專利名稱：新的g－csf軛合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)位點(diǎn)特異性的化學(xué)修飾。
背景技術(shù)：
粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)，是體內(nèi)粒細(xì)胞生成的主要調(diào)節(jié)因子，目前代表刺激粒細(xì)胞系增殖、分化和細(xì)胞存活的藥物活性蛋白質(zhì)。人類G-CSF是糖蛋白，大約20kDa大小，由骨髓中的巨噬細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生(Fibbe等人，1989 Interleukin 1 and poly(rI).poly(rC)induceproduction of granulocyte CSF，macrophage CSF，and granulocyte-macrophage CSF by human endothelial cells，Exp Hematol.，Mar 17(3)，229-34)，其首先由命名為5637的人類膀胱癌細(xì)胞系的條件培養(yǎng)液純化(Welte等人，1985，Purification and biochemical characterizationof human pluripotent hematopoietic colony-stimulating factor，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82，1526-1530)。編碼人類G-CSF的DNA序列的確定(開放狀態(tài)的日本專利申請(qǐng)KOHYO No.500636/88)使通過重組基因技術(shù)生產(chǎn)人類G-CSF成為可能。大腸桿菌(E.coli)表達(dá)的G-CSF不同于天然產(chǎn)物，因?yàn)樗鄙偬腔⑶译S著細(xì)菌表達(dá)伴有N-末端的蛋氨酰(Lu等人，1989，Disulfide and secondary structure ofrecombinant human granulocyte colony-stimulating factor，Arch.Biochem.Biophys 268，81-92)。
G-CSF的臨床應(yīng)用(綜述于Nemunaitis J.，1997，A comparativereview of colony-stimulating factor，Drugs 54，709-729；Welte K.等人，1996，F(xiàn)ilgrastim(r-metHuG-CSF)Thefirst 10 years，Blood88，1907-1929中)開始于1986年，在用化療治療的腫瘤病人中進(jìn)行首次臨床試驗(yàn)(Bronchud M.H.等人，1987，Phase I/II study ofrecombinant human granulocyte colony-stimulating factor inpatients receiving intensive chemotherapy for small cell lungcancer，Br.J.Cancer 56，809-813)，并且現(xiàn)在廣泛用于治療中性粒細(xì)胞減少癥。中性粒細(xì)胞減少癥發(fā)生在多種疾病背景中，包括先天缺陷、藥物處理后的骨髓抑制、和感染。這種疾患在經(jīng)歷細(xì)胞毒化療的癌癥病人中也發(fā)生。中性粒細(xì)胞減少癥能反過來引起通常需要住院的細(xì)菌感染和二次感染。G-CSF能縮短中性粒細(xì)胞減少癥的時(shí)期或一起預(yù)防之。在1991年，美國(guó)食品與藥物管理局批準(zhǔn)了Neopogen(Filgrastin，rh-met-huG-CSF)用于化療之中或之后遭受中性粒細(xì)胞減少癥的那些病人。用G-CSF治療能允許更高劑量強(qiáng)度的方案，其可能允許更好的抗腫瘤效果(Morstyn D.和Dexter T.M.，1994，Neupogen(r-metHuG-CSF)in Clinical Practice，Marcel Dekker，New York)。后來世界范圍批準(zhǔn)在骨髓移植中的應(yīng)用并且更近期對(duì)嚴(yán)重的慢性先天性中性粒細(xì)胞減少癥的治療。Neopogen在用于移植的外周血祖細(xì)胞的動(dòng)員中有潛在應(yīng)用(Herman等人，1996，Characterisation，formulation，and stabilityof Neupogen(Filgrastim)，a recombinant human granulocyte-colonystimulating factor.，Pharm Biotechnol.9，303-28)。
美國(guó)市場(chǎng)有80多種多肽藥，并且另外350種正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)。大約1/3在臨床試驗(yàn)中的候選藥品是多肽，但這些藥品通常體內(nèi)半衰期短。多種因素影響從循環(huán)系統(tǒng)除去肽，如蛋白裂解降解作用、腎臟過濾作用、以及免疫原性反應(yīng)和抗原性反應(yīng)。另外，多數(shù)多肽藥品必須通過注射遞送，或者皮下地或者靜脈地，并且通常低溶解性也可能是問題。
為克服這些不足，提議了一些方法，例如改變肽的氨基酸序列以降低被酶的降解和抗原性副作用，或者將它們與免疫球蛋白或白蛋白融合以改善半衰期，并且將它們摻入例如脂質(zhì)體的遞送載體。對(duì)于考慮G-CSF的，提交了開發(fā)這種方法的許多專利申請(qǐng)并且文章也發(fā)表了。我們引用在那些報(bào)道中基本序列中的變化美國(guó)專利No.5,214,132報(bào)道了人類G-CSF一種遺傳變異體，其在1、3、4、5和17位與天然rhG-CSF不同，其中替代了天然的G-CSF氨基酸，突變蛋白相應(yīng)替代為Ala、Thr、Tyr、Arg和Ser(參見Kuga等人1989，Mutagenesis of human granulocyte colony stimulating factor，Biochem.Biophys.Res.Commun.159，103-111)。
M.Okabe等人(In vitro and in vivo hematopoietic effect ofmutant human granulocyte colony-stimulating factor，1990，Blood75(9)May 1，1788-1793)報(bào)道rhG-CSF的一種衍生物，其中rhG-CSF的N-末端區(qū)的5個(gè)位點(diǎn)的氨基酸被替代，其在兩個(gè)分析中的小鼠和/或人的骨髓祖細(xì)胞中與完整的G-CSF相比顯示更高的特異活性。
美國(guó)專利No.5,218,092公布人類G-CSF一種遺傳變異體，其在1、3、4、5、17、145和147位與天然rhG-CSF不同，其中替代了天然的G-CSF氨基酸，突變蛋白相應(yīng)替代為Ala、Thr、Tyr、Arg、Ser、Asn和Ser。
WO 01/04329-A報(bào)道了一種rhG-CSF突變蛋白，其在1、2、3或17位與天然rhG-CSF不同。
WO 02/20766-A和02/20767-A公布了被組氨酸取代的G-CSF類似物的構(gòu)成。
WO 02/077034-A報(bào)道了有降低的免疫原性的修飾的G-CSF，通過移去一個(gè)或多個(gè)T-細(xì)胞表位或通過降低MHC同種異型的數(shù)量獲得。
用于降低蛋白清除率、增進(jìn)蛋白穩(wěn)定性或消除蛋白抗原性的替代方法是PEG化，其中蛋白質(zhì)通過使用聚(乙二醇)鏈被化學(xué)修飾。當(dāng)聚(乙二醇)(PEG)被合適地連接到多肽，它修飾其許多特征，同時(shí)例如酶活性或受體識(shí)別的許多生物功能可能被保留。PEG的軛合遮蓋了蛋白質(zhì)表面并且增加了多肽分子的大小，因此降低腎臟的超濾作用、阻止與抗體或抗原遞呈細(xì)胞的接觸并且減少被蛋白裂解酶的降解。最終，PEG將其物理化學(xué)的性質(zhì)傳遞給分子，并且因此也修飾肽和非肽藥物的生物分布和溶解性。對(duì)于PEG化的一般方法和結(jié)果的回顧參見以下的出版物和專利，當(dāng)然還有其它Davis等，美國(guó)專利No.4,179,337，Non immunogenic polypeptide，1977，其能被認(rèn)為是基礎(chǔ)；
Delgado C.等，1992，The uses and properties of PEG-linkedproteins，Crit.Rew.Ther.Drug Car.Sys，9(3，4)，249-304；Zalipsky S.，1995，Ad.Drug Del.Rev.Chemistry ofpolyethylene glycol conjugates with biologically active molecules16，157-182，其中描述了一批方法和突出的報(bào)道；F.M.Veronese，2002，Peptide and Protein PEGylationa reviewof problems and solutions，Biomaterials，1-13；F.M.Veronese和J.M.Harris edrs.，Ad.Drug Del.Rev.，Theme issue on″Peptideand Protein Pegylation I″，2002，54，453-606，其中報(bào)道了更多批的文章；Harris J.M.和Veronese F.M.edrs.，Ad.Drug Del.Rev.，Themeissue on″Peptide and Protein pegylation II-clinical evaluation″，2003.551259-1350)。
WO 995377公布了一種方法，用于制備PEG-INF β軛合物，其包括分步連接小PEG組成部份，隨后連接大PEG衍生物，并且允許修飾空間擁塞的干擾素位點(diǎn)。
其它討論蛋白質(zhì)PEG化方法的出版物為F.M.Veronese，2001，Peptide and protein PEGylation.A reviewof problems and solutions，Biomaterials，Vol 22(5)，405-417。
R.S.Goodson等，1990，Sitedirected PEGylation of recombinantinterleukin-2 at its glycosilation site，Biotecnology，Naturepublishing，Vol 8(4)，343-346。
關(guān)于這類技術(shù)也出版了書籍，當(dāng)然還有其它Poly(ethylene glycol)Chemistry and Biological Application，J.Milton Harris and Samuel Zalipsky edrs，1997，ACS Symposiumseries 680；Poly(ethylene glycol)chemistry，Biotechnical and BiomedicalApplications，J.M.Harris edr.，1992，Plenum Press；到目前，通過PEG化蛋白質(zhì)得到的好處是公認(rèn)的，例如在體內(nèi)延長(zhǎng)半衰期或降低免疫原性。已經(jīng)進(jìn)行了一些關(guān)于PEG化抗體以及抗體片段的研究，以在異種給藥時(shí)降低免疫原性。
一些其它的研究已經(jīng)顯示PEG化后的抗體或抗體片段生物分布的改變，其引起在腫瘤中更高的富集而在正常組織中沒有較高的水平，如由A.P.Chapman報(bào)道在A.D.D.R.，2002，PEGylated antibodies andantibody fragments for improved therapya review 54，531-545)中。
Schering-Plough已經(jīng)開發(fā)了通過連接12kDa單甲氧基聚乙二醇到干擾素α-2b(內(nèi)含子A)的新藥，其滿足了長(zhǎng)效干擾素α蛋白質(zhì)的需要同時(shí)提供顯著的臨床意義(Y.Wang，S.Youngster，M.Grace等人，2002，Structural and biological characterization of pegylatedrecombinant interferon alpha-2b and its implications，A.D.D.R.54，547-570)。
在文獻(xiàn)中也描述了命名為Peginterferon α-2a(40kDa)的連接大分子量PEG的干擾素，干擾素α-2a與40kDa的支鏈聚乙二醇部分連接，其顯示持續(xù)的吸收和減低腎臟清除作用，結(jié)果每周一次代替了每周兩次的劑量方案(K.R.Reddy，M.W.Modi，S.Pedder，2002，Use ofpeginterferon alpha-2a(40kDa)(Pegasys)for the treatment ofhepatitis C，A.D.D.R.54，571-586)。
美國(guó)專利No.4,766,106公布了應(yīng)用蛋白質(zhì)選擇性地連接水性聚合物(water polymer)的用于藥物組合物的蛋白質(zhì)增加的溶解性，所述水性聚合物選自聚乙二醇或聚氧乙二醇(polyoxyethylated polyols)。
在美國(guó)專利No.5,093,531和5,214,131中，發(fā)明人Sano等報(bào)道一種聚乙二醇衍生物能修飾肽中的胍基。
美國(guó)專利No.5,122,614公布了一種新形式的PEG(聚乙二醇-N-琥珀酰亞胺碳酸酯)，其在水性緩沖液中容易與蛋白質(zhì)的氨基反應(yīng)。
Harris等在美國(guó)專利No.5,252,714報(bào)道了用于軛合氨基的聚乙二醇丙醛的制備和使用。
歐洲專利申請(qǐng)0,236,987和0,539,167公布了使用新的PEG的亞胺酸酯(imidate)衍生物和其它水溶性聚合物修飾有自由氨基的蛋白質(zhì)、肽和有機(jī)化合物。
幾篇文章和專利是專門關(guān)于G-CSF及其PEG化的，在其中，Kinstler等在美國(guó)專利No.5,985,265中公布了用于蛋白質(zhì)N-末端修飾的新方法。通過使用還原的烷基化反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)終產(chǎn)物(與水溶性聚合物氨基連接的蛋白質(zhì))與相同的有酰胺鍵的聚合物-蛋白質(zhì)軛合物相比更加穩(wěn)定。在研究文章中，Kinstler等報(bào)道了連接rhG-CSF和聚乙二醇的定點(diǎn)方法(2002，Mono-N-terminal poly(ethylene glycol)-protein conjugates，A.D.D.R.54，477-485)。這樣的選擇性是通過在pH 5引導(dǎo)蛋白質(zhì)與PEG-丙醛的還原烷基化反應(yīng)而獲得的。作為使用rhG-CSF和rhMGDF的實(shí)施例子，顯示了使用這個(gè)方法以促進(jìn)這些蛋白質(zhì)的遞送特征和治療意義。
WO 9903887公布了通過定點(diǎn)誘變獲得的G-CSF的衍生物，其中在天然發(fā)生的蛋白質(zhì)的序列中引入半胱氨酸殘基。這些衍生物選擇性地PEG化。
WO 90/06952公布了應(yīng)用PEG鏈通過自由氨基或羧基對(duì)G-CSF進(jìn)行化學(xué)修飾。這樣的PEG修飾的G-CSF在體內(nèi)有更長(zhǎng)的半衰期，可能促進(jìn)從中性粒細(xì)胞減少癥的恢復(fù)并且它基本有相同的生物活性。
WO 00/44785報(bào)道rhG-CSF的軛合物有1-5個(gè)PEG鏈，其顯示改進(jìn)的性質(zhì)，包括超穩(wěn)定性、更強(qiáng)的溶解性、提高的循環(huán)半衰期和血漿滯留時(shí)間。
WO 90/06952公布了人類G-CSF的遺傳變異體，根據(jù)開放狀態(tài)的日本專利申請(qǐng)KOHYO No.500636/88中公布的方法制備，使用PEG化學(xué)修飾，其有基本相同的生物活性、在體內(nèi)有更長(zhǎng)的半衰期。而且觀察到這樣的G-CSF-PEG軛合物可能促進(jìn)從中性粒細(xì)胞減少癥的恢復(fù)。
WO 03/006501-A公布了氨基酸序列的至少一個(gè)氨基酸殘基與天然rhG-CSF不同的rhG-CSF，并且與至少一個(gè)非多肽部分連接。
WO 89/06546公布了CSF-1的遺傳變異體，其與聚乙二醇或聚丙二醇同聚物軛合，保持了生物活性并增加循環(huán)哺乳動(dòng)物的半衰期。
WO 90/06952報(bào)道了新的化學(xué)修飾的G-CSF，其或者通過氨基酸殘基的氨基基團(tuán)或者通過羧基基團(tuán)與聚乙二醇連接。
更多的具有不同結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的PEG-G-CSF軛合物公布于歐洲專利No.0,335,423。
其它多聚物修飾的G-CSF已經(jīng)公布于WO 02/20033和WO 02/20034中。
PEG 化的G-CSF也用于研究蛋白質(zhì)的不同給藥率，即肺部遞送。這報(bào)道于R.W.Niven等人，1994，Pulmonary absorption of polyethyleneglycolated recombinant human granulocyte-colony stimulatingfactor(PEG rhG-CSF)，J Controlled Release 32，177-189中。
最后，PEG-G-CSF的生物性質(zhì)被Satake-Ishikawa等人描述于1992，Chemical modification of recombinant human granulocytecolony-stimulating factor by polyethylene glycol increases itsbiological activity in vivo，Cell Struct Funct.17，157-160。
以上提及的G-CSF軛合物已經(jīng)通過軛合蛋白質(zhì)的氨基基團(tuán)獲得。到目前為止沒有通過-SH基團(tuán)的官能化制備衍生物，可能因?yàn)檫@樣的基團(tuán)嵌入蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)的內(nèi)部并且非常難接觸到。本發(fā)明已經(jīng)解決這樣的問題并且提供簡(jiǎn)單的方法，其提供具有高純度和生物活性的作為單一產(chǎn)物的G-CSF-PEG軛合物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公布解決與用于治療使用的合適G-CSF制劑的制備相關(guān)的問題的方法。本技術(shù)領(lǐng)域的專家非常清楚，關(guān)于G-CSF當(dāng)然還有其它的蛋白質(zhì)用于治療的應(yīng)用受限制于由于高清除率、蛋白裂解降解、和進(jìn)一步的免疫原性反應(yīng)的在體內(nèi)短的半衰期。
本發(fā)明的目標(biāo)是新的活性PEG-G-CSF軛合物，其中聚(乙二醇)(即PEG)的一條鏈通過天然蛋白質(zhì)Cys 17氨基酸殘基共價(jià)連接。能用于本發(fā)明目的的G-CSF分子可以是天然分子也可以是有N-末端蛋氨酰殘基的重組分子(非格司亭)。G-CSF的類似物能替代使用。本文中的類似物指保留天然發(fā)生蛋白質(zhì)的大部分主要結(jié)構(gòu)并維持其生物活性的產(chǎn)物。優(yōu)選地這些類似物能通過重組技術(shù)生產(chǎn)，用其它氨基酸替代人類序列的一個(gè)或多個(gè)氨基酸而產(chǎn)生。它們被通常稱為突變蛋白。
本發(fā)明進(jìn)一步的目標(biāo)是軛合PEG到生物活性蛋白質(zhì)的新方法。專家已知多數(shù)PEG軛合物的應(yīng)用與不穩(wěn)定的分子有關(guān)，例如多肽或蛋白質(zhì)，所以軛合反應(yīng)必須要求溫和的化學(xué)條件。蛋白質(zhì)中適合多聚物軛合的最通常的反應(yīng)基團(tuán)是賴氨酸的ε氨基基團(tuán)和N-末端氨基酸的α氨基基團(tuán)。因?yàn)樽杂尚问降腘-末端的氨基或賴氨酸在目前任何給出的蛋白質(zhì)或肽中幾乎總是存在的，其中包括G-CSF，并且因?yàn)樗鯪-末端的氨基和賴氨酸容易反應(yīng)，所以PEG被最經(jīng)常地通過這些氨基基團(tuán)與蛋白質(zhì)軛合。實(shí)際上，WO 00/44785公布了G-CSF-PEG軛合物，其有連接在賴氨酸或NH2末端殘基的PEG鏈。這種軛合對(duì)存在4賴氨酸(Lys 16，Lys 23，Lys 34，Lys 40)、一個(gè)α末端自由氨基基團(tuán)的G-CSF是可能的并且它們?nèi)靠捎糜诮佑|水溶液。在報(bào)道的實(shí)例中，由于PEG連接在不同的位點(diǎn)，共軛混合物提供為蛋白質(zhì)種類的多種性，必須通過分離和鑒定以用于有利益的應(yīng)用。為克服軛合物的多種性的問題，一些作者利用賴氨酸ε-氨基在pH 8以上是好的親核體，因?yàn)樗膒Ka大約為9.5，而N-末端氨基酸的α氨基基團(tuán)比賴氨酸堿性弱并且也在更低的pH反應(yīng)的事實(shí)。反應(yīng)的pH因此是關(guān)鍵以獲得軛合物的選擇性并隨后得到簡(jiǎn)化的產(chǎn)物混合物。
在美國(guó)專利No.5,985,265中，這種性質(zhì)被開發(fā)，并且使用在pH 5周圍的反應(yīng)優(yōu)先地修飾N-末端氨基酸殘基的化學(xué)方法被公布。在這個(gè)實(shí)例中，雖然反應(yīng)是不完全的并且賴氨酸氨基基團(tuán)也可能反應(yīng)，盡管以相對(duì)非常低的程度，但是反應(yīng)是優(yōu)先地針對(duì)N-末端殘基。獲得的混合物因此必須被純化以達(dá)到所要的產(chǎn)物的均一性。
在蛋白質(zhì)中另一種重要的潛在活性殘基是巰基，其對(duì)多種巰基活性PEG是非?；钚缘?，所述巰基活性PEG例如單甲氧基-PEG-馬來酰亞胺(m-PEG-馬來酰亞胺)、m-PEG-鄰-二硫化吡啶、m-PEG-乙烯砜，其根據(jù)文獻(xiàn)中已知的方法反應(yīng)[Veronese F(2001)Peptide and proteinPEGylationa review of problems and solutions.Biomaterials 22，405-417；Roberts MJ等人(2002)Chemistry for peptide and proteinPEGylation.Adv.Drug Deliv.Rev.54，459-476]。
幾篇文獻(xiàn)描述了在半胱氨酸殘基上特定的PEG化(Cantin AM等人，2002，Polyethylene glycol conjugation at Cys232 prolongs thehalf-life of alpha 1 proteinase inhibitor.Am J Respir Cell MolBiol.27(6)659-65；Leong SR等人，2001，Adapting pharmacokineticproperties of a humanized anti-interleukin-8 antibody fortherapeutic applications using site-specific PEGylation Cytokine.16(3)106-19；Collen D等人，2000，Polyethyleneglycol-derivatized半胱氨酸-substitution variants ofrecombinant staphylokinase for single-bolus treatment of acutemyocardial infarction.Circulation 102(15)1766-72；Goodson RJ等人，1990，Site-directed PEGylation of recombinant interleukin-2at its glycosylation site Biotechnology 8(4)343-6；Paige等人Prolonged circulation of recombinant human granulocyte-colonystimulating factor by covalent linkage to albumin through aheterobifunctional polyethylene glycol，Pharmaceutical Research，Vol.12，No.12，1995)。
不幸地，在蛋白質(zhì)中半胱氨酸殘基很少以自由的形式存在，并且進(jìn)一步它們通常在胱氨酸中以二硫化物存在，當(dāng)半胱氨酸殘基是自由時(shí)，它們經(jīng)常包含在分子的活性區(qū)域。進(jìn)一步它們經(jīng)常處在難以接觸的分子區(qū)域中。例如它們被包埋在狹窄的疏水縫隙中，并且只是部分暴露于溶劑。這樣使這些殘基被化學(xué)地遮蔽，其意味它們?cè)谔烊粭l件下反應(yīng)很慢或有很低的產(chǎn)量。
在rhG-CSF主要的序列中有5個(gè)Cys，它們中4個(gè)參與2個(gè)二硫鍵(Cys 36-Cys 42，Cys 64-Cys 74)，但幸運(yùn)地一個(gè)Cys 17是自由的。Arakawa等人1993年報(bào)道Cys17在天然的構(gòu)象下不被親水劑、碘乙酸接觸而羧甲基化，但當(dāng)rhG-CSF變性時(shí)它變成完全活性的。在其它實(shí)驗(yàn)中，自由硫氫基(sulphydryl)已顯示在非變性的條件下與疏水修飾劑二硫代雙硝基苯甲酸(DTNB)反應(yīng)很慢。從這些實(shí)驗(yàn)和從通過NMR估計(jì)的三維結(jié)構(gòu)，假設(shè)自由半胱氨酸停留在分子的疏水環(huán)境內(nèi)部并且因此不被通過親水烷化劑的化學(xué)修飾接觸，而更易被疏水劑接觸。G-CSF的構(gòu)象研究實(shí)際上顯示17位的-SH在蛋白質(zhì)的疏水口袋中，只是部分暴露于溶劑。另外，Wingfield等人(1988，Characterization of recombinant-derivedgranulocyte-colony stimulating factor(G-CSF)，Biochem J.Nov 15；256(1)，213-8)發(fā)現(xiàn)在17位Cys到Ser的取代沒有引起可察覺到的蛋白質(zhì)的物理或生物性質(zhì)的改變。
發(fā)明人目前發(fā)現(xiàn)特定地在Cys17的巰基基團(tuán)軛合用于生產(chǎn)G-CSF軛合物的方法。
所述方法包括以下步驟i)使G-CSF蛋白經(jīng)受誘導(dǎo)蛋白質(zhì)可逆變性的條件，ii)在變性的條件下，步驟i)中得到的變性蛋白質(zhì)與巰基活性PEG的軛合，iii)使步驟ii)中得到的軛合物經(jīng)受促進(jìn)軛合物復(fù)性和出產(chǎn)期望的軛合物的條件。
發(fā)明人報(bào)道的生物實(shí)驗(yàn)顯示根據(jù)上述方法制備的PEG-G-CSF軛合物在細(xì)胞增殖測(cè)試中保持生物活性。
步驟(i)的可逆變性是在一種或多種變性劑存在下實(shí)施的，所述變性劑例如，尿素、鹽酸胍(guanidine chloride)或異硫氰酸酯、二甲基-尿素、高中性鹽濃度和溶劑(例如乙腈、醇、有機(jī)酯、二甲亞砜)。對(duì)于可逆化學(xué)變性，其指一種過程，在其中蛋白質(zhì)在變性時(shí)失去其天然結(jié)構(gòu)和功能，然而當(dāng)除去變性劑時(shí)，或者結(jié)構(gòu)或者功能性質(zhì)恢復(fù)。在這樣的變性劑存在下，蛋白質(zhì)伸展并且17位Cys的巰基基團(tuán)暴露并且變成功能化接觸得到的。變性的過程能通過遠(yuǎn)UV-CD光譜監(jiān)控。變性劑的量能根據(jù)使用的變性劑由技術(shù)人員選擇。變性劑能是尿素、鹽酸胍、異硫氰酸酯或二甲基-尿素，并且這樣的變性劑優(yōu)選地在大于2M的濃度，優(yōu)選地大于3M，并且甚至更優(yōu)選地2-4M。例如在鹽酸胍的情況下，鹽酸胍的濃度優(yōu)選地大于2M，并且優(yōu)選地大于3M，并且甚至更優(yōu)選地4-6M。
在步驟ii)中得到的伸展蛋白質(zhì)維持在變性的條件，與活性PEG反應(yīng)，其對(duì)于巰基基團(tuán)有特定的反應(yīng)性“巰基反應(yīng)性PEG”。
巰基反應(yīng)性PEG對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是已知的；優(yōu)選的是二硫鄰位吡啶(orthopyridyl disulphide)、乙烯砜、N-馬來酰亞胺、碘乙酰胺。
PEG能是直鏈或支鏈的，并且可以有800-80,000Da并且優(yōu)選地5,000-40,000Da的分子量。
雙官能化的PEG可以使用，例如OPSS-PEG-OPSS；VS-PEG-VS；VS-PEG-OPSS，MAL-PEG-MAL，MAL-PEG-OPSS，MAL-PEG-VS。
反應(yīng)的完全性能通過例如HPLC的普通分析方法測(cè)定，或通過比色實(shí)驗(yàn)監(jiān)視巰基的存在。
當(dāng)步驟(ii)完成時(shí)，軛合物能被引導(dǎo)再折疊，由暴露它于根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法的復(fù)性條件，例如公布于Mechanisms of protein folding，Pain RH(edt.)，IRL-Press，Oxford U.K.，1994中和Middelberg APJ.Preparative protein refolding.Trends Biotechnol.20，437-443，2002中(在此并入作為參考)，產(chǎn)生原始的α-螺旋結(jié)構(gòu)。
典型的方法包括通過透析、超濾、色譜方法去除變性劑。用于步驟i、ii、iii的pH和溫度能由技術(shù)人員選擇并且可以根據(jù)使用的反應(yīng)物、活化的多聚物的類型和其分子量而變化。
條件和試劑必須選定以避免不可逆的變性或半胱氨酸-S-S-鍵的斷裂。
優(yōu)選溫和的pH，例如4-10，更優(yōu)選地6-8，并且更優(yōu)選地接近中性。
低溫也是優(yōu)選的，0-30℃，盡管對(duì)于高M(jìn)W的PEG(多聚物)的軛合，如果高溫被使用(例如40℃)，能獲得高產(chǎn)量。
對(duì)技術(shù)人員，清楚的是，以上所述軛合的方法能用于制備包含″隱藏的″半胱氨酸基團(tuán)的任何蛋白質(zhì)的軛合物。
該方法的第一步優(yōu)選地在5℃-50℃之間的溫度下進(jìn)行，優(yōu)選地在20℃-40℃之間的溫度下進(jìn)行。
復(fù)性可以通過透析、超濾、色譜或稀釋方法除去變性劑而獲得。
如在此報(bào)道的，用生產(chǎn)單官能化的蛋白質(zhì)的方法進(jìn)行的，G-CSF與具有巰基反應(yīng)性PEG的成功軛合，對(duì)已知的和大大開發(fā)PEG化的技術(shù)和生物優(yōu)勢(shì)開辟了道路。
提出的方法允許得到具有分子量很大增長(zhǎng)的產(chǎn)物，并且更重要地，在分子的大的水動(dòng)力學(xué)體積有很大增長(zhǎng)。
如已知的，PEG的水動(dòng)力學(xué)體積相應(yīng)于大約3-4倍來自它重量的期望，并且因此具有5000、10000和20000Da的PEG的軛合物，如本專利在實(shí)施例中描述的，相應(yīng)于大約40000、50000和60000Da的蛋白質(zhì)的體積。有這樣體積的產(chǎn)物已知克服了腎小球過濾的閾值，并且期望由此顯著增加在血液中的滯留時(shí)間。
因此，本專利申請(qǐng)公布了一種藥物組合物，其包括如上述描述制備的軛合物，用于口、注射、鼻、肺或栓劑或經(jīng)皮膚的應(yīng)用。
在此報(bào)道的巰基軛合步驟，其開發(fā)用于軛合可逆變性以暴露半胱氨酸殘基的SH基團(tuán)(在G-CSF情況中為序列中的17號(hào)殘基)，與以往報(bào)道的技術(shù)相比更方便，并且其是基于氨基基團(tuán)的修飾。實(shí)際上，在氨基基團(tuán)的修飾中，如果通過降低pH到只是靶向α氨基酸殘基來增加反應(yīng)的特異性，通常也獲得多重產(chǎn)物。在氨基基團(tuán)的修飾中得到的產(chǎn)物，之后必須通過耗時(shí)的過程適當(dāng)?shù)胤指詈图兓⑶覔p失產(chǎn)物。
在此提出的方法可能容易地放大并且僅需要幾步以獲得終產(chǎn)物i.在變性溶液中溶解，ii.加入粉末形式的活性PEG，iii.除去變性劑并且通過透析或柱層析使蛋白質(zhì)重折疊。
可選地，變性劑(即鹽酸胍、尿素或其它變性劑)可被加入蛋白質(zhì)的水性溶液，伴隨著在步驟ii中加入活化的PEG。變性劑能是尿素、鹽酸胍、異硫氰酸酯或二甲基-尿素，并且這樣的變性劑優(yōu)選地在大于2M的濃度，優(yōu)選地大于3M，并且甚至更優(yōu)選地2-4M。例如在鹽酸胍的情況下，鹽酸胍的濃度優(yōu)選地大于2M，并且優(yōu)選地大于3M，并且甚至更優(yōu)選地4-6M。
眾所周知的是，在蛋白質(zhì)PEG軛合中的通常問題在于在酶的情況下催化活性的丟失，或在例如細(xì)胞因子的配基修飾的情況中的識(shí)別的丟失。作為典型的例子，在軛合后α-干擾素的活性發(fā)生幾倍的降低。
我們的G-CSF巰基修飾發(fā)現(xiàn)不是這樣的情況。最可能地這種積極的行為是與通過我們技術(shù)獲得的單點(diǎn)粘附有關(guān)，到達(dá)遠(yuǎn)離識(shí)別位點(diǎn)的蛋白質(zhì)的三維排列中的SH位置。我們的軛合物的原始生物活性的維持用NFS-60細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)中檢測(cè)。具有G-CSF受體的數(shù)量過表達(dá)和生長(zhǎng)的細(xì)胞與細(xì)胞因子的濃度成比例。表示為EC50即刺激50％最大生長(zhǎng)的濃度的G-CSF活性，與一種天然蛋白質(zhì)很相似，如在實(shí)施例中和在圖n10中舉例說明的。
在本發(fā)明的另一方面，雙官能活性PEG衍生物(OPSS-PEG-OPSS；VS-PEG-VS；VS-PEG-OPSS，MAL-PEG-MAL，MAL-PEG-OPSS，MAL-PEG-VS)可用于產(chǎn)生二聚G-CSF(即G-CSF-PEG-G-CSF)，在其中兩個(gè)G-CSF單體在Cys17的巰基基團(tuán)通過PEG連接在一起。這樣獲得的二聚體的體外活性與那些相應(yīng)的G-CSF的PEG形式相當(dāng)。這些二聚體的主要優(yōu)勢(shì)是由于它們?cè)黾拥姆肿淤|(zhì)量而減少的體內(nèi)清除率(如果與相應(yīng)的G-CSF的PEG形式相比)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1通過直接PEG化將5kDa PEG軛合到rhG-CSF的制備用5kDa甲氧-PEG-鄰位吡啶-二硫化物修飾G-CSF在2ml的緩沖液中(0.5M Tris，pH 7.2)，甲氧-PEG-鄰位吡啶-二硫化物(1.81mg，0.360μmol)被加入到0.67mg，0.0356μmol的rhG-CSF，反應(yīng)物對(duì)rhG-CSF的摩爾比例10/1。允許反應(yīng)在室溫進(jìn)行幾個(gè)小時(shí)，以達(dá)到PEG-G-CSF軛合物穩(wěn)定地形成，如通過HPLC和SDS-PAGE證實(shí)的(參見以下)。
PEG-OPSS G-CSF軛合物的鑒定1.DTNB比色分析(Ellman)Ellman反應(yīng)物，5，5′-二硫代雙(2硝基苯甲酸)(DTNB)允許估算在蛋白質(zhì)和其它生物系統(tǒng)中的自由巰基。分析的敏感性歸于2-硝基-5-硫代苯甲酸陰離子的高分子吸收系數(shù)，其與來自硫醇陰離子與DTNB的反應(yīng)的混合的二硫化物一起產(chǎn)生(Habeeb A.F.S.A.，1972，Reaction ofprotein sulphydryl group with Ellman′s reagent，Methods inEnzymology 25，457-464)。以這種方式可能確定在天然或軛合物蛋白質(zhì)中硫氫基團(tuán)的百分比，并且以此知道修飾的量。
2.SDS-PAGErhG-CSF衍生物的量通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳定量評(píng)價(jià)。具有低度交聯(lián)的膠(60％丙烯酰胺，0.8％雙丙烯酰胺)被使用以允許軛合物遷移。在不同時(shí)間分析反應(yīng)混合物。
通過考馬斯藍(lán)染色觀察到的蛋白質(zhì)揭示少量新的高分子量蛋白質(zhì)種類的存在，相應(yīng)于5kDa PEG-OPSS鏈連接到rhG-CSF，并與起始材料未反應(yīng)蛋白質(zhì)的主要點(diǎn)(major spot)在一起。參見圖1b。
3.RP-HPLC C4反應(yīng)混合物根據(jù)以下的洗脫條件用C4 Vydac柱通過反相HPLC分析。洗脫劑A，0.05％TFA于水中，和洗脫劑B，0.05％TFA在乙腈中。以下的線性梯度被使用40％B使用4分鐘，18分鐘后升到70％B，2分鐘后95％B，在95％B中放置6分鐘并且然后放置在40％B 2分鐘。流為0.8ml/min并且UV燈在226nm。反應(yīng)的時(shí)間過程顯示有限量的軛合物的形成而大部分蛋白質(zhì)沒有被修飾洗脫了。參見圖1a。
用5kDa甲氧基-PEG-乙烯砜修飾G-CSF在6ml緩沖液中(0.5M Tris，pH 7.2)，甲氧基-PEG-乙烯砜(5.29mg，1.058(mol)加入到2.18mg，0.116(mol的rh G-CSF，反應(yīng)物對(duì)rhG-CSF的摩爾比例10/1。反應(yīng)被允許在室溫進(jìn)行幾個(gè)小時(shí)，以達(dá)到PEG-G-CSF軛合物穩(wěn)定的形成，如通過HPLC和SDS-PAGE證實(shí)的(參考以下)。在圖2a或b中反應(yīng)混合物在不同時(shí)間的HPLC關(guān)系圖和SDS-PAGE。圖形顯示G-CSF的軛合但只是發(fā)生在很有限的程度，雖然反應(yīng)進(jìn)行了幾個(gè)小時(shí)。
實(shí)施例2rhG-CSF的可逆變性在0.1M、pH 7.27的磷酸緩沖液中的8M鹽酸胍以不同的量加入rh-GCSF緩沖液以達(dá)到終濃度2，4 e 5摩爾。在室溫孵育4小時(shí)后，混合物對(duì)水性酸溶液透析，以除去變性劑并且達(dá)到pH 3.5的G-CSF的穩(wěn)定條件。
圖3報(bào)道起始蛋白質(zhì)和在變性-復(fù)性過程后的CD光譜。二級(jí)結(jié)構(gòu)的恢復(fù)是從治療前和后220-208nm橢圓率證明的。以下的實(shí)驗(yàn)顯示G-CSF可經(jīng)受變性并且復(fù)性到原來的結(jié)構(gòu)。
實(shí)施例3在變性條件下通過巰基反應(yīng)物制備5kDa的PEG rhG-CSF5kDa PEG-OPSS和PEG-VS與rhG-CSF的軛合3apH 7.2的Tris 0.5M，6M尿素被加入G-CSF緩沖溶液以達(dá)到3M尿素的終濃度。mPEG-OPSS或mPEG-VS被以每摩爾蛋白質(zhì)10摩爾反應(yīng)物的摩爾比例加入這種溶液。反應(yīng)被允許在室溫進(jìn)行6小時(shí)并且通過加入0.1 N HCl終止。
3bG-CSF被加入pH 7.27，0.1M的磷酸緩沖液中的8M鹽酸胍的溶液，以獲得終變性濃度2、4、6M。變性的G-CSF被加入PEG-OPSS或PEG-VS溶液以達(dá)到每摩爾蛋白質(zhì)10摩爾反應(yīng)物的摩爾比例。在室溫4小時(shí)后，反應(yīng)被用0.1N的HCl終止。
實(shí)施例45kDa PEG軛合到rh-G-CSF的鑒定1.RP-HPLC色譜反應(yīng)混合物通過反相HPLC分析，根據(jù)以下的洗脫條件使用C4 Vydac柱。洗脫劑A，0.05％TFA于水中，和洗脫劑B，0.05％TFA在乙腈中。以下的線性梯度被使用40％B使用4分鐘，18分鐘后升到70％B，2分鐘后95％B，在95％B中放置6分鐘并且然后2分鐘后放置在40％B。流為0.8ml/min并且UV燈在226nm。
圖4A顯示天然G-CSF的色譜。圖4B顯示使用尿素作為變性劑的軛合物(PEG-OPSS)的形成。圖4C、D、E顯示在不同反應(yīng)條件下軛合物(OPSS)的形成，即在圖4C中鹽酸胍的量為2M，在4D中4M，和在4E中6M。如可能在圖4C-E中看到的，軛合物的百分比隨胍的濃度而增長(zhǎng)。圖5B、C、D顯示相應(yīng)地與圖5C、D、E相同條件(胍的濃度)下軛合物(PEG-VS)的形成。
選擇的最好條件為4M胍，因?yàn)樗砹嗽诋a(chǎn)量修飾和溫和變性條件之間好的折衷。
反應(yīng)的時(shí)間過程顯示有限量軛合物的形成而大部分蛋白質(zhì)沒有修飾洗脫了。
2.天然G-CSF和使用HPLC色譜從反應(yīng)混合物分離的G-CSF-PEG-OPSS(5kDa)軛合物的MALDI-TOF質(zhì)譜。
圖6A(天然G-CSF)報(bào)道在18.930Da峰，其對(duì)應(yīng)天然G-CSF的分子量。圖6B(PEG化G-CSF)報(bào)道在24.711Da的峰，其對(duì)應(yīng)天然G-CSF結(jié)合單鏈PEG-OPSS(5kDa)的分子量。
圖7(G-CSF的反應(yīng)混合物)報(bào)道在24.583Da的峰，其對(duì)應(yīng)天然G-CSF結(jié)合單鏈PEG-VS(5kDa)的分子量。
3.天然G-CSF和G-CSF-PEG軛合物的遠(yuǎn)紫外線圓二色光譜(Far-ultraviolet Circular Dichroism spectra)。
CD光譜在25℃、在蛋白質(zhì)濃度大約0.1mg/ml、使用0.1cm通道長(zhǎng)度石英管被記錄在Jasco Model J-700分光旋光計(jì)上。
圖8A報(bào)道天然G-CSF和G-CSF-PEG-OPSS軛合物的遠(yuǎn)-UV CD光譜。這些光譜典型地是具有最小橢圓率在208和222nm的α-螺旋多肽。天然和軛合物蛋白質(zhì)之間α-螺旋百分?jǐn)?shù)的不同應(yīng)歸于聚集問題，其能扭曲蛋白質(zhì)濃度以及光譜的標(biāo)準(zhǔn)化。圖8B報(bào)道G-CSF和G-CSF-PEG-VS軛合物的遠(yuǎn)-UV CD光譜。在這種情況，天然和軛合物蛋白質(zhì)之間二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化更明顯。
4.熒光發(fā)射的研究天然G-CSF和G-CSF-PEG-OPSS軛合物以及G-CSF-PEG-VS軛合物的熒光光譜被在25℃記錄在Perkin Elmer LS-50上，在295nm激發(fā)樣品(1.3μM)并且在波長(zhǎng)范圍303-500nm中記錄發(fā)射熒光。在加入陰性(NaI)和陽性(CsCl)猝滅劑后在相同的條件記錄光譜。天然和軛合物的熒光光譜是在發(fā)射波長(zhǎng)中只對(duì)于5nm藍(lán)移(從350到345nm)的不同，對(duì)于在熒光團(tuán)(fluorofore)曝光給溶劑中的變化的顯示是太小了。熒光團(tuán)(Trp 59，Trp 119)在周圍有極性，并且所以可能在天然和共軛蛋白質(zhì)的情況下都暴露于溶劑。圖9A-B報(bào)道對(duì)天然G-CSF、G-CSF-PEG-OPSS和G-CSF-PEG-VS使用CsCl(A)和NaI(B)的猝滅實(shí)驗(yàn)。這些研究揭示在天然和軛合物蛋白質(zhì)中Trp的溶劑可及性(solvent accessibility)小的變化，變化很可能由于Trp周圍PEG鏈的存在。
實(shí)施例5在變性條件下通過巰基反應(yīng)物軛合10kDa PEG到rhG-CSF的制備5a.1.5ml的rhG-CSF(1.46mg/ml)被加入1.5ml pH 7.2磷酸緩沖液中的6M鹽酸胍溶液。在這樣的溶液以每摩爾rhG-CSF對(duì)10摩爾多聚物的摩爾比例加入mPEG-OPSS或mPEG-VS(10kDa)。反應(yīng)混合物允許在室溫氬大氣中進(jìn)行20小時(shí)，并且反應(yīng)用0.1M的HCl終止。
5b軛合物的鑒定通過RP-HPLC色譜(圖11)和遠(yuǎn)-UV CD光譜(圖13)實(shí)現(xiàn)。RP-HPLC使用C4 Phenomenex柱進(jìn)行。
實(shí)施例6在變性條件下通過巰基反應(yīng)物(mPEG-OPSS和mPEG-VS)軛合20kDa PEG到rhG-CSF的制備6a.1.5ml的rhG-CSF(1.46mg/ml)被加入1.5ml pH 7.2磷酸緩沖液中的6M鹽酸胍溶液。在這樣的溶液以每摩爾rhG-CSF對(duì)10摩爾多聚物的摩爾比例加入mPEG-OPSS或mPEG-VS(20kDa)。
反應(yīng)混合物允許在40℃進(jìn)行1小時(shí)，并且然后在室溫另外進(jìn)行4小時(shí)。反應(yīng)用0.1M的HCl終止。
6b軛合物的鑒定通過RP-HPLC色譜(圖12)和遠(yuǎn)-UV中的CD光譜(圖13)實(shí)現(xiàn)。
實(shí)施例7在變性條件下通過巰基反應(yīng)物(mPEG-MAL)軛合20kDa PEG到rhG-CSF的制備溶液A制備加入到pH 7.2有0.5M Tris-HCl的3mg/ml rhG-CSF溶液緩沖液(溶液A)溶液BmPEG-馬來酰亞胺溶于6M鹽酸胍溶液，用Tris-HCl(0.5M)緩沖至pH 7.2，以獲得30mg/ml(PEG-Mal)的終濃度。
6ml的溶液A和6ml的溶液B混合，并且所得的混合物被允許在室溫下反應(yīng)1小時(shí)(摩爾比例rhG-CSF/PEG-Mal＝1∶10)。PEG化的產(chǎn)量高于95％。
圖14顯示天然rhG-CSF(圖14A)和室溫1小時(shí)后的那些反應(yīng)混合物(圖14B)的RP-HPLC色譜。
實(shí)施例8體外在NFS-60細(xì)胞中的細(xì)胞增殖活性生物分析基于rhG-CSF對(duì)敏感細(xì)胞系增殖的刺激作用的評(píng)價(jià)，所述敏感細(xì)胞系源于具有G-CSF受體的小鼠原始粒細(xì)胞白血病NFS-60細(xì)胞。蛋白質(zhì)結(jié)合到細(xì)胞引起指數(shù)生長(zhǎng)反應(yīng)，并且發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的終濃度與細(xì)胞培養(yǎng)液中存在的G-CSF的濃度成比例。應(yīng)用劑量-反應(yīng)比例，這允許G-CSF樣品的生物潛能與標(biāo)準(zhǔn)或參考制備物對(duì)比的量化。為了測(cè)試，NFS-60細(xì)胞被維持于添加5％胎牛血清、4mM谷氨酰胺和rhG-CSF終濃度18.000IU/ml的培養(yǎng)液中懸浮培養(yǎng)。在每個(gè)實(shí)驗(yàn)前，細(xì)胞在冰冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)中洗3次，并且再懸浮于分析培養(yǎng)液中(2.5％胎牛血清，4mM谷氨酰胺)以除去生長(zhǎng)培養(yǎng)液中包含的rhG-CSF。在我們的情況，G-CSF和PEG軛合物的溶液被在分析培養(yǎng)液中系列稀釋，以重復(fù)(duplicate)的形式(每個(gè)50μl)轉(zhuǎn)移到96孔板，并且與等體積的事先洗過的細(xì)胞懸浮物混合以到達(dá)1.0×105細(xì)胞/ml的終密度。然后，板在加入10μl的MTT溶液(100mg MTT加入20ml無菌溫?zé)岬腜BS)之前在37℃、CO2中孵育72小時(shí)。反應(yīng)被允許在37°、CO2恒溫箱中進(jìn)行4小時(shí)?；罴?xì)胞的微粒體脫氫酶將甲 鹽MTT((3[4，5二甲基噻唑(Dimethylthyazol)-2-基]-2，5聯(lián)苯四氮唑溴(diphenyltetrasolium bromide)變成藍(lán)色晶體。Tris晶體用0.01 N HCl中15％SDS的溶液100μl溶解。在570nm的吸收率直接與活細(xì)胞的數(shù)量成比例。
G-CSF和軛合物作為刺激因子的活性，從活性圖線(圖10)計(jì)算為EC50值，報(bào)道于以下的表中。

EC50值(pmol/mL)是相對(duì)于最大細(xì)胞生長(zhǎng)促進(jìn)50％細(xì)胞生長(zhǎng)的rh-G-CSF的量。所以EC50值越低rhG-CSF活性越高?？紤]到方法的精確性，能認(rèn)為rhG-CSF-PEG-OPSS的活性與天然rhG-CSF幾乎一樣。


圖1a使用C4 VIDAC柱的RP-HPLC色譜。天然G-CSF(A)；在生理?xiàng)l件中、在反應(yīng)時(shí)間0.5、3.5、28h(B、C、D)的G-CSF和PEG-OPSS(5kDa)的反應(yīng)混合物；1b天然G-CSF(泳道1)和在生理?xiàng)l件中、在反應(yīng)時(shí)間0.5、2.5、3.5、6、28、51h(泳道2-7)的G-CSF PEG-OPSS軛合物的SDS-PAGE分析。
圖2a使用C4 VIDAC柱的RP-HPLC色譜。天然G-CSF(A)；在反應(yīng)28小時(shí)后生理?xiàng)l件中的G-CSF和PEG-VS(5kDa)的反應(yīng)混合物(B)；2b天然G-CSF(泳道1)和在生理?xiàng)l件中、在反應(yīng)時(shí)間0.5、2.5、3.5、6、28、51h(泳道2-7)的G-CSF PEG-VS軛合物的SDS-PAGE分析。
圖3在標(biāo)準(zhǔn)條件中和在通過鹽酸胍進(jìn)行變性-復(fù)性后天然G-CSF的遠(yuǎn)UV-CD光譜。光譜在25℃、pH 3.5的酸性溶液中獲得。
圖4使用C4 VIDAC柱的RP-HPLC色譜。天然G-CSF(A)；3M尿素存在下的G-CSF和PEG-OPSS(5kDa)的反應(yīng)混合物(B)；2、4、6M鹽酸胍存在下的G-CSF和PEG-OPSS(5kDa)的反應(yīng)混合物(C、D、E)。
圖5使用C4 VIDAC柱的RP-HPLC色譜。天然G-CSF(A)；2、4、6M鹽酸胍存在下的G-CSF和PEG-VS(5kDa)的反應(yīng)混合物(B、C、D)。
圖6天然G-CSF(A)；通過RP-HPLC色譜從反應(yīng)混合物獲得的G-CSF-PEG-OPSS(5kDa)軛合物(B)的MALDI-TOF質(zhì)譜。
圖7G-CSF和PEG-VS(5kDa)之間的反應(yīng)混合物的MALDI-TOF質(zhì)譜(A)。擴(kuò)展光譜(Spectrum expanded)(B)。
圖8天然G-CSF以及軛合物A，G-CSF-PEG-OPSS(5kDa)、B，G-CSF-PEG-VS(5kDa)的遠(yuǎn)UV CD光譜。光譜在25℃、10mM乙酸、0.004％吐溫、10mg/ml甘露醇、pH 4中取得。
圖9天然G-CSF、G-CSF-PEG-OPSS(5kDa)和G-CSF-PEG-VS(5kDa)軛合物的熒光發(fā)射光譜。光譜通過在CsCl(A)、NaI(B)存在下在295nm激發(fā)樣品(1.3μM)取得。
圖10天然G-CSF、G-CSF-PEG-OPSS、G-CSF-PEG-VS軛合物在NFS-60細(xì)胞增殖中的刺激作用的評(píng)價(jià)。反映是通過MTT比色分析在540nm讀取D.O.獲得的。
圖11使用C4Phenomenex柱，G-CSF和PEG-OPSS(10kDa)的反應(yīng)混合物的RP-HPLC色譜。
圖12使用C4 Phenomenex柱，G-CSF和PEG-OPSS(20kDa)的反應(yīng)混合物的RP-HPLC色譜。
圖13天然G-CSF和PEG-OPSS軛合物(5kDa黑色、10kDa紫色、20kDa綠色)的遠(yuǎn)UV CD光譜。光譜在25℃、10mM乙酸、0.004％吐溫、10mg/ml甘露醇、pH 4中取得。
圖14在3M鹽酸胍中，天然rhG-CSF(A)以及G-CSF和PEG-Mal(20kDa)反應(yīng)混合物(B)的RP-HPLC色譜。
權(quán)利要求
1.一種PEG與人類G-CSF或G-CSF類似物的軛合物，其特征在于所述人類G-CSF的17位或所述G-CSF類似物相應(yīng)位置的半胱氨酸巰基與PEG分子軛合。
2.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的軛合物，其特征在于所述G-CSF是序列類似物，其通過基因工程經(jīng)過替代加入或刪除天然人類序列的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基但維持所述G-CSF活性的方式獲得。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的軛合物，其中所述PEG是直鏈或支鏈的并且是單官能或雙官能的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3所述的軛合物，其中所述PEG是雙官能的并且包括1分子的多聚物和2分子的G-CSF或其類似物。
5.根據(jù)前述任一權(quán)利要求所述的軛合物，其中所述PEG有在800到80,000Da并且優(yōu)選地5,000到40,000Da之間范圍的MW。
6.一種藥物組合物，其包括根據(jù)前述任一權(quán)利要求所述的軛合物。
7.根據(jù)前述任一權(quán)利要求所述的軛合物的用途，用于制備藥物制劑，以治療中性粒細(xì)胞減少癥(慢性的、化療誘導(dǎo)的、HIV誘導(dǎo)的、骨髓移植)。
8.一種用于制造具有空間位阻的半胱氨酸基團(tuán)的多肽與多聚物的軛合物的方法，其包括以下步驟(i)使所述多肽經(jīng)受誘導(dǎo)所述多肽可逆變性的條件，(ii)在變性的條件下，步驟(i)中得到的變性多肽與巰基活性多聚物軛合，(iii)使步驟(ii)中得到的軛合物經(jīng)受促進(jìn)所述軛合物復(fù)性和提供所期望的軛合物的條件。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述多肽是G-CSF或其類似物并且所述多聚物是PEG。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述可逆變性是通過暴露所述多肽于變性劑獲得的，所述變性劑選自尿素、鹽酸胍或異硫氰酸酯、二甲基-尿素，這樣的變性劑優(yōu)選濃度大于2M，優(yōu)選大于3M，且甚至更優(yōu)選為2至4M。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述變性劑是鹽酸胍并且鹽酸胍的濃度優(yōu)選地大于2M，且優(yōu)選地為3M，并且甚至更優(yōu)選為4至6M。
12.根據(jù)權(quán)利要求9-11所述的方法，其中所述PEG具有選自O(shè)PSS、VS、N-馬來酰亞胺或碘乙酰胺的巰基活性基團(tuán)。
13.根據(jù)權(quán)利要求8-12所述的方法，其中所述復(fù)性是通過透析、超濾、色譜或稀釋的方法除去所述變性劑而獲得的。
14.根據(jù)前述任一權(quán)利要求所述的方法，其特征在于在pH 5至11的緩沖水溶液中進(jìn)行。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中緩沖劑是TRIS或磷酸緩沖液并且所述pH大約為7。
16.根據(jù)權(quán)利要求8-15所述的方法，其特征在于所述步驟(ii)是在包括5℃至50℃之間的溫度下進(jìn)行的，優(yōu)選地在20℃至40℃之間的溫度下進(jìn)行。
全文摘要
本申請(qǐng)涉及新的PEG－G－CSF軛合物，在其中PEG分子連接天然G－CSF基本序列17位半胱氨酸殘基或G－CSF類似物相應(yīng)位置的半胱氨酸殘基。本申請(qǐng)還描述生產(chǎn)這種軛合物的方法，這種方法包括以下步驟(i)使G－CSF蛋白質(zhì)經(jīng)受誘導(dǎo)蛋白質(zhì)可逆變性的條件，(ii)在步驟i得到的變性的蛋白質(zhì)與巰基－活性PEG在變性的條件下軛合，(iii)使在步驟ii得到的軛合物經(jīng)受促進(jìn)軛合物復(fù)性的條件，產(chǎn)生生物活性的G－CSF－PEG軛合物。
文檔編號(hào)A61P43/00GK1960766SQ200580017524
公開日2007年5月9日 申請(qǐng)日期2005年4月6日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月15日
發(fā)明者F·M·韋羅內(nèi)塞, M·伯納 申請(qǐng)人:尼克塔治療公司