專利名稱：脈管損傷部位聚集性載體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及非陽離子性載體、使該載體內包或擔載有藥物的醫(yī)藥組合物及藥物輸送方法，所述非陽離子性載體的特征為附著、聚集于損傷的組織，填充損傷部位。
背景技術：
從具有堵塞傷口、阻止出血的作用看，血栓形成在生物體內是不可缺少的功能。然而，從具有減小血管徑、阻礙血流的性質看，血栓形成也是循環(huán)系統(tǒng)疾病的主要原因。例如，血管的外壁遭受損傷后，血栓形成作為為了維持血液循環(huán)所必需灌流壓的生物防御功能而發(fā)揮作用。另一方面，由于過氧化反應等導致的血管內皮細胞傷害而發(fā)生動脈硬化，如果動脈硬化發(fā)展顯著則會誘發(fā)血栓形成。接著，因血栓導致血管狹窄，作為其結果產生的缺血成為疾病率和死亡率的主要原因。另一方面，因血栓形成導致的止血反應，被伴隨著癌治療藥的使用或白血病等血液疾病的血小板減少癥、或者伴隨著肝臟疾病的血液凝固因子降低所破壞，招致從血管內皮細胞間隙的漏出性出血，在這種狀況下腦血管等中的出血引起致死性變化。
為了臨床上有效地使用具有防止血管狹窄效果的藥物，需要使得該藥物以足以抑制平滑肌細胞增殖的濃度到達血管內皮傷害部位。但是，在將該藥物靜脈內給藥或口服給藥來進行全身給藥時，限于該藥物在全身不引起副作用的給藥量，此時，往往不能獲得希望的效果。另一方面，為了控制出血趨勢，由于同樣的理由，必須向紅細胞容易漏出的損傷血管內皮細胞局部選擇性地輸送藥物。
一直以來人們都希望開發(fā)出在血管內皮損傷部位上能夠使藥物特異而且足夠濃度地聚集的藥物載體，即在血管內皮損傷部位中的特異性聚集度高，具有高藥物含有力的藥物載體。對于在血管內皮損傷部位中的聚集，已知將脂質體的表面陽離子化，則聚集在血管內皮受到傷害的部分(日本特開平7-89874號公報)。但是，從在血液內凝固、與血小板結塊而分布來看，表面帶有正電荷的脂質體難以作為用于實現有效的藥物輸送的藥物載體使用。
近年，對于血栓形成中的血小板功能、白血球粘附、血液凝固及纖維素溶解的研究不斷發(fā)展，在體外不斷闡明它們的過程。然而，體內實驗時，由于沒有直接的觀察方法，所以得不到在上述體外實驗中所發(fā)現的過程。因此，開發(fā)出使用了用于對小鼠微循環(huán)中的血栓形成進行實時攝像的高速共聚焦顯微鏡的系統(tǒng)(Falati，S.et al.，NatureMed.，8(10)，1175-1180(2002)，Celi，A.et al.，J.Thromb.Haemost.，1，60-68(2003))。該系統(tǒng)可以多色且實時地觀察血管內，可以通過明視野的途徑同時獲得多個熒光探針和數據的圖像。此外，通過上述系統(tǒng)，還可以在顯微鏡下形成用激光造成的血管損傷。因此，對于血栓形成過程中的血小板凝聚、組織因子及血纖蛋白的活動等，使用因激光造成的血管內皮損傷模型，用熒光及明視野顯微鏡的體內研究不斷發(fā)展。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供聚集于損傷的組織而作為血小板控制藥發(fā)揮作用的表面非陽離子性載體、使用了所述載體的藥物輸送方法以及含有所述載體的醫(yī)藥組合物。
進而，使用高速共聚焦顯微鏡，多色且實時地觀察載體在生物體內活動，提供直接證明在所謂的藥物轉運系統(tǒng)的生物體局部中的藥物輸送的方法。
為了解決上述課題，本發(fā)明人進行了精心研究，結果成功地實時觀察到載體在血管內的活動，發(fā)現載體特異性地聚集在血管損傷部位，從而完成了本發(fā)明。
即，本發(fā)明如下。
(1)一種載體，其表面為非陽離子性，能夠粘附、聚集在組織的損傷部位，和/或填充損傷部位的載體。
作為上述載體，例如，可以舉出表面由膜構成的載體。
作為上述組織，例如，可以舉出血管等脈管。
作為上述載體，可以舉出能夠擴散到脈管外部的載體。
此外，上述損傷如涉及內皮細胞的損傷，作為這樣的損傷，可以舉出由激光、炎癥(例如浮腫(腦積水等)、發(fā)熱、發(fā)紅等)、缺血性疾病(例如缺血性腦疾病等)、缺血-再灌流損傷(例如缺血-再灌流性臟器損傷等)、彌散性血管內凝固綜合癥、敗血病、細菌毒素、氧化應激、腫瘤或血栓形成、或者出血導致的損傷。
(2)藥物運輸體，其由上述(1)所述的載體構成。
(3)醫(yī)藥組合物，其是在上述(2)所述的藥物運輸體中內包或擔載藥物而成的。
上述醫(yī)藥組合物可以是用于作為血小板的功能控制藥而發(fā)揮作用的物質，作為血小板的功能控制，例如，可以舉出止血、抗血栓形成、血栓溶解或抗動脈硬化作用。由于上述(1)所述的載體具有脈管損傷部位填充效果，因此在以止血為目的時還可以將載體自身作為醫(yī)藥品使用。
作為內包或擔載于上述載體中的藥物，例如，可以舉出選自通過可見光或紫外光等的光、溫度、pH的變化、超聲波、因炎癥細胞導致的吞噬或因酶導致的分解等引起活化的物質，止血劑，抗血栓藥，血栓溶解劑，抗腫瘤劑及抗動脈硬化劑中的至少1種。作為上述炎癥細胞，例如淋巴細胞、白細胞、巨噬細胞或血小板。
(4)藥物輸送方法，其特征為，使上述(3)所述的醫(yī)藥組合物聚集在組織的損傷部位；或者，藥物控制方法，其特征為，使上述(3)所述的醫(yī)藥組合物聚集在組織的損傷部位，使藥物作用于該損傷部位。
上述藥物的作用可以由載體的聚集、載體的擴散或載體的活化所控制。
上述組織可例舉出脈管，脈管可例舉出血管。
(5)載體的功能評價方法，其特征為，在高速共聚焦廣視野顯微鏡下觀察載體在組織內的活動。
還包括多色且實時地進行組織內活動的觀察的上述方法。
作為上述載體，例如，可以舉出表面為非陽離子性的載體，進而可以舉出表面由膜構成的載體。
上述組織可以例舉出脈管，脈管可以例舉出血管。


圖1是表示灰度級的測定部位的圖。
圖2是表示小動脈燒蝕后的Rh-lipo活動的圖。
圖3是表示小動脈燒蝕后的Rh-lipo活動的圖。
圖4是表示在小動脈損傷部位中的脂質體聚集的解析例的圖。
圖5是表示在小動脈損傷部位中的脂質體聚集的解析結果的圖。
圖6是表示小動脈和小靜脈中的因組胺導致的損傷部位中的脂質體活動的圖。左上圖給與脂質體后，組胺表面灌流前(A小動脈，V小靜脈)；右上圖給與脂質體后，組胺表面灌流開始2分鐘后。將小靜脈在中心處以竹節(jié)狀打開成大孔(large pore)，填充經若丹明標記的脂質體，中央下圖給與組胺后引起白細胞浸潤，但在給與脂質體后通過翻滾和粘附浸潤停止，白細胞留在血管內。
圖7是表示腦積水模型等中的血漿相對漏出量的圖。
圖8是表示腦積水模型等中的血漿漏出量的圖。
圖9是表示腦積水模型中的血漿漏出量的圖。
具體實施例方式
下面，詳細說明本發(fā)明。
1.概要通過使用局限性激光束照射使血管內皮損傷來獲得血栓形成模型，使用高速共聚焦顯微鏡多色且實時地觀察該模型，通過此技術完成本發(fā)明。由此，可以研究與血小板等血栓形成相關的構成物及載體在血管損傷部位中的活動。
以往認為控制載體的血管內動態(tài)是非常困難的，但是通過將上述技術應用于表面為非陽離子性的(優(yōu)選該表面由膜構成)載體(在本說明書中稱為“表面非陽離子性載體”)，可以得到關于載體的血管內動態(tài)的新知識。即，可知表面非陽離子性載體不聚集在血管非損傷部位，從特異性地聚集在血管損傷部位看，顯示出與血小板相同的活動。此外，從與血小板設置分界而聚集的方面可確認，表面非陽離子性載體顯示出與血小板相獨立地聚集、填充于損傷部位的舉動。其結果可以將表面非陽離子性載體作為血小板功能控制藥使用，可以作為以止血為目的的血小板代用品使用。另外，通過在載體中導入藥物，還可以作為抗血小板藥、抗腫瘤藥等運輸體使用。進而，將被溫度、pH等活化的藥物導入到載體中，用激光使藥物目標部位損傷，則載體聚集在目標部位，在該階段如果使溫度、pH等變化則藥物在該部位被活化，可以更特異性地將藥物運輸到目標部位。
與血小板不擴散到血管損傷部位的外側相對，對于本發(fā)明的載體而言，聚集在損傷部位的一部分載體擴散到血管外側。因此，本發(fā)明的載體可以作為藥物運輸體將藥物輸送到脈管損傷部位的外側。
2.載體在本發(fā)明中，載體是指脂質體、乳液、脂質內質網等。下面特別以脂質體為例進行說明。
(1)載體的制作表面非陽離子性脂質體是指表面由非陽離子性膜構成的脂質體，是指將脂質單獨分散于水性介質中，或者與膽固醇或其他雙親性分子混合而分散于水性介質中，由此得到的分子集合物，(i)具有通過疏水部之間的疏水性相互作用而形成的膜，(ii)具有分子填充狀態(tài)高等性質。如果形成穩(wěn)定的脂質體，則可以使內水相中內包水溶性藥物，或者可以使膜表面擔載標識部位，由此本發(fā)明的脂質體可以用于藥物輸送系統(tǒng)中。
如上，在本發(fā)明中，脂質體的膜為非陽離子性。在這種情況下，本發(fā)明的脂質體的膜構成脂質只要脂質體表面不帶陽離子性即可，可以單獨使用磷脂、或者使用磷脂和膽固醇或和脂肪酸的混合脂質。制備脂質體的方法，可以采用例如旋渦法、超聲波照射法、高壓吐出法、高壓擠出法、強制攪拌(均化器)法、解凍法、有機溶劑注入法、表面活性劑除去法、反相蒸發(fā)法、微流化法等一般方法。
只要脂質體的表面不帶陽離子性，則由非陽離子性膜構成的脂質體的構成成分可以是飽和磷脂、不飽和磷脂的任意一種(第2936109號專利)。例如，可以舉出氫化卵黃卵磷脂、氫化大豆卵磷脂等天然磷脂及其衍生物、二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二硬酯酰磷酸脂膽堿、二油酰磷脂酰膽堿、二亞油酰磷脂酰膽堿、磷脂酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇等。這些磷脂選自具有聚合性基團的聚合性磷脂。這種聚合性磷脂可以舉出1，2-二(十八-反-2，反-4-二烯酰基)磷脂酰膽堿、1，2-二(十八-2，4-二烯?；?磷脂酸、1，2-二桐酰磷酸脂膽堿等。此時，聚合性磷脂可以具有非聚合性的長鏈，非聚合性長鏈可以舉出碳原子數為2～24的直鏈或支鏈的烷基、?；⒎蔷酆闲韵┗⒎蔷酆闲酝轷；?。脂肪酸可以使用碳數為12～20的飽和或不飽和脂肪酸。例如，肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬酯酸、油酸、亞油酸、亞麻酸、十八-2，4-二烯酸等。
此外，脂質體的膜構成脂質可以含有負電荷脂質，例如，可以優(yōu)選使用二?；字８视?、二酰基磷脂酸、二?；字＜〈?、二?；字＝z氨酸、脂肪酸等。此時，負電荷脂質的含量沒有特別的限定，優(yōu)選為1～50摩爾％，更優(yōu)選5～20摩爾％。
進而，作為脂質體的膜構成脂質而使用的其它成分可以添加穩(wěn)定劑。這樣的穩(wěn)定劑優(yōu)選甾醇，具體而言，可以舉出四氫麥角甾醇、膽甾烯醇等，優(yōu)選為膽甾烯醇。膽甾烯醇的含量沒有特別的限定，為了有效地穩(wěn)定脂質體膜，優(yōu)選設為10～50摩爾％。
穩(wěn)定劑還可以使用通常使用的被稱為二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPG)或棕櫚酸(PA)的穩(wěn)定劑。DPPG和PA的化學式如下所示。
進而，穩(wěn)定劑還可以使用不具有磷酸基的羧酸型脂質。這種含有羧酸型脂質的穩(wěn)定劑，在含有于脂質體中時，具有如下特征中的至少一種特征(i)脂質體在生物體內沒有血小板活化作用，(ii)脂質體在生物體內的給藥不使循環(huán)血液中的血小板數減少，(iii)脂質體在生物體內不引起血小板的一過性粘附反應，以及(iv)脂質體在生物體內沒有白細胞粘附活化作用。本發(fā)明含有這樣的穩(wěn)定劑。上述羧酸型脂質，例如，可以優(yōu)選舉出用下述通式(1)表示的脂質。
(式(1)中，R1、R2及R3中的任意一個是用通式(1’)表示的基團，其它二個是烴基(例如鏈狀烴基)；A1、A2及A3分別獨立，可以相同也可以不同，是選自C(O)O、CONH或NHCO的基團；n是表示亞甲基鏈長的1～3的整數。
(式(1’)中，M是氫原子或一價的陽離子，m是表示亞甲基鏈長的1～5的整數。)作為上述鏈狀烴基，例如，只要是碳數2～20的、直鏈狀或支鏈狀的非環(huán)式飽和烴基或非環(huán)式不飽和烴基(還包括非環(huán)式萜烯)即可，沒有特別的限定，例如，可以舉出分類為烷基、烯基、炔基、二烯烴基、亞烷基、次烷基等各種烴基。
應說明的是，在通式(1)中，R1、R2及R3的結合部位優(yōu)選為賴氨酸、天冬酰胺、谷酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸等三官能性氨基酸。其中，特別優(yōu)選具有一個反應性官能團和二個相同的反應性官能團的三官能性氨基酸，即，具有一個末端氨基酸和二個末端羧基的天冬氨酸或谷氨酸等，或者具有一個末端羧基和二個末端氨基的賴氨酸、天冬酰胺、谷酰胺等。特別優(yōu)選天冬氨酸或谷氨酸，還可以是高半胱氨酸或谷胱甘肽等。
用通式(1)表示的羧酸型脂質，可以優(yōu)選例舉出用下述式表示的DPEA(二棕櫚酰基-L-谷氨酸-N-琥珀酸；1，5-二棕櫚酰基-L-谷氨酸酯-N-琥珀酸(或也稱為DHSG(1，5-O-二(十六烷基)-N-丁二酰-L-谷氨酸酯))。
水性介質可以舉出純水、水溶液、緩沖溶液等。水性介質可以根據脂質體的用途適當選擇，注射用水或生理食鹽水在生物體內安全性高而優(yōu)選。水性介質的pH只要是具有生理的pH、特別是沒有穩(wěn)定性低下或集合形態(tài)變化等損傷，就沒有限制。生理pH范圍是指生物體內、血液內等的pH范圍，例如pH4～11，優(yōu)選為pH6～9。
本發(fā)明脂質體的粒徑為0.02～250μm，特別優(yōu)選0.1～1.0μm的大小?？梢栽诨旌现|粉末中添加水溶性物質和水性介質后進行水合作用，使其膨潤，通過靜置水合法、旋渦混合器、強制攪拌機、超聲波照射器、均化器、微流化器、高壓擠出機(壓出機)、解凍等控制脂質體的粒徑。特別是通過將解凍和高壓擠出機組合，由于顯著提高濾器的透過性，因此處理時間縮短，收率提高。沒有被內包的水溶性物質可以通過凝膠過濾或離心分離或超臨界膜處理與內包脂質體進行分離。本發(fā)明所用的水溶性物質可以舉出血紅蛋白及清蛋白等水溶性蛋白質、肽、核酸、水溶性藥物等。
(2)表面修飾在本發(fā)明中，可以在上述脂質體膜中添加適當的修飾物質中來修飾該膜。用于修飾膜的物質，例如，可以舉出唾液酸或多糖結合的脂肪酸及脂肪、以及聚氧乙烯結合的磷脂、脂肪酸及膽固醇等，優(yōu)選用聚氧乙烯(聚乙二醇)進行修飾。通過用聚乙二醇進行表面修飾，還確認了血中的血流動態(tài)得到改善(Sakai et al.，BioconjugateChemistry，Vo.8，20-23，1997)。聚乙二醇鏈在使干燥脂質體分散于水性溶液中之后的工序中高效地抑制脂質體的粒徑變化，此外，由于抑制凝聚，因此在最終工序中進行擠出法時，能夠防止因脂質體凝聚導致的過濾器透過性降低或堵塞，因而優(yōu)選。聚乙二醇型脂質的含量優(yōu)選混合脂質的0.01～1摩爾％，進一步優(yōu)選0.1～0.3摩爾％。進而，聚乙二醇的分子量為2,000～12,000，優(yōu)選4,000～10,000左右。
3.組織損傷(1)損傷本發(fā)明中的組織損傷不被其要因限定，而認為是外因性的損傷和內因性損傷。此外，認為該損傷包括傷害內皮細胞的全部損傷，這種損傷部位引起炎癥。該炎癥包括因物理刺激、化學刺激產生的炎癥。物理刺激可以舉出因激光、放射線、刀具等引起的刺激，化學刺激可以舉出組胺、白細胞三烯、凝血酶、激肽、活性酶、氧化應激、重金屬、細菌毒素、細胞因子等。這些炎癥還包括浮腫(例如腦積水)、發(fā)熱、發(fā)痛、發(fā)紅等。外因性的損傷，例如，可以舉出因受傷導致的血管損傷、在疾病預防或治療的目的中使用的激光所導致的損傷等。內因性的損傷可以舉出缺血性疾病(例如缺血性腦疾病等)、缺血-再灌流損傷(例如缺血-再灌流性器官損傷等)、彌散性血管內凝固綜合癥、敗血病、腫瘤、血栓形成等。此外，由高血壓、高血脂、肥胖、糖尿病、吸煙的動脈硬化的危險因子誘導的各種血管壞死因子引起的過氧化反應等導致的內皮細胞的傷害以及其結果形成的動脈硬化病灶也包括在內因性損傷中。
(2)在組織中的聚集使本發(fā)明的載體聚集的組織只要是含有內皮細胞的組織就沒有特別的限定。具有內皮細胞的脈管具有含一層內皮細胞的管腔結構，這樣的組織可以舉出血管及淋巴管，從容易地將載體注入血液中考慮，優(yōu)選血管。血管無論是動脈、靜脈還是毛細血管都可以。下面，為了方便起見，舉例說明血管。
本發(fā)明的載體具有不聚集在沒有損傷的血管上，而特異性地聚集在上述損傷導致的內皮細胞損傷部位上的特征。載體在損傷部分中的聚集活動顯示與血小板幾乎相同的活動，單層或多層地聚集，使得覆蓋損傷部分，從血管內皮細胞損傷部位侵入到內皮下腔中，將其部位特異性地填充。另一方面，本發(fā)明的載體的特征為，在聚集部分中不與血液中原來流動的血小板相互作用，而是與血小板的聚集區(qū)域設置分界，獨立地聚集。
(3)部分擴散內皮細胞損傷伴隨有血管基底膜的損傷時，載體不僅從血管內聚集到損傷部位，而且其一部分還從損傷部位向血管外部擴散。因此，內包或擔載藥物的載體在損傷程度大時，可以不停留在血管壁內部而擴散到達血管外。其結果為，可以將藥物高效地輸送到損傷部位，可以期待更好的治療效果。即使是不含有藥物的載體，由于從血管外部堵塞血管壁貫通部位，因此可以期待好的止血效果。
4.藥物輸送(1)藥物在本發(fā)明中，通過使載體內包或擔載藥物，可以作為醫(yī)藥組合物使用。根據血管損傷部位的診斷和/或治療的目的，藥物可以使用診斷用物質或藥理活性物質。
在本發(fā)明中，作為內包或擔載在載體中的藥物，可以使用任何藥物，只要無損載體的形態(tài)就沒有特別的限定。具體可以舉出止血劑、血液凝固促進劑、抗血栓劑、血栓溶解劑、抗腫瘤劑、抗凝劑、蛋白酶抑制劑、前列腺環(huán)素制劑、血管平滑肌細胞增殖抑制劑、抗生素、抗炎劑、抗動脈硬化劑、脂質摻入抑制劑、血管內皮細胞增殖抑制劑、維生素(如維生素C、E、K)、抗感染劑、皮膚用藥、感官用藥、內分泌系統(tǒng)用藥、消化器官用藥、循環(huán)器官用藥、排泄器官用藥、生殖器官用藥、呼吸器官用藥、神經系統(tǒng)用藥、診斷用輔助劑、營養(yǎng)劑、氨基酸、蛋白質等，這些物質可以單獨使用或者適當組合使用。對象疾病是上述藥物的適應癥。此外，在載體中，還可以含有人工紅細胞用的血紅蛋白或用于癌的化學療法劑等的各種醫(yī)藥品，或者以基因治療為目的，在載體中還可以含有基因(核酸(DNA、RNA))。
此外，例如還可以將用可見光或紫外光等的光、超聲波活化的藥物內包或擔載在載體上，還可以將通過溫度或pH的變化而活化的藥物內包或擔載在載體上。進而，還可以將通過炎癥細胞的吞噬或酶的分解而活化的藥物內包或擔載在載體上。炎癥包括浮腫和白細胞浸潤(皰疹、血管性水腫、腦積水、腦缺血)。上述炎癥細胞可以舉出淋巴細胞、白細胞、巨噬細胞、血小板等。
“使載體內包藥物”是指在載體內部的水性介質中包含藥物。
使載體內包藥物的方法，在載體為脂質體的情況下，如上所述制作載體時，將藥物和原料脂質在水性介質中混合即可。
“使載體內包藥物”是指使載體表面物理性地附著藥物、或者化學性地結合藥物，具體是指，使膜自身的雙親性部位結合藥物，形成藥物在脂質雙分子膜內不穿透即不貫通膜的狀態(tài)或穿透而貫通膜的狀態(tài)，或者形成將藥物夾在脂質雙分子膜的疏水部之間形成夾心狀的(結合的)狀態(tài)。
使載體擔載藥物的方法可以在脂質體內腔中封入藥物或者可以在脂質雙層膜內部或表面持有藥物。
可以將通過可見光、紫外光等的光、溫度、pH的變化、超聲波、炎癥細胞(淋巴細胞、白細胞、巨噬細胞、血小板)的吞噬、酶的分解而活化的藥物內包或擔載在載體中。上述藥物的活化是指藥物制劑活性表現的提高、藥物從載體游離和/或非活性型藥物的活化。對要診斷或治療的部位進行激光照射，使血管局部損傷，則載體聚集在該位置。內皮細胞損傷到達血管基底膜時，載體部分擴散也在血管外側聚集。在血管損傷部位聚集的載體中內包或擔載的藥物通過可見光、紫外光等的光、溫度、pH的變化、超聲波、炎癥細胞(淋巴細胞、白細胞、巨噬細胞、血小板)的吞噬、酶的分解而活化，從而可以有效地釋放診斷用物質或藥理活性物質。
本發(fā)明的載體中內包或擔載的藥物的量可以根據治療目的由本領域技術人員適當設定。由于年齡、性別、癥狀、給藥途徑、給藥次數不同，本發(fā)明的醫(yī)藥組合物的給藥量可以適當選擇而設定。例如，為抗腫瘤劑時，可以使其1～5mg作為內包型存在于直徑為100～300nm的脂質體懸浮液1mL中。
本發(fā)明醫(yī)藥組合物的給藥形式除了通常的靜脈內、動脈內等全身給藥之外，還可以在肌肉、皮下、皮內等進行局部給藥。進而，還可以采用使用了導管的給藥形式。
(2)功能控制如果血管內皮細胞受損，則血小板聚集在該損傷部位形成用于止血的血栓。此外，在初始期間，從因血管內皮損傷而產生的內皮細胞間隙漏出以清蛋白為代表的血漿膠質滲透壓物質而引起浮腫，最終該間隙成為炎癥細胞侵入組織中的門戶。通過這些反應，引起所謂的炎癥反應，引起浮腫或發(fā)熱、發(fā)痛、發(fā)紅。已知這些反應也普遍發(fā)生在因癌在血管內散播或敗血癥引起的多器官衰竭的血管系中(KatayamaT，Ikeda Y，Handa M，Tamatani T，Sakamoto S，Ito M，Ishimura Y，Suematsu M.Immunoneutralization of glycoprotein Ibα attenuatesendotoxin-induced interactions of platelets and leukocytes with ratvenular endothelium in vivo.Circulation Research 2000，86，1031-1037.)。即，血小板和白細胞具有識別內皮細胞損傷部位而聚集的性質。
在因激光等導致的外因性損傷部位中，血小板聚集來修補血管壁，起到防止出血、保持生物體循環(huán)系統(tǒng)的封閉性的作用。此外，血管內皮細胞脫落，或者因過氧化反應使血管內皮細胞受損，則血小板聚集在該損傷部位上，形成血栓。在因腫瘤導致的血管損傷部位中，血小板具有粘附、活化、或者放出血小板內的物質、在該部位形成血栓的性質。此外，上述血管內皮受損的部位因白細胞引起炎癥反應。即，在血管內皮損傷部位不僅聚集血小板，還聚集白細胞。
因此，下面對應于各個細胞擔負的生理功能，來說明應用識別內皮損傷部位而聚集的本發(fā)明載體的血管功能控制的例子。
(2-1)血小板顯示與血小板相同的粘附活動的本發(fā)明載體可以作為血小板的功能控制藥而發(fā)揮作用。功能控制是指通過使用內包或擔載有對應于診斷或治療目的的藥物的載體來代替血小板，從而抑制或促進血小板的功能。血小板的功能控制作用具體為止血、抗血栓形成、血栓溶解或抗動脈硬化作用等。
例如，聚集在因受傷導致的外因性損傷部位的載體顯示出堵塞損傷部位、止血效果。此外，使載體內包或擔載具有止血效果、血液凝固促進效果的藥物時，該載體可以顯示更高的止血效果。因此，本發(fā)明的載體具有增大血小板止血功能的功能。
聚集在內因性損傷部位的載體通過在載體內內包或擔載的藥物的作用，可以防止或者溶解源自聚集的血小板的血栓。因此，本發(fā)明的載體可以發(fā)揮抑制血小板聚集功能的作用。
(2-2)白細胞如上所述，在血管內皮損傷部位不僅聚集血小板，還聚集白細胞。本發(fā)明的載體顯示與血小板相同的向血管內皮損害部位的聚集性，因此推定該載體顯示與白細胞相同的粘附活動，也可以作為白細胞的功能控制藥而發(fā)揮作用。白細胞的功能控制是指，內包或擔載抑制或促進白細胞生理作用的藥物的載體作為白細胞而發(fā)揮作用。白細胞可以大致分為淋巴細胞、單核細胞、粒細胞3種，擔任免疫功能的核心作用。這種白細胞的功能控制作用是微生物吞噬·殺菌·消化作用、生物體防御作用、感染防御作用、炎癥作用、寄生蟲破壞作用、即時型過敏反應促進作用等。
例如，聚集在外因性損傷部位的載體具有防止源自外部的病毒、微生物侵入、感染的作用。使載體內包或擔載具有抗微生物、抗菌作用的藥物等時，該載體可以顯示更好的白細胞樣功能。此外，使載體中內包各種細胞因子(例如1L-1、1L-2、1L-4等)，還可以使單核細胞或淋巴細胞活化。此外，聚集在內因性損傷部位的載體具有防止白細胞從血管浸潤到組織中、防止體液漏出的作用。已知源自血管的白細胞浸潤借助細胞因子的游離而引起組織炎癥，而且，體液的漏出引起全身或局部(例如腳部、腦積水等)的浮腫。本發(fā)明的載體顯示出防止成為這種炎癥原因的白細胞浸潤、體液漏出的功能。
因此，本發(fā)明的載體也可以控制白細胞的功能而發(fā)揮作用。
(3)藥物的作用本發(fā)明載體的一部分擴散到血管外部，因此在血栓、血管損傷部位的治療中，也可以從血管外壁發(fā)揮其效果。
此外，預先將用激光激發(fā)的熒光物質添加到藥物中，在使用激光的診斷或治療中，特別指定診斷部位或治療部位變得容易，部位特異性的藥物的活化變得容易。應說明的是，此時的激光作為與在本發(fā)明中用于在血管上給予損傷的激光不同的用途而使用。
此外，使本發(fā)明的載體內包或擔載因可見光或紫外光等的光、溫度、pH等而活化的藥物時，可以選擇希望的時間、希望的作用部位、希望的作用量而發(fā)揮藥物效果。
藥物可以按內包或擔載在聚集于血管損傷部位的載體中的形式輸送，特異性地作用于損傷部位。此外，藥物通過載體聚集、擴散或載體活化，其活性受到控制。本發(fā)明提供這種藥物輸送方法及藥物控制方法。
5.使用高速共聚焦廣視野顯微鏡的血管內觀察通過本發(fā)明，提供在高速共聚焦廣視野顯微鏡下觀察載體在生物體內的活動的方法。該方法可以多色且實時地觀察載體在組織(血管)內的活動。除了載體之外，通過對源自生物體的血小板或白細胞(以下也稱為“血小板等”)或目標部位進行熒光標記，可以同時觀察兩者在生物體內的活動。因此，本發(fā)明的方法在研究載體在生物體內的選擇性、凝聚性及動態(tài)上極為有效。
(1)觀察對象動物的準備實驗動物只要是具有在共聚焦廣視野顯微鏡下能夠進行觀察的血管的動物就沒有特別的限定，優(yōu)選在藥物載體動態(tài)研究中通用的動物。優(yōu)選大鼠、豚鼠、小鼠、倉鼠、鼩鼱、兔、狗、豬、貓及猴。更優(yōu)選大鼠、豚鼠、小鼠及倉鼠。
實驗動物的麻醉用在一般動物實驗中使用的方法進行。例如，可以舉出戊巴比妥鈉鹽、氯胺酮、水合三氯乙醛、尿烷、乙醚等及它們的組合。優(yōu)選不表現血管擴張等血管作用的麻醉方法。對實驗動物的給藥可以按各種催眠藥、麻醉藥所適用的用法、用量來進行。
在麻醉實驗動物的靜脈中插入導管，將用于對血小板等進行熒光標記的化合物通過導管進行靜脈內給藥。導管的插入位置沒有特別的限定，考慮到導管的穩(wěn)定性、對實驗動物的安全性和對觀察部位的損傷的可能性，優(yōu)選大腿靜脈。
(2)血小板等的標記為了用顯微鏡觀察血管損傷部位中的血小板的活動，將血小板等用熒光色素標記。對血小板等進行標記的化合物在分子內具有酯鍵，例如，可以舉出羧基熒光素乙酰乙酸琥珀酰亞胺酯(carboxylfluoresceindiacetate succinimidyl esterCFDA-SE(CFSE))。
標記化合物由于具有膜透過性而摻入細胞內，在該階段不發(fā)出熒光。CFDA-SE摻入血小板等中時，通過細胞內的酯酶切斷酯鍵，由此，化合物形成熒光基團，發(fā)出強熒光?；衔镆坏饺爰毎?，則原樣停留在細胞內，因此在長時間的測定中細胞標記也不會消失。
(3)載體的標記載體的熒光標記劑只要是與用于上述血小板等的熒光標記的化合物顯示不同色調的色素，就沒有特別的限定，例如，可以舉出若丹明、德克薩斯紅、熒光素等。CFDA-SE發(fā)色呈綠色，因此將血小板用CFDA-SE標記時的載體的標記優(yōu)選發(fā)色呈紅色的若丹明。注入的載體按含有載體(脂質體)體積35％的溶液換算，為每100g大鼠10～2000μL、優(yōu)選50～400μL、更優(yōu)選250μL。
根據目的，載體的給與方法除了靜脈內給與之外，可以是腹腔內給與、肌肉內給與、皮下給與、經鼻給與、經肺給與、經口給與、涂抹等各種形式。此外，根據給與方法，也可以按含有藥理學上允許的賦形劑或基劑的形式給與載體。
(4)血管觀察將熒光標記化合物從上述導管注入之后，打開腹腔，為了對生物體內進行觀察，將血管觀察部位配置在玻璃蓋片上。觀察部位優(yōu)選腸系膜的回腸部位，但沒有特別的限定，也包括腦、肝臟、消化管等循環(huán)器官。
觀察部位用在生物試劑中常用的緩沖液(例如Krebs緩沖液)進行灌流。此時，緩沖液優(yōu)選使用經95％N2/5％CO2飽和過的緩沖液。灌流的條件為在37℃下保溫，使得不給試樣帶來負擔。
(5)因激光導致的血管內皮細胞的損傷接著，從上述導管注入熒光標記后的載體。在此后1小時以內，選擇待損傷的血管。成為引起損傷對象的血管可以舉例出動脈、靜脈、毛細血管、淋巴管等。損傷制作所用的激光使用氮分子激光的脈沖光。在顯微鏡物鏡下，對目標部位照射如具有1μm直徑光束的激光，由此在血管內皮細胞部位中特異性地引起損傷。
(6)血栓形成和載體動態(tài)的生物體內攝像血管損傷部位的攝像所必需的系統(tǒng)可以改變Falati等人的方法來使用(Falati S.et al.，Nature Medicine，8(10)，1175-1180(2002))。該改變系統(tǒng)是具有三目鏡筒的改良落射型顯微鏡。此外，為了在生物體內進行用顯微鏡的檢查，必須具有一定開口數的水浸透鏡或油浸透鏡。具體優(yōu)選具有1.1開口數的60×水浸透鏡(LUMFL)。
在本發(fā)明中，如果使用以尼普科夫圓盤(Nipkow disk)技術為根據的掃描儀作為共聚焦顯微鏡，則顯微鏡在理論上能夠于1秒內拍720幅圖像。用于激發(fā)熒光的激光器可以舉例出氬-氪2列激光器。使用該激光器，則在具有激發(fā)波長為488nm、568nm的共聚焦顯微鏡中可以得到熒光。
通過激光形成血栓時，使用氮色素激光。接著，在落射熒光(epi-illumination port)的光路中導入激光，就可以通過物鏡對腸系膜的小血管的內皮細胞照射激光。激光在血管直徑為約0.5μm的血管表面以3～10Hz的頻率形成4-nsec能量脈沖。脈沖能量用適宜的數碼控制器進行定量控制。
在三目顯微鏡的鏡臺中央部分接續(xù)彩色CCD相機，因此可以攝像在空間及時間上具有高分辨能的彩色圖像。
(7)圖像解析用采用了血小板標記色素的激發(fā)波長、載體標記色素激發(fā)波長以及雙激發(fā)波長的激發(fā)光的三種方法來收集熒光圖像，由此可以分別將血小板自身的活動、載體自身的活動以及血小板與載體兩者的活動作為圖像而得到。激發(fā)光是借助根據各色素而設定的濾光片的激光。
熒光圖像首先被接續(xù)在計算機上的8位的數字化轉換器加工，基于像素的數據變換成灰度級。接著，用數碼圖像處理軟件將目標部位的灰度級數值化。
用激光實施損傷的血管周邊中的熒光標記載體的空間分布通過測定灰度級進行評價。具體而言，以血管壁的損傷部位為中心，在血管長軸方向或與長軸方向垂直的截面方向的兩個方向進行線掃描。通過線掃描，可以明白漏出到血管外的載體量及其分布的空間特異性。
下面，列舉實施例更具體地說明本發(fā)明。但是，本發(fā)明并不限于這些實施例。
實施例1 脂質體的制備將1g混合脂質粉末(DPPC(二棕櫚酰磷脂酰膽堿)/膽固醇/DPEA/∶PEG-DSP(N-(單甲氧基聚乙二醇氨基甲酰)二硬脂酰磷脂酰乙醇胺)＝5/5/10/0.033(摩爾比))分散于25mL生理鹽水中，在室溫下攪拌10小時。用擠出機使其透過孔徑為0.22μm的過濾器2次，得到平均粒徑為263±43nm的脂質體分散液。用生理鹽水將脂質濃度調到3g/dL。對于該分散液20ml，一邊攪拌一邊滴入另外調好的600μL十八烷基若丹明B(Molecular Probe公司制)的乙醇溶液(1mg/1mL)，進而在避光下攪拌2小時。通過離心分離(10萬g、60分鐘+15萬g、30分鐘)使脂質體沉降，除去殘存于上清中的微量未導入色素和乙醇。添加生理鹽水，使小泡再分散，最后透過過濾器(孔徑為0.45μm)。
測定所得脂質體的膜的電荷，結果是ξ電位為-2.6V。
實施例2 用圖像解析法進行的脂質體活動解析1.生物體顯微鏡系統(tǒng)和微循環(huán)觀察記錄系統(tǒng)大鼠根據慶應義塾大學醫(yī)學部實驗動物中心的管理進行飼養(yǎng)。依照Suematsu等人的方法(Suematsu M，et al. Lab Invest 1994)，肌肉注射戊巴比妥鈉50mg/kg來麻醉Wistar系雄性大鼠(200～250g，日本CLEAR，東京)，在大腿靜脈中插入導管，給與1mg/kg羧基熒光素乙酰乙酸琥珀酰亞胺酯(CFDA-SE)，對體內的血小板進行生物染色。
將回盲部的腸系膜打開到腹腔外，用直立型激光共聚焦顯微鏡觀察微循環(huán)系統(tǒng)。
物鏡使用60倍。在顯微鏡光路中可以輸出將CFSE熒光圖像化的488nm的氬激光以及將若丹明B圖像化的568nm的激光，單獨對前者的綠色熒光或者單獨對后者的紅色熒光進行拍攝，進而同時對二者進行拍攝，安裝將合并圖像化的濾光器，進行自由切換。還可以在無濾光器的狀態(tài)下獲取透射光線圖像。此外，安裝能夠自由地定量控制輸出的氮色素激光(微點激光燒蝕Micropoint laser ablation)，通過將微小血管的任意位置設置在顯微鏡畫面中央，由此可以用1微米的光束引起細胞損傷。通過改變輸出能量，可以從制作伴隨有破裂出血的(即伴隨有基底膜損傷的)出血，直至制作僅有幾個紅細胞漏出、不伴隨有血小板的一次凝聚塊形成的僅為連接處外漏(junctionalleakage)的血管內皮細胞損害。
即，在本系統(tǒng)中，把以下3點作為指標，可以制作不同程度的血管內皮細胞傷害，即(1)有無因基底膜傷害導致的破裂出血，(2)有無以傷害點作為基點的血小板凝集塊，(3)有無用透射光線圖像能夠識別的紅細胞漏出到內皮下腔中。沒有這3種變化的實驗判定為沒有因氮色素激光導致的傷害。
為了獲得血小板的圖像和涂抹有若丹明B的脂質體圖像，在顯微鏡光路中安裝高靈敏度的CCD照相機(C5810、濱松PHOTONICS制)，圖像全部作為DVD圖像進行8位彩色數碼保存。脂質體使用以已有方法制成的平均粒徑為263nm的脂質體，記錄控制的微循環(huán)圖像之后，每100g大鼠注射250μl的脂質體分散液(分散液中脂質體的體積比例為35％(樣品中推定脂質體數為4.8×1012個/毫升))，在進行微點激光燒蝕之前以及實施之后花30分鐘進行解析。
2.圖像解析法根據記錄的熒光圖像，進行從血管漏出的若丹明B標記脂質體(以下也稱為Rh-lipo)的分布和量的半定量解析。以血管壁上的氮激光照射部位(point of injury、傷害部位)為中心，在血管的長軸方向或法線方向設定軸，用8位灰度級(0-255)測定漏出到內皮下腔的熒光的強度。在測定中使用圖像解析軟件(MetaMorph 6.1，Universal ImagingCorporation)，如圖1所示，沿著血管的長軸每2微米或者沿著法線每5微米測定灰度級。灰度級的測定在各單位微米內把10個位置左右的測定值的平均值作為代表值，用在4只不同動物、不同小動脈、小靜脈中測得的平均值(標準誤差)表示數據。
3.結果(1)正常微循環(huán)中的脂質體活動通過本實施例中所用的CFSE標記規(guī)程，對循環(huán)血液中約80％的血小板染色。這些血小板在畫面上被拍攝成綠色的虛線狀。注入Rh-lipo則熒光一過性地通過觀察視野，雖然其一部分稍微將被認為是小靜脈內皮細胞連接處的部位染色，但大部分分布在血液空間中。此時，被CFSE染色的血小板的色調沒有變化，由于能夠識別為綠色，因此認為給與的Rh-lipo摻入到血小板內的可能性低。此外，Rh-lipo給與后，未見血小板在血管內皮細胞中的一過性粘附反應發(fā)生大的變化。這些結果成為表示脂質體的給與不會對血小板的活動帶來影響的佐證。
(2)伴隨著微點激光燒蝕的脂質體的活動在上述(1)條件下通過一定的激光能量(以5Hz照射4-nsec energypulse的激光約5秒，激光發(fā)生機出口的輸出為300μJ)在小動脈、小靜脈血管(直徑為20～40微米)中進行微點激光燒蝕。
圖2表示小動脈中的燒蝕后的Rh-lipo的活動。圖中，箭頭表示傷害部位，A表示小動脈，V表示小靜脈。左上圖表示Rh-lipo的活動，右上圖表示CFSE標記血小板的活動，左下圖表示Rh-lipo和CFSE標記血小板的彩色標記的活動的疊加圖像，右下圖表示透射光的圖像。確認在燒蝕后幾秒內脂質體從血管內漏出，同時形成多個血小板集塊。用紅色顯示的若丹明標記熒光圖像可明顯示出(圖2左上圖)，脂質體從傷害附近的血管內皮連接處漏出，不擴散而停留在基底膜和內皮細胞的分界(內皮下腔)，并且在血管長軸方向不擴散而充滿局部，可見局限性的蓄積。這些現象證明，本實施例中所用的脂質體在血管內皮細胞損傷部位特異性地聚集，填充內皮下腔。
另一方面，血小板以傷害點作為基點形成凝聚塊，如合并圖像所示，未見與脂質體的重疊，雙方熒光的重疊也很少(圖2左下圖)。這表示在本實施例中所用的負電荷脂質體不依賴于與血小板的相互作用而聚集在傷害局部。同樣的Rh-lipo活動，如圖3所示，與傷害了小靜脈中的血管內皮細胞的情況相同。但是，零星地看見在小靜脈中血小板粘附在將血管壁附近翻轉的白細胞上，或者脂質體部分摻入卷有白細胞的血小板凝聚塊之中等現象。應說明的是，在圖3中，箭頭表示傷害部位，V表示小靜脈。左上圖表示Rh-lipo的活動，右上圖表示CFSE標記血小板的活動，左下圖表示Rh-lipo和CFSE標記血小板的彩色標記的活動的疊加圖像，右下圖表示透射光的圖像。
(3)Rh-lipo在血管內皮下腔中的聚集圖4表示小動脈的傷害部位中的脂質體聚集的解析結果。箭頭表示傷害部位。圖4右側的圖像表示直徑從上到下依次為22.4、21.7、23.0及26.0μm的小動脈的傷害部位中的Rh-lipo聚集圖像，左側的圖像是將各個小動脈的脂質體漏出圖像化而得到的圖像。解析在脂質體漏出和聚集達到穩(wěn)定狀態(tài)的燒蝕后的5分鐘以后進行。將這些數據的平均值圖像化之后所得的圖像為圖5，確認脂質體聚集在以傷害部位為中心的約30微米內外。即使法線方向的解析也顯示以傷害部位為中心的局限的聚集，粒子向傷害部位相對側的轉移是微小的。另一方面，在小靜脈中發(fā)生以傷害部位為中心約40微米范圍的聚集。法線方向的分布也與小動脈的情況基本相同，但有時可見脂質體向與傷害部位相對側的血管壁的轉移。
無論在小動脈和小靜脈的任何一種血管種類中，本實施例所使用的脂質體都具有向血管內皮細胞傷害部位聚集、漏出的作用，具有聚集在血管內皮下腔來填充傷害部位的作用，其作用表現為不依賴于與血小板的相互作用。
實施例3 炎癥刺激下的脂質體的活動本實施例不是機械刺激腸系膜，其目的在于明確以一般的炎癥物質刺激時的脂質體的活動。炎癥刺激物質使用組胺。與實施例2的方法相同，肌肉注射戊巴比妥鈉50mg/kg來麻醉Wistar系雄性大鼠(200～250g)，在大腿靜脈中插入導管。將回盲部的腸系膜打開到腹腔外，用直立型激光共聚焦顯微鏡觀察微循環(huán)系統(tǒng)。物鏡使用60倍。
將用實施例1的方法制成的脂質體分散液按每100g大鼠250μl(250μl/100g大鼠，分散液中脂質體的體積比例為35％(樣品中的推定脂質體數為4.8×1012個/毫升))通過導管注入到大腿靜脈中。
脂質體注入10分鐘后，開始組胺(30μM)的superfusion(表面灌流)(流速2ml/min)，拍攝脂質體的活動10分鐘。將組胺灌流開始0分鐘、2分鐘后的小動脈(A)及小靜脈(V)中的脂質體的若丹明標記熒光圖像顯示在圖6的左上和右上圖中。中央下圖表示組胺灌流開始2分鐘后的透射光的圖像。
通過組胺2分鐘的表面灌流，小靜脈的血管內皮細胞的大孔打開，以開口的大孔為對象，可以確認白細胞(WBC)旋轉后聚集的樣子(圖6中央下圖)。認為組胺灌流的結果是，在周圍浸潤的白細胞游離出細胞因子，引起組織的炎癥。圖6右上圖表示脂質體聚集、填充于開口的大孔中。即，明確脂質體通過填充作為侵入白細胞組織中的門戶的大孔，由此抑制白細胞的組織侵入(聚集)。
在因組胺等導致的炎癥反應中，內皮細胞之間的大孔的開口是決定炎癥反應程度的重要因子。特別是浮腫，在因組胺導致的急性炎癥中，由大孔開始，首先蛋白質成分少的體液從血管內漏出到組織中，接著含有血漿蛋白的體液從血管內漏出到組織中。已知這種炎癥通常在小靜脈中發(fā)生。由圖6可知，本發(fā)明的脂質體的聚集、填充都僅在小靜脈觀察到，不存在于小動脈中。
因此，通過本實施例，本發(fā)明的脂質體顯示出具有聚集在炎癥部位而抑制炎癥的作用。
實施例4 小鼠的各組織中的血漿漏出量的評價在本實施例中，使用伊文思藍(Evans blue)示蹤器，進行小鼠(C57BL/6)各組織(腦、肝臟、腎臟及肺)的微小血管中的血漿漏出的試驗·評價。
(1)脂質體的制備脂質體與實施例1相同地進行制備，得到平均粒徑為247±129nm、分散液中的體積率為35％、粒子濃度為約4.5×106個/μl的脂質體分散液。
(2)試驗方法用尿烷(600mg/kg)/α-氯醛糖(60mg/kg)麻醉小鼠(C57BL/6)，插入氣管插管(自動換氣)之后，在大腿部的靜脈中插入套管。
從大腿部的靜脈注入脂質體的分散液，使得相對于小鼠體重達到5μl/g。
接著，為了制作腦缺血模型，在堵塞左右頸動脈(BCCA)1小時后，進行再灌流。
從大腿部的靜脈注入伊文思藍。應說明的是，伊文思藍色素的儲備溶液為3％w/v(in PBS)，用過濾器過濾，于4℃下保存。注入量為相對于小鼠1g體重注入5μl(50mg/kg)將上述儲備溶液用PBS(1％溶液)稀釋4倍后所得之物。
繼續(xù)上述灌流(缺血灌流)4小時，然后，用37℃的100mM枸櫞酸緩沖液(pH3.5)進行心臟灌流。組織學上利用小鼠組織時，用在50mM枸櫞酸中使仲甲醛溶解1％所得之物進行灌流。通過在低pH下預先固定，由此保持伊文思藍和清蛋白的結合。將小鼠腹側部用大頭針固定在軟木板上，打開胸部腔，使心臟露出。在左心室(正好為頂尖部的右側)插入21G的蝶形針，然后進行灌流。在左心房添加小裂縫。由此，將全部的血液和伊文思藍從脈管沖洗是非常重要的。
小鼠的各組織(腦、肝臟、腎臟及肺)用枸櫞酸緩沖液簡單地進行沖洗之后，用紙巾輕輕地擦干凈。稱量各組織的重量之后，與0.5ml甲酰胺一起裝入到4ml的玻璃管形瓶中。
將各玻璃管形瓶在55℃下攪拌一晚，提取伊文思藍。第二天早上，將每100μl甲酰胺提取樣品與伊文思藍標準液一起轉移到比色杯中，用分光光度計(OD620～OD750)測定各樣品中的伊文思藍的量。
由測得的OD值通過使用了標準曲線的換算求出伊文思藍的濃度(ng/mg)。另外，伊文思藍使用添加到1ml的甲酰胺中的在55℃下攪拌一晚所得之物。換算值成為相對于小鼠各組織的重量(mg)的伊文思藍的量(ng)。
作為對照，在上述試驗方法中，對僅不進行左右頸動脈(BCCA)的堵塞及其后的灌流(缺血灌流)的情況(Sham假手術組)和僅不進行脂質體的注入的情況(載體組Vehicle)進行研究。
(3)試驗結果·評價結果示于圖7～9中。
圖7是將作為對照的假手術組伊文思藍濃度(ng/mg)設為1.0時，各組織(腦、肝臟、腎臟及肺)中以相對值表示的載體組和本實施例情況的濃度的圖。圖8是各組織中以絕對值表示伊文思藍的濃度(ng/mg)的圖，其中，僅將腦的擴大圖示于圖9中。
由這些結果可知，在各組織中，特別是在腦中，相對于假手術組，載體組中的血漿漏出量顯著，而且相對于載體組，本實施例中的血漿漏出量有效地減少。在不進行缺血操作的腦、腎臟及肺中，未見伊文思藍的漏出增加。即，本發(fā)明的脂質體在腦組織中的微小血管中，形成因腦積水等炎癥引起損傷時或者能夠引起損傷的狀態(tài)時，顯示出能夠有效地抑制或阻止這種損害。
產業(yè)實用性通過本發(fā)明，提供了表面為非陽離子性的，能夠粘附、聚集在組織損傷部位的，特異性地填充損傷部位的載體，含有該載體的醫(yī)藥組合物。本發(fā)明的醫(yī)藥組合物可以作為具有止血作用或抗血栓作用等的血小板功能控制藥使用。此外，本發(fā)明的醫(yī)藥組合物可以用于向血管損傷部輸送藥物(DDS)中。
進而，通過本發(fā)明，使用高速共聚焦顯微鏡，可以多色且實時地觀察載體在組織內的活動。本發(fā)明的方法由于能夠直接觀察血管中的載體活動，因此可以在新型藥物載體或具有高選擇性的藥物載體的研究、開發(fā)中使用。
權利要求
1.一種載體，其特征為，表面為非陽離子性，聚集在組織損傷部位。
2.如權利要求1所述的載體，該載體的表面由膜構成。
3.如權利要求1或2所述的載體，其中組織為脈管。
4.如權利要求3所述的載體，該載體能夠擴散到脈管的外部。
5.如權利要求3或4所述的載體，其中脈管為血管。
6.如權利要求1所述的載體，其中損傷到達內皮細胞。
7.如權利要求1所述的載體，其中損傷是因激光、炎癥、缺血性疾病、缺血-再灌流損傷、細菌毒素、氧化應激、腫瘤或血栓形成、或者出血導致的。
8.如權利要求7所述的載體，其中炎癥是腦積水。
9.如權利要求7所述的載體，其中缺血性疾病是缺血性腦疾病。
10.如權利要求7所述的載體，其中缺血-再灌流損傷是缺血-再灌流性器官損傷。
11.藥物運輸體，該運輸體由權利要求1～10中的任一項所述的載體構成。
12.醫(yī)藥組合物，該組合物是使權利要求11所述的藥物運輸體內包或擔載藥物而成的。
13.如權利要求12所述的醫(yī)藥組合物，該組合物作為血小板的功能控制藥而發(fā)揮功能。
14.如權利要求13所述的醫(yī)藥組合物，其中血小板的功能控制為止血、抗血栓形成、血栓溶解或抗動脈硬化作用。
15.如權利要求12所述的醫(yī)藥組合物，其中藥物是選自因光、溫度、pH的變化、超聲波、炎癥細胞的吞噬或酶的分解而活化的物質，止血劑，抗血栓劑，血栓溶解劑，抗腫瘤劑及抗動脈硬化劑中的至少1種。
16.如權利要求15所述的醫(yī)藥組合物，其中炎癥細胞為淋巴細胞、白細胞、巨噬細胞或血小板。
17.藥物輸送方法，其特征為，使權利要求12～16中的任一項所述的醫(yī)藥組合物聚集在組織的損傷部位。
18.藥物控制方法，其特征為，使權利要求12～16中的任一項所述的醫(yī)藥組合物聚集在組織的損傷部位，使藥物作用于該損傷部位。
19.如權利要求18所述的方法，其中藥物的作用由載體的聚集、載體的擴散或載體的活化所控制。
20.如權利要求17～19中的任一項所述的方法，其中組織為脈管。
21.如權利要求20所述的方法，其中脈管為血管。
22.載體的功能評價方法，其特征為，在高速共聚焦廣視野顯微鏡下觀察載體在組織內的活動。
23.如權利要求22所述的方法，其中組織內活動的觀察是多色且實時地進行的。
24.如權利要求22所述的方法，其中載體的表面為非陽離子性。
25.如權利要求24所述的方法，其中表面由膜構成。
26.如權利要求22所述的方法，其中組織為脈管。
27.如權利要求26所述的方法，其中脈管為血管。
全文摘要
本發(fā)明提供聚集在損傷組織的、作為血小板功能控制藥而起作用的載體，使用所述載體的藥物輸送方法以及含有所述載體的醫(yī)藥組合物。此外，本發(fā)明提供表面為非陽離子性的載體，含有所述載體的藥物輸送體及醫(yī)藥組合物。
文檔編號A61K47/12GK1909887SQ20058000295
公開日2007年2月7日 申請日期2005年1月24日 優(yōu)先權日2004年1月23日
發(fā)明者末松誠, 武岡真司 申請人:學校法人慶應義塾