眼和肌肉(參見表2)。盡管已經(jīng)報告了糖尿病視網(wǎng)膜病及其通常相關的視網(wǎng)膜脂質沉積(Curtis&Scholfield(2004)Diabetes-Metab.Res.2028-43)，但是在文獻中還沒有報告眼組織脂質積累與ob/ob(表示溫和的NIDDM狀態(tài))和db/db小鼠(表示嚴重的NIDDM狀態(tài))之間的這種區(qū)別。
在哺乳動物細胞內(nèi)，通過酶復合體FA合成酶(FAS)合成飽和脂肪酸如棕櫚酸(C16:0)和硬脂酸(C18:0)，該酶使用由限速酶乙酰輔酶A羧化酶產(chǎn)生的構成嵌段。由于硬脂酸和少數(shù)棕櫚酸是不溶于水的(Kim&Ntambi(1999)Biochem.Biophys.Res.Comm.2661-4)，所以哺乳動物體內(nèi)從頭FA生物合成的終產(chǎn)物通常被硬脂酰輔酶A去飽和酶分別轉化為其MUFA形式、油酸(C18:1)和棕櫚油酸(C16:1)。Enoch等人(1976)J.Biol.Chem.2515059-5103。但是，在大多數(shù)發(fā)達國家常見的高脂肪飲食中，一些被消耗的過量脂肪沒有被代謝，而是僅僅貯存在組織中。事實上，現(xiàn)存脂質通過脫酰作用/再酰化作用進行從頭FA合成和重建，其發(fā)生速率與大鼠肝細胞中的速率相似。Schmid等人(1995)Arch.Biochem.Biophys.319168-176。在本研究中，在肥胖小鼠的組織中(除了眼)，評估硬脂酰輔酶A去飽和酶活性增強。在糖尿病小鼠中，硬脂酰輔酶A去飽和酶活性的增加僅僅與眼和肌肉相關(即MUFA積累增加的兩個組織)。在肥胖和II型糖尿病的發(fā)展中，酶對FA積累的主要作用已經(jīng)被如下發(fā)現(xiàn)所確證，即兩個小鼠SCD基因中一個基因的損失會導致減少身體肥胖和抵抗飲食誘導的體重增加。Ntambi等人(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA9911482-11486。此外，由于參與胰島素信號的細胞因子升高，SCD1-/-動物的胰島素敏感性增加。Rahman等人(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 10011110-11115。事實上，已經(jīng)顯示抗II型糖尿病藥物噻唑烷二酮類通過壓制SCD1基因表達，通過PPAPγ受體發(fā)揮它們的一部分抗糖尿病效應。Kurebayashi等人(1997)Diabetes 462115-2118。
與NIDDM相關的一個長期并發(fā)癥是傷口愈合不良。Colville-Nash&Willoughby(1997)Mol.Med.Today 314-23。必需脂肪酸(EFAs)是幾種類二十烷酸和二十二烷酸的重要前體，類二十烷酸和二十二烷酸分別具有促炎和抗炎效應。因此，檢查了兩種NIDDM模型小鼠中EFA的變化。與消瘦小鼠相比，PUFA部分在ob/ob小鼠的胰腺、肝-TAG和骨骼肌中增加，但在肝-PL部分中減少。從db/db小鼠的骨骼肌中也觀察到了PUFA部分的增加。與ob/ob小鼠中PUFA的增加模式相反，較短鏈PUFA-LA和α-亞麻酸僅僅引起db/db小鼠肌肉中PUFA的增加。與在消瘦對照中發(fā)現(xiàn)的數(shù)量相比，在成人中，肥胖和糖尿病患者的胰島素抗性與骨骼組織(Borkman等人(1993)New Engl.J.Med.328238-244；Storlien等人(1996)Lipids 31S261-S265)和紅細胞(Min等人(2004)Diabetologia4775-81)中相對低比例的長鏈PUFA相關。
在哺乳動物細胞中，從LA和α-亞麻酸生物合成長鏈必需PUFA是在一系列延長和去飽和步驟中由Δ6和Δ5不飽和酶驅動的。在缺乏胰島素時(在未治療的I型糖尿病的情況下)，兩種酶的活性都被下調。Brenner(2003)Prostaglandins Leukot.Essent.Fatty Acids 68151-162。通過給藥胰島素糾正病癥。Mercuri等人(1967)Lipids 2284-285；Suresh&Das(2003)Nutrition 19213-228。盡管已經(jīng)充分研究了I型糖尿病中酶的活性，但僅有極少的數(shù)據(jù)涉及它們在II型糖尿病中的水平和活性。在本研究中，基于n-6 PUFA產(chǎn)物與底物比率的酶活性評估提示，盡管Δ6去飽和酶活性可能在肥胖小鼠的一些組織中增加，但所述酶的活性可能在大多數(shù)db/db小鼠的組織中減少(參見圖3)。對db/db傾向的唯一例外是胰腺，其中與消瘦對照相比，評估Δ6活性增加，與在消瘦小鼠中觀察到的水平相比，評估Δ6去飽和酶活性(圖3D)和計算為DHA與DPA比率的Δ4不飽和度都沒有顯著差異。盡管評估Δ6去飽和酶活性在db/db小鼠其他組織中的顯著減少與DHA水平的顯著減少是一致的(圖4)，但在與消瘦小鼠中的水平相比時，AA含量沒有減少。而且，在本文分析的大多數(shù)組織中，甘油三酯和磷脂部分之間缺少區(qū)別，這使得難以確定LA或α-亞麻酸的增加是否僅僅來自甘油三酯的增加，后者利于短鏈PUFA的積累。在ob/ob肝中，僅僅在甘油三酯部分出現(xiàn)所積累的脂質。
不過，在II型糖尿病中，EFA組織含量的變化能夠對II型糖尿病的預后具有一些長期影響。一方面，在嚴重NIDDM中缺乏的長鏈PUFADHA是二十二碳三烯和resolvin的一個主要前體，二十二碳三烯和resolvin對于分辨急性和慢性炎癥(Hong等人(2003)J.Biol.Chem.27814677-14687)、以及對于涉及不適當活化的自身免疫響應的疾病是有益的。Calder(1997)Ann.Nutr.Metab.41203-204。另一方面，顯示通過15-脂氧化酶-1，13-S-羥環(huán)十八碳二烯酸的作用，從LA獲得的脂質基分子是凋亡劑。Shureiqi等人(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA1009968-9973；Nixon等人(2004)Prostaglandins Leukot.Essent.FattyAcids 707-15?？偨Y起來，DHA的減少以及LA的增加可能有助于增強與眼相關的一些糖尿病長期并發(fā)癥和骨骼肌傷口愈合不良。最近，Brenner與合作者(Brenner等人(2003)Lipids 38733-742；Montanaro等人(2003)Lipids 38827-832)公布的研究顯示，在兩種其他II型糖尿病模型動物的肝微粒體中，Δ6和Δ5去飽和酶活性增加。
在本文研究的遺傳糖尿病ob/ob小鼠中，只有肝-PL部分中Δ6去飽和酶活性的評估值與II型糖尿病模型動物大鼠中的真實酶活性測量一致。
FA代謝是細胞特異性的，本研究中考慮的硬脂酰輔酶A去飽和酶和Δ6去飽和酶活性都是估計值。因此，在從3組C57BL小鼠采集的組織中，確定和比較參與脂質動態(tài)平衡的酶表達和活性的真實水平是有益的。在基于相同的C57BL-基因型并以相同飲食喂養(yǎng)的消瘦、肥胖和糖尿病小鼠的組織中，脂質含量和組成存在明顯區(qū)別。因此，除了眼外，在遺傳肥胖小鼠的所有組織中都存在SFA和MUFA的積累。在具有更嚴重NIDDM形式的db/db小鼠中，其與幾種II型糖尿病的長期并發(fā)癥相關，肝缺少脂質積累，MUFA子類的脂肪酸積累限于眼、脂肪組織和骨骼肌。NIDDM的輕微形式和嚴重形式都與PUFA在骨骼肌中的積累相關，但短鏈PUFA是嚴重NIDDM中的增加的主要原因。II型糖尿病組織脂質中的這些反常(distortion)可以定義該疾病的病理生理學。
實驗2-提取物的制備和給藥動物研究材料和方法蘿芙木-橙浸劑的植物材料和制備在尼日利亞北部伊多州的Auchi和Ihievbe(位于赤道的北緯70和東經(jīng)60 20′)，收集催吐蘿芙木嫩莖上附著的葉子和酸橙的新鮮果實。在大鋁罐中，將洗過的干燥葉部合并(總重400g)與四份完整的酸橙果實(總濕重2kg)以交替的層排列。然后用8升自來水覆蓋植物材料，煮沸，以低熱慢煮1h。將所得金色液體冷卻到室溫，通過粗濾器過濾。用3升水漂洗用過的(spent)植物材料，按前述煮沸，將所得的茶也過濾，與最早收集的第一批匯合，在-20℃冷凍?？偸章实湫偷貫?.5升。將匯合的植物提取物凍干，收率典型地為從1升中得到12g干提取物。
動物模型和居住條件在治療實驗中所用的實驗動物是雄性近交繁殖的糖尿病C57BL/KsBom-db小鼠。該小鼠的特征是肥胖、飲食過多、短暫的高胰島素血癥、胰腺β細胞隨年齡退化和高血糖癥。由于在這些小鼠中觀察到的胰島素抗性，認為它們是II型非胰島素依賴型糖尿病的模型。已經(jīng)確定db基因可編碼在下丘腦表達的萊普亭受體的一種不同的小鼠形式。Lee等人(1996)Nature 379632-635。萊普亭是由脂肪細胞分泌的激素，它對許多身體系統(tǒng)，包括生殖和代謝具有多種效應。Chehab等人(1996)Nature Genetics 12318-320。萊普亭的總體缺乏或機體對該蛋白的效應的抵抗能導致發(fā)展嚴重的肥胖。Ahima等人(1996)Nature 382250-252。當實驗動物5周大時購買它們，用標準Altromin小鼠/大鼠飲食喂養(yǎng)，直至它們11周大，此時開始治療。在治療過程中，通過用缺乏碳水化合物和脂肪的Altromin C1009飲食喂養(yǎng)，使實驗和對照動物均受到熱量限制。
對于毒性實驗，在消瘦的6周和11周大的C57BL/6J近交繁殖小鼠、以及消瘦的6周大的遠交繁殖NMRI小鼠上測試蘿芙木-橙浸劑。在毒性實驗的過程中，用Altromin 1320標準小鼠/大鼠維持飲食喂養(yǎng)動物。
所有動物均購自Bomholtgaard Breeding and Research Centre Ltd.，Ry，Denmark；以每組4只/籠居住，處于受控的環(huán)境條件下(溫度25±1℃，相對濕度55±5％，12h黑暗和12h光線循環(huán)，換氣為10次/h)。使動物能自由接近水和上面規(guī)定的飼料。居住和護理依照國家指導原則，Danish National Animal Ethics Committee批準了本研究。依照由Danish Animal Experimental Inspectorate批準的指導原則開展本研究和所有程序。
毒性實驗推薦的最大人用劑量為3杯普通飲用杯/天。在平均體積為750ml/70kg體重的基礎上，給每kg小鼠給藥來自770ml的干提取物，相當于70倍人每日劑量。70倍測量使小鼠體內(nèi)的代謝速率比人體內(nèi)快10倍，產(chǎn)生超劑量的額外因子為7。使用小鼠管飼法，在一次劑量中通過口服給藥濃縮的提取物。在給藥后，連續(xù)2小時觀察動物，使它能隨意到達水和食物，每2天監(jiān)測體重增加或損失，以及每籠的食物和水攝取。每周還使用Boerhinger Mannheim(Reflolux S)棒監(jiān)測對照和實驗組的未禁食血糖含量。
治療方案在6周內(nèi)，使用小鼠管飼法，以0.5ml的總體積，每天給糖尿病小鼠口服應用相當于10倍最大人用每日劑量的植物提取物。在藥物或水給藥后1小時，每天觀察所有動物的總行為變化，使其自由接近水和食物，每2天監(jiān)測體重、食物和水攝取。每周還測量未禁食的血糖含量。
評價治療的“治愈效應”和治療后飲食的影響在蘿芙木-橙治療的常規(guī)應用中，建議患者堅持健康飲食(低糖和低脂肪)并將酒精消耗保持到最小。在嚴格按照上述治療方案治療的2組db/db小鼠中達到了治療的“治愈效應”。所述2組中每組也由10只實驗和10只對照小鼠組成。在6周的治療期后，在5周的時間內(nèi)，一組保持較差的Altromin C1009飲食，而第二組喂以較豐富的標準Altromin1314飲食，不進行進一步的治療。
樣品收集和分析在實驗指定的時期結束時，用醚麻醉小鼠，通過眼眶穿刺收集血樣。然后將動物處死，分割出器官。使血樣在室溫下凝結(約1小時)，在4℃高速離心30min后，收集干凈的血清樣品。在BoehringerMannheim/Hitachi分析系統(tǒng)上確定血液血清樣品中血清葡萄糖、甘油三酯和膽固醇的含量。還使用Rat Insulin and Glucagon RIA試劑盒(LincoResearch，Inc.)確定血清胰島素和胰高血糖素的含量。
確定動物的腎、肝、胰腺和脾重量，將這些組織的樣本、以及眼睛冷凍在液氮中，在-70℃保存。
如前面實驗1中所述，然后確定治療和對照動物的眼睛的脂肪酸譜。
統(tǒng)計分析將數(shù)值表示為平均數(shù)±SD(有時為標準誤差)。使用ANOVA(非成對t檢驗)，在Microsoft Excel中檢驗實驗和對照組數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學差異。認為P＜0.05的數(shù)值是顯著的。
實驗2-結果毒性實驗在給藥單個70倍人用劑量/g小鼠體重后，在最初一小時，觀察到動物非常安靜。在攝取藥物后的第二小時，觀察到所有的實驗動物變得更加警覺。在第二天，所有的實驗小鼠與對照組的小鼠一樣活躍。但是，在給藥植物提取物4周后，與經(jīng)毒性實驗的6周大C57BL/6J和NMRI小鼠相比，對照組的最終體重或器官重量、血清甘油三酯和膽固醇含量沒有顯著性差異。盡管在4周觀察期結束時，經(jīng)治療的C57BL/6J小鼠具有顯著更高的血清葡萄糖含量，但實驗和對照組的血清葡萄糖數(shù)值均處于標準范圍內(nèi)(表2)。這個結果確證蘿芙木-橙提取物對至少2個品種的年輕小鼠是無毒的。
表2毒性實驗結果在單次給藥70倍人每日劑量后，6周大的C57 6J和NMRI小鼠的體重、血清甘油三酯、膽固醇、和葡萄糖含量。突出了顯示對照和實驗小鼠之間存在顯著性差異的參數(shù)。*＝P＜0.5。
與對照動物相比，在經(jīng)毒性實驗的11周大C57BL/6J小鼠中，治療組的體重增加存在顯著性差異(圖6)。在剛剛給藥提取物后，差異更顯著。這在如下事實中得到了反映，即在觀察期間，與對照組相比，治療組吃得較少且喝得較少(圖7A和7B)。由于在4周觀察期結束時，與其同窩出生的對照小鼠相比，經(jīng)毒性實驗的較老C57BL/6J小鼠顯示出統(tǒng)計學顯著性更小的平均肝重量和更高(雖然處于標準水平)的血清葡萄糖含量(參見表4)，可以推斷盡管植物提取物對較老的小鼠無毒，但它可能影響較老年小鼠肝中的一些代謝過程。
表3毒性實驗結果在單次給藥70倍人每日劑量后，11周大的C57 6J小鼠的身體和器官重量、血清甘油三酯、膽固醇、和葡萄糖含量。突出顯示了對照和實驗小鼠之間存在顯著性差異的參數(shù)。*＝P＜0.5。
經(jīng)治療糖尿病小鼠的體重損失在治療實驗中，在轉移至較差的飲食后，治療和對照db/db小鼠都損失了一些體重。但是，治療組的體重損失顯著高于在對照組中觀察到的體重損失(參見圖8)。這可能已經(jīng)出現(xiàn)了，因為與其同窩出生的對照小鼠相比，經(jīng)治療小鼠喝得較少且吃得較少(參見圖9A和9B)。
經(jīng)治療小鼠顯示血糖量正常和脂肪代謝的信號在6周的治療期結束時，與對照小鼠的數(shù)值相比，治療組顯示血清葡萄糖水平更接近正常范圍。有趣的是，治療組還顯示顯著更高的血清甘油三酯數(shù)值，盡管兩個組都仍然具有非常高的血清胰島素和胰高血糖素水平(參見表3)。與未治療的對照相比，血清甘油三酯的增加與經(jīng)治療小鼠眼睛中總脂肪酸含量減少36％是一致的(參見圖10A)。具體地，總脂肪酸含量的減少反映在總飽和脂肪酸、MUFA和PUFA分別減少25％、45％和31％。經(jīng)治療小鼠眼睛中PUFA含量的減少似乎主要是由于亞油酸含量減少了62％。與其未治療的同窩出生對照小鼠相比，在經(jīng)治療的小鼠中，隨著脂肪酸含量的這些顯著減少，評估硬脂酰輔酶A去飽和酶活性減少33％，評估Δ6去飽和酶活性增加72％。在MicrosoftExcel中列出治療和未治療對照小鼠眼睛樣品的每種脂肪酸數(shù)量(表示為每mg組織中總脂肪酸的％)，如附錄I所示。
治療后飲食對“治愈”的影響在5周的治療后觀察期結束時，當與喂以相同飲食的經(jīng)治療小鼠的數(shù)值相比時，保持差Altromin C1009飲食的對照小鼠具有更低的平均體重、血清葡萄糖、甘油三酯和胰島素數(shù)值。有趣的是，在經(jīng)治療小鼠中平均胰腺重量顯著更高(參見表4)，這意味著與低熱量飲食的組合治療可能已經(jīng)減慢了胰腺β細胞的退化，所述退化是C57BL/KsBom-db小鼠的特征。相反，在治療后喂以更豐富的標準Altromin 1314飲食的小鼠體重迅速增加，從而在5周觀察期結束時，在這組經(jīng)治療小鼠與對照小鼠之間，血清葡萄糖和甘油三酯數(shù)值沒有差異。
實驗2-討論在近交繁殖和遠交繁殖消瘦小鼠中研究了蘿芙木-橙植物藥的潛在毒性效應。除了在給藥藥物的第一天內(nèi)活動減慢，在單次給藥70倍人每日劑量時，在6周大的消瘦遠交繁殖NMRI小鼠或近交繁殖C57BL/6J小鼠中，在總反應和所監(jiān)測的參數(shù)中沒有顯著性差異。催吐蘿芙木具有強烈的鎮(zhèn)靜效應，被常規(guī)用于使精神病患者平靜下來(Sofowora(1982)Medicinal Plants and Traditional Medicine in Africa，Wiley&Sons，Winchester，pp 75-76)。因此，單次高劑量誘導的睡意可能來自由催吐蘿芙木部分貢獻的這些鎮(zhèn)靜化合物。但是，給11周大的C57BL/6J小鼠應用相同的劑量會產(chǎn)生更高的血清葡萄糖和更小的肝重量。血清葡萄糖仍然在正常范圍內(nèi)，在實驗組觀察到的更小肝重量暗示，盡管高劑量的提取物對較老的小鼠無毒，但它可能影響一些代謝過程，這些過程可能在更年輕的小鼠中不存在或不重要。
在6周治療期結束時，經(jīng)治療的db/db小鼠顯示出中等的體重損失并且血糖正常化。與治療前的狀態(tài)相比，在每周的葡萄糖耐受實驗中，對照和實驗小鼠都顯示出了改善。這暗示著葡萄糖清除的改善可能是由Altromin C1009飲食引起的熱量限制的結果。該飲食的熱量和營養(yǎng)學信息可在網(wǎng)址為altromin.de/cgi-bin/diets2.cgi？ansichtsid＝C10009&ansicht＝normal&diaetart＝diaetart＝sonder的網(wǎng)頁中獲得。比較可在網(wǎng)址altromin.de/cgi-bin/diets2.cgi？ansichtsid＝1320&ansicht＝normal&diaetart＝standard中獲得的標準Altromin 1320飲食。然而，經(jīng)治療小鼠的最終血清未禁食葡萄糖顯著更低。因此，除了僅僅由熱量限制獲得的結果以外，治療必然已經(jīng)改進了經(jīng)治療小鼠的胰島素敏感性。
由于小鼠沒有被喂以脂質補充劑，所以將治療db/db小鼠中血清甘油三酯的顯著增加解釋為由于內(nèi)部貯存的脂肪酸代謝的增加。這個假設受到治療小鼠眼睛內(nèi)脂肪酸沉積顯著減少的支持(參見圖10A)。已經(jīng)報道酸橙包含有助于體重損失和增加產(chǎn)熱的β拮抗劑。Preuss等人(2002)J.Med.33247-264。β拮抗劑在過氧化物酶體增殖劑激活的受試者(PPAR)上發(fā)揮作用，以減少肥胖動物體內(nèi)的血漿脂質和胰島素血癥。Grimaldi(2003)Biochem.Soc.Trans.311130-1132。PPAR是飲食脂肪和血清脂蛋白的分子審查員，它對于控制許多分子過程和代謝過程很重要，這些過程包括發(fā)展、增殖、分化和脂質動態(tài)平衡。該數(shù)據(jù)以及前面實驗1產(chǎn)生和報告的數(shù)據(jù)確實支持如下假設，即蘿芙木-橙治療能反轉糖尿病脂質動態(tài)平衡中的這種趨勢。脂肪酸從內(nèi)部沉積物中的釋放由甘油三酯脂酶介導。然后通過由蛋白激酶運行的cAMP刺激的磷酸化激活甘油三酯脂酶。然后通過血流，將所釋放的脂肪酸運輸?shù)浇M織中，通過線粒體中的β-氧化并借助于肉堿而被處理。盡管還沒有確定植物提取物中活性化合物的結構，但成功的治療對熱量限制的依賴將暗示，這種cAMP增加的狀況對基于蘿芙木-橙的植物藥的抗糖尿病效應是可能的設定。所提出的設定還符合對β拮抗劑影響體重損失和產(chǎn)熱提出的設定。Preuss等人(2002)J.Med.33247-264，該數(shù)據(jù)顯示在治療后，硬脂酰輔酶A去飽和酶活性顯著減少。
來自實驗1的結果顯示，II型糖尿病的幾個組織顯示缺乏長鏈多不飽和脂肪酸、二十二碳六烯酸。在用植物提取物治療遺傳糖尿病小鼠后，本研究所報告的Δ6去飽和酶活性的評估增加可能導致產(chǎn)生長鏈多不飽和脂肪酸，它對組織炎癥的正確響應和分辨很重要。如果相同的過程發(fā)生在人體內(nèi)，則它能夠解釋治療與治愈的關系，如在曾經(jīng)用過該藥物的尼日利亞糖尿病患者中報告的那樣。但是，眼中脂肪酸含量的減少對所有脂肪酸類別都是顯著性的。這意味著盡管亞油酸含量減少，同時Δ6去飽和酶活性的評估增加，但不存在長鏈PUFA的積累。事實上，在經(jīng)治療的動物體內(nèi)，存在顯著但較小的花生四烯酸減少。由于眼睛脂質沒有被分離成甘油三酯和磷脂部分，所以難以確定亞油酸的減少是否主要來自甘油三酸庫(triacylglyceric acid pool)。事實上，花生四烯酸部分缺少增加將支持如下假設，即亞油酸庫隨著所積累的MUFA而被動員。因此，考慮到實驗動物被喂以非常差的飲食，如果該治療與PUFA飲食補充組合，結果可能看起來不同。
當在治療后將動物在熱量限制下再保持5周的時間時，仍然存在脂質動員的證據(jù)，如通過增加的血清三甘油酯含量作出的判斷。有趣的是，這與該小鼠品種典型的“脆弱”db/db胰腺保護是一致的。
表4在6周的治療和C1009 Altromin飲食后，蘿芙木-橙提取物對近交繁殖糖尿病C57BL/Ks-db小鼠的身體和器官重量、血清甘油三酯、膽固醇、葡萄糖、胰島素和胰高血糖素的影響。將胰島素和胰高血糖素的數(shù)值分別表示為ng ml-1胰島素±SEM和pg ml-1胰高血糖素±SEM。突出了顯示對照和實驗小鼠之間存在顯著性差異的參數(shù)。*＝P＜0.5。
表5在治療后5周，給C57BL/Ks-db小鼠保持差C1009和更豐富的標準1314飲食，不進行其他藥物給藥，飲食對所述治療的“治愈效應”的影響。將胰島素和胰高血糖素的數(shù)值分別表示為ng ml-1胰島素±SEM和pg ml-1胰高血糖素±SEM。突出了顯示對照和實驗小鼠之間存在顯著性差異的參數(shù)。*＝P＜0.5。
實驗3人類研究在開始蘿芙木-橙治療時，“A”為72歲老年男性。在約9年前，即他在約63歲時視力混濁，然后被診斷為II型糖尿病。他接受3片格列吡嗪的每日劑量，以及用于高血壓的藥物。他的體重為91kg，登記的HbAlc 8.9(參考值4.2-6.3)、C-肽1.89nmol/1(參考值0.15-1.10)，未禁食的血糖為13.7％。
該患者不滿意他采用的抗糖尿病藥物，因為他感覺到昏睡和經(jīng)常的虛弱以及疲勞。A還難以保持體重。在開始治療前3天他停用格列吡嗪，在4個月內(nèi)每天服用750ml(即普通的飲用杯)蘿芙木-橙浸劑。他吃得很健康，避免富含脂肪的食物、糖和酒精。他每天監(jiān)測血糖和血壓。附圖10顯示在治療過程中A的血糖水平進程。
在服用藥物的最初2周結束時，他將鍛煉水平從每天和狗在公園散步2次增加到在公園里散步2次并慢跑3km。他報告了健康的感覺、更好的視力和靜脈中幾個結節(jié)的消失。他開始減少體重，在治療結束時體重78kg。在進入蘿芙木-橙治療2個月后，他的醫(yī)生允許他脫離高血壓藥物。他享受了美好的2002冬天至2003夏天，即在服用和停用藥物后一年。他連續(xù)鍛煉并保持健康的飲食，并且禁止飲酒，除了偶爾的一杯或兩杯酒。但是，存在輕微的缺點，因為他在2003年9月的最初2周登記了一些高血糖癥。他抱怨是由于暑假期間許多的社交活動。在2003年11月，他采用了兩周的蘿芙木-橙提取物治療。然后穩(wěn)定在體重75kg，在需要時每天服用一片格列吡嗪，在75歲仍然每天帶著狗進行每日3km的慢跑和散步。
上述結果顯示，如果結合鍛煉和限制熱量，所述藥物具有“治愈”的抗糖尿病效應。但是，如果患者不繼續(xù)實踐健康的生活方式，仍存在II型糖尿病復發(fā)的可能。
盡管為了清楚的理解，通過說明和示例詳述了上述發(fā)明，但本領域技術人員會明白，可實踐某些變化和修飾。因此，本說明書和實施例不應理解為限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍由所附權利要求書描繪。
附件權利要求
1.一種生物學活性組合物，其基本上由從催吐蘿芙木(Rauvolfiavomitoria)和酸橙(Citrus aurantium)中獲得的提取物組成。
2.權利要求1所述的提取物，其中所述提取物從催吐蘿芙木的葉部和/或根以及酸橙的果實中分離。
3.一種組合物，其包括權利要求1所述的提取物和載體。
4.權利要求3所述的組合物，除了所述提取物外，還包括有效量的試劑，所述試劑降低組織脂肪酸含量并降低血糖水平。
5.一種用于分離權利要求1所述的提取物的方法，所述方法包括過濾從煮沸的催吐蘿芙木葉部和酸橙果實中獲得的液體提取物。
6.一種用于治療或改善受試者中異常升高的組織脂肪酸含量和血糖水平的癥狀的方法，所述方法包括向所述受試者給藥有效量的權利要求1所述的組合物。
7.權利要求6所述的方法，其還包括減少所述受試者的每日熱量攝取。
8.權利要求6所述的方法，其中所述受試者中異常升高的血糖的癥狀選自II型糖尿病、異常的硬脂酰輔酶A去飽和酶活性、飲食過多、異常的脂質動員、受試者眼睛的異常脂肪酸譜、潰瘍和糖尿。
9.權利要求8所述的方法，其中所述受試者為動物。
10.權利要求9所述的方法，其中所述動物選自寵物、農(nóng)場動物或人類患者。
11.一種用于治療或改善與受試者中異常升高的血糖水平有關的病癥的癥狀的試劑盒，其包括治療有效量的權利要求1所述的提取物和使用說明。
12.權利要求11所述的試劑盒，其中所述病癥選自受試者中的血糖，選自II型糖尿病、異常的硬脂酰輔酶A去飽和酶活性、飲食過多、異常的脂質動員、受試者眼睛的異常脂肪酸譜、潰瘍和糖尿。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于從催吐蘿芙木的葉部(葉和莖)和/或根以及酸橙的果實中提取藥用活性部分的方法。在一方面，所述方法要求通過過濾催吐蘿芙木葉部和/或根以及酸橙果實的煮沸茶并濃縮上清液，從所述煮沸的茶中提取活性部分。在一個實施方案中，通過凍干上清液濃縮所述部分。通過向受試者給藥治療有效量的所述提取物或包含所述提取物的藥物組合物，所述部分用于治療與受試者中異常升高的葡萄糖水平相關的疾病。所述疾病包括但不限于II型糖尿病、異常的硬脂酰輔酶A去飽和酶活性、飲食過多、異常的脂質動員、受試者眼睛的異常脂肪酸譜、潰瘍和糖尿。
文檔編號A61P7/00GK101094683SQ200580045476
公開日2007年12月26日 申請日期2005年10月26日 優(yōu)先權日2004年10月29日
發(fā)明者J·坎貝爾－托夫特 申請人:J·坎貝爾－托夫特