專利名稱：具有抗癌與免疫增強活性的虎乳靈芝提取物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有顯著抗腫瘤活性的藥用菇類提取物及其制備方法和用途。屬于生物工程技術(shù)和天然高分子領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
二十世紀(jì)六十年代以來，生物學(xué)家和化學(xué)家在真菌多糖及糖復(fù)合物方面取得了極大的進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)多糖和糖蛋白可以作為免疫調(diào)節(jié)劑，免疫引發(fā)劑和生物反應(yīng)修飾劑，通過調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，激活免疫細(xì)胞實現(xiàn)對腫瘤和癌細(xì)胞的殺傷同時不會傷害正常細(xì)胞；有些多糖和糖蛋白還可以直接在體外殺死腫瘤細(xì)胞。很多北美、歐洲以及亞洲的科學(xué)家在研究多糖和糖蛋白活性及機理的同時還在尋找新的更有效的真菌，找出其中的活性成分的類型以及其化學(xué)構(gòu)型和分子機理。虎乳靈芝，學(xué)名Polyporusrhinocerus Cooke[Lignosus rhinocerus(Cooke)Ryv.]，又名孤苓[1]?；⑷殪`芝并非靈芝科中的種類，而是一種新品種的多孔菌，屬真菌門、擔(dān)子菌亞門、層菌綱、非褐菌目、多孔菌科、虎乳靈芝(孤苓)屬(或多也菌屬)。香港特區(qū)國藥商店出售此種新的藥用菌。它是一種白色木腐菌，可仿照香菇、木耳等進(jìn)行代料栽培。
我們實驗室對虎乳靈芝進(jìn)行了人工培養(yǎng)與栽培，該虎乳靈芝存放于香港中文大學(xué)植物樣本室(Herbarium)，樣本編號為CUHK-MUSH-001-2003-Sanming。至今沒有專業(yè)文獻(xiàn)報道它的活性成分和活性機理。本實驗室經(jīng)研究首次從虎乳靈芝中用不同方法得到一系列提取物，對其進(jìn)行表征和活性測試，發(fā)現(xiàn)其對某些腫瘤細(xì)胞有很強的抑制作用，并提出其活性的機理。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供具有顯著抗腫瘤活性的虎乳靈芝提取物及其制備方法和用途，這些提取物的獲得以人工培育的虎乳靈芝菌核為原料，制備方法簡單，易進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。
本發(fā)明的第一方面涉及虎乳靈芝提取物，其中含有55％-65％的蛋白質(zhì)。
在本發(fā)明的一個實施方案中，所述提取物還含有45％-35％的多糖。
在本發(fā)明的另一實施方案中，所述多糖含有80％以上的葡萄糖，優(yōu)選地，所述多糖含有80-97％的葡萄糖。
在本發(fā)明的另一實施方案中，所述提取物是通過以下方法制備的將虎乳靈芝與熱水混合提取1-2小時；收集上清。
本發(fā)明的第二方面涉及虎乳靈芝提取物的制備方法，該方法包括將虎乳靈芝與熱水混合提取1-2小時；收集上清。
本發(fā)明的第三方面涉及另一種虎乳靈芝提取物，其含有占該提取物95％以上重量百分比的多糖。
在本發(fā)明的一個實施方案中，所述另一種提取物是由堿和超聲提取方法制備的，其包括將虎乳靈芝，優(yōu)選虎乳靈芝菌核粉末浸泡在堿溶液中；超聲提?。皇占锨濉?br> 本發(fā)明的第四方面涉及所述另一種虎乳靈芝提取物的制備方法，包括將虎乳靈芝，優(yōu)選虎乳靈芝菌核粉末浸泡在堿溶液中；超聲提?。皇占锨?。
在本發(fā)明該方法的一實施方案中，可包括在超聲提取之前用酸中和混合物的步驟。
本發(fā)明的第五方面涉及含有有效量本發(fā)明虎乳靈芝提取物的抗腫瘤細(xì)胞增殖的藥物組合物或功能食品。
本發(fā)明的第六方面涉及含有有效量本發(fā)明虎乳靈芝提取物的增強免疫功能的藥物組合物或功能食品。
本發(fā)明的第七方面涉及本發(fā)明虎乳靈芝提取物在制備含有其抗腫瘤藥物組合物或功能食品中的用途。
本發(fā)明的第八方面涉及含有上述虎乳靈芝提取物在制備含有其增強免疫功能的藥物組合物或功能食品中的用途。
本發(fā)明使用的虎乳靈芝可從商業(yè)途徑購買得到，例如從香港特區(qū)國藥店購買得到。也可將該菌種經(jīng)人工栽培得到，例如由福建三明真菌研究所提供的或采自野外的菌種，經(jīng)人工培養(yǎng)栽培得到。由于虎乳靈芝是木腐菌，可仿照香菇、木耳等進(jìn)行代料栽培，也可參照黃年來(一種藥用菌一虎乳靈芝學(xué)名的鑒定，食用菌學(xué)報1999，6(1)30-32)所述的方法以及其它方法進(jìn)行栽培。
在本發(fā)明中優(yōu)選使用香港中文大學(xué)人工培養(yǎng)栽培的虎乳靈芝菌核。
可以理解，本發(fā)明藥物組合物或功能食品除含有本發(fā)明的虎乳靈芝提取物之外，還可含有藥物可接受的載體或賦形劑等等；本發(fā)明功能食品除含有本發(fā)明的虎乳靈芝提取物之外，還可含有其它食品、食品添加劑或香料等等。
具體實施方案虎乳靈芝提取物的水提制備方法本發(fā)明所用的虎乳靈芝可以產(chǎn)自中國的臺灣地區(qū)、香港地區(qū)、以及東南沿海地區(qū)，優(yōu)選福建產(chǎn)的虎乳靈芝菌核。
將人工培養(yǎng)的虎乳靈芝，優(yōu)選使用菌核粉末，與熱水混合提取，或與涼水混合通過加熱來提取，優(yōu)選提取1-2小時。提取后冷卻到室溫，收集提取液的上清。所獲得的上清即為本發(fā)明的虎乳靈芝提取物。優(yōu)選地，將收集到的上清液進(jìn)一步濃縮然后超濾直到總?cè)苜|(zhì)(TDS)的數(shù)值在10以下。可選擇地將由此獲得的粗提產(chǎn)物冷凍干燥，得到的白色產(chǎn)物即為虎乳靈芝的水提取物凍干品。
本發(fā)明所述菌核粉末的制備是本領(lǐng)域公知，例如通過碾壓過篩的方法制備，本發(fā)明中優(yōu)選使用0.5mm的篩子得到的菌核粉末。
本發(fā)明所述熱水一般指30℃以上的水，優(yōu)選是超過60℃的熱水，較優(yōu)選為95-100℃。
收集上清的方法是本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員公知的，例如離心、過濾、傾析等，優(yōu)選通過離心分離上清液。本發(fā)明的離心采用能夠分離得到虎乳靈芝提取物中蛋白和多糖成分的分離條件，在混合物中分離蛋白和多糖的離心條件是本領(lǐng)域所述技術(shù)人員公知，例如優(yōu)選9,000-10,000×g離心20-40分鐘。
虎乳靈芝提取物的堿-超聲制備方法將虎乳靈芝菌，優(yōu)選上述制備的菌核粉末，以一定的重量體積比(虎乳靈芝∶堿重量體積比，w∶v)與一定摩爾濃度的堿溶液混合。浸泡一定時間，優(yōu)選浸泡24-48小時使之溶脹，然后用酸溶液中和。隨后利用超聲提取上述混合物?？蛇x擇地在用酸中和之前進(jìn)行上述超聲步驟，然后再用酸中和。如上所述利用本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員公知的分離方法收集上清，優(yōu)選通過離心收集上清液，即為虎乳靈芝提取物。優(yōu)選地將收集到的上清液用蒸餾水透析得到所述虎乳靈芝提取物?？蛇x擇地對該提取物進(jìn)行凍干，這樣得到的提取物或白色粉末狀產(chǎn)物即為所需要的提取物凍干品。
通常根據(jù)堿的摩爾濃度來確定混合的比例，例如當(dāng)選用1M氫氧化鈉時，虎乳靈芝與堿的混合比例(w∶v)為1∶20至1∶25的比例。
選擇合適的堿溶液是本領(lǐng)域所述技術(shù)人員公知，該堿溶液可選擇自諸如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈣水溶液的無機堿。
可用的酸溶液包括鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、正磷酸、多磷酸等等，優(yōu)選4M鹽酸。
利用超聲提取上述堿與虎乳靈芝的混合物時，優(yōu)選在冰浴的條件下不停攪拌混合物，超聲提取20-30分鐘。
堿-超聲提取中殘渣的再提取可選擇地，上述堿-超聲提取方法中超聲后的殘渣(為便于描述，在本發(fā)明中稱為“殘渣I”)用蒸餾水洗滌至少三次除去殘渣中的鹽分，洗滌后，利用本領(lǐng)域公知的方法除去含鹽的蒸餾水部分，例如在約5000×g的條件下約30分鐘。除去鹽分的殘渣用于下一步的水提取，方法同水提取方法?？蛇x擇地將上述提取方法重復(fù)三次并將三次提取的上清液合并，剩余殘渣記為II。將收集到的上清液對蒸餾水透析然后凍干。這樣得到白色粉末狀產(chǎn)物，標(biāo)記為第一次的殘渣提取物。
可選擇地將水提取后的殘渣繼續(xù)用堿進(jìn)行提取，方法同上述堿提取方法，但可選擇地不進(jìn)行超聲提取的步驟。在此方法中，在0-4℃用4M的氫氧化鈉水溶液進(jìn)行浸泡。根據(jù)上述方法分離上清液。優(yōu)選地，上述提取方法重復(fù)兩次并將得到的上清液合并，剩余殘渣記為III。上清液用4M鹽酸中和，然后對蒸餾水透析得到提取液，可選擇地凍干得到白色粉末狀產(chǎn)物，即為第二次殘渣提取物。
可對剩下的殘渣III進(jìn)行再一次的提取，除利用熱堿、優(yōu)選溫度在95-100℃之外，其余步驟同上。將混合物冷卻到室溫后，根據(jù)上述方法分離上清液。優(yōu)選地，上述提取方法重復(fù)兩次并將所得上清液合并。然后將上清液用酸中和，優(yōu)選用4M鹽酸中和，對蒸餾水透析，凍干得到白色粉末狀產(chǎn)物，即為第三次殘渣提取物。
虎乳靈芝提取物的組成本發(fā)明提供的水提虎乳靈芝提取物中，通常含有55％-65％的蛋白質(zhì)，還含有45％-35％的多糖。
對本發(fā)明的水提取物的多糖部分進(jìn)行組成鑒定，所述多糖含有80.5-85.5％重量百分比的葡萄糖，11-13％重量百分比的甘露糖，2.0-3.0％重量百分比的半乳糖，1.0-2.0％重量百分比的核糖，和0.5-1.5％重量百分比的鼠李糖。
在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明所述堿-超聲虎乳靈芝提取物通常含有超過95％重量百分比的多糖。
對所述堿-超聲提取方法得到的多糖部分進(jìn)行組成鑒定，所述多糖含有90-98％重量百分比的葡萄糖；1-2％重量百分比的葡萄糖胺。
在本發(fā)明的另一實施方案中，所述堿-超聲提取物的多糖部分還含有痕量的甘露糖和木糖。
對所獲得的提取物進(jìn)行組成鑒定的方法是本領(lǐng)域公知的，這些方法例如質(zhì)譜分析，高效液相等等。
虎乳靈芝水提取物的生物活性A.抗腫瘤活性將本發(fā)明上述方法獲得的提取物分別與體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞株接觸或孵育，從而驗證其對腫瘤生長繁殖的抑制作用。根據(jù)目前通用的體外抗腫瘤試驗選擇適合的具有代表性的細(xì)胞株，例如實體瘤中的乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)和HepG2肝癌細(xì)胞，以及血液癌癥中的慢性白血病癌細(xì)胞(K562)進(jìn)行體外試驗。本領(lǐng)域所述技術(shù)人員應(yīng)理解選擇其它的腫瘤細(xì)胞株也會得到本發(fā)明提取物的活性的相似結(jié)果。
此外，還將本發(fā)明上述方法獲得的提取物對活體的被植入腫瘤的動物給藥，對上述提取物的體內(nèi)抗腫瘤活性進(jìn)行分析。
上述試驗的給藥劑量、動物或細(xì)胞株的選擇、作用時間、腫瘤細(xì)胞增殖的分析以及其它反應(yīng)腫瘤細(xì)胞增殖的直接或直接指標(biāo)的選擇是本領(lǐng)域所述技術(shù)人員公知的，例如可組織學(xué)分析、免疫組化的方法或MTT法(Mosmann，1983)分析腫瘤細(xì)胞的增殖，也可通過流式細(xì)胞儀(Loken andStall，1982)對腫瘤細(xì)胞的增殖周期或細(xì)胞凋亡進(jìn)行分析，從而說明本發(fā)明提取物的腫瘤抑制作用。
通過上述方法證明本發(fā)明的虎乳靈芝提取物在體內(nèi)和體外均對腫瘤細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用，尤其是水提取方法獲得的提取物效果最佳。
B.免疫增強活性將本發(fā)明所述的虎乳靈芝提取物對動物給藥，優(yōu)選哺乳動物例如小鼠，一段時間后，檢測給藥的動物的免疫功能。免疫功能的檢測包括體液免疫和/或細(xì)胞免疫，以及免疫器官的改變等等，例如分析參加免疫反應(yīng)的諸如IL-5，IL-6，IL-9，IL-10，IL-12和IL-13的細(xì)胞因子的表達(dá)，分析諸如脾臟的免疫器官的重量等等。
本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員應(yīng)理解，檢測具有代表性的上述指標(biāo)即可反應(yīng)免疫功能狀態(tài)，只要能夠反應(yīng)本發(fā)明所述提取物對免疫功能的影響，本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員可根據(jù)試驗條件和所用動物對檢測指標(biāo)作出不同的選擇。檢測免疫功能狀態(tài)指標(biāo)的方法也是本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員公知的(可參見例如Wang et al.，2002)。
通過以上分析，本發(fā)明的提取物，尤其是水提取物對免疫功能有明顯的促進(jìn)作用。
C.統(tǒng)計學(xué)分析數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，利用組間t(t-test)檢驗分析組間差異。
含有虎乳靈芝的藥物組合物本發(fā)明所述藥物組合物含有本發(fā)明的虎乳靈芝提取物，優(yōu)選地含有本發(fā)明所述方法制備的虎乳靈芝提取物，另外還可含有藥物可接受的載體或賦形劑、輔助成分等等。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述藥物組合物中虎乳靈芝提取物的含量約為0.01％至99.9％重量百分比。
通過常規(guī)的方式，利用一種或多種藥物可接受的載體，可制備本發(fā)明的藥物組合物。因此，本發(fā)明的虎乳靈芝提取物可組方成口服或腸道外(例如靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)或皮下)的給藥形式。
根據(jù)諸如給藥途徑、患者的年齡、體重、待治療疾病的特性和嚴(yán)重程度以及其它治療用藥種類等因素，可確定本發(fā)明所述提取物的用量。對于本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員來說，為實現(xiàn)抑制腫瘤細(xì)胞增殖或最終殺滅腫瘤細(xì)胞的治療目的，或者為實現(xiàn)提高機體免疫能力的目的，選擇適合的治療有效劑量是顯而易見的。
在本發(fā)明的一個實施方案中，可將所述藥物組合物制備成為口服給藥制劑，所述制劑可為例如片劑或膠囊的形式，其通過常規(guī)方法用藥物可接受的諸如結(jié)合劑(例如，預(yù)膠質(zhì)化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羥丙基甲基纖維素)的賦形劑；填充劑(例如，乳糖、微晶纖維素或磷酸鈣)；潤滑劑(例如，硬脂酸鎂、滑石或硅石)；崩解劑(例如，馬鈴薯淀粉或淀粉羥乙酸鈉)；或潤濕劑(例如，月桂基硫酸鈉)來制備?？赏ㄟ^本領(lǐng)域公知的方法包被所述片劑。用于口服的液體制劑可以為溶液、糖漿或懸浮液、或者其可以為干品的形式在使用前與水或其它的適合載體組合。通過常規(guī)方法，利用藥物可接受的諸如懸浮劑(例如，山梨糖醇、甲基纖維素或氫化可食用脂肪)；乳化劑(例如，卵磷脂或阿拉伯膠)；非水性載體(例如，杏仁油、油酯、乙醇)；及防腐劑(例如對羥基苯甲酸甲酯或丙酯或山梨酸)的添加劑來制備這種液體制劑。
在本發(fā)明的一個實施方案中，對于一般成人、治療上述治療或抑制腫瘤生長的口服或腸道外的劑量為500mg或2000mg，可例如每天給藥1-4次。
7.含有虎乳靈芝的功能食品的制備對于口服的所述虎乳靈芝的功能食品可根據(jù)上述口服的藥物組合物的制備方法進(jìn)行制備，虎乳靈芝提取物的含量也可參考上述藥物組合物中的含量?？蛇x擇地，所述功能食品可含有其它的抗腫瘤、提高免疫力的功能食品或中藥提取物。此外所述的虎乳靈芝功能食品可制備成其它的多種形式的食品，例如顆粒、飲料、藥酒等等，其中也可含有其它食品添加劑。
實施例實施例1虎乳靈芝的水提取物將人工培養(yǎng)的虎乳靈芝菌核(由福建省三明真菌研究所提供)剝皮后碾碎，然后通過0.5mm的篩子得到菌核粉末。將大約20克菌核粉末用95-100℃的熱水(粉末與熱水的重量體積比例為1∶25)提取2小時。冷卻到室溫后，混合物在10,000×g條件下離心30分鐘分離上清液。將收集到的上清液超濾(孔徑為10000 MWCO)后，濃縮到總?cè)苜|(zhì)(TDS)的數(shù)值在10以下。這樣得到的粗提產(chǎn)物冷凍干燥得到白色產(chǎn)物，標(biāo)記為HWE1。
水提取方法的產(chǎn)率(重量百分比)為菌核干重的8.62％。
通過質(zhì)譜分析對HWE1中的成分進(jìn)行了分析。
結(jié)果表明，HWE1為多糖蛋白復(fù)合物，其中含61.5％的蛋白質(zhì)和38.5％的多糖，其中該多糖由82.7％的葡萄糖組成，并含有12.1％的甘露糖，2.31％的半乳糖，1.84％的核糖和1.04％的鼠李糖，見表1。
實施例2利用與實施例1相同的方法，對另一批人工培養(yǎng)的虎乳靈芝菌核進(jìn)行提取，所獲得的提取物的蛋白質(zhì)和多糖含量與實施例1類似，但多糖中的葡萄糖含量高達(dá)98.5％，而只有痕量的甘露糖、半乳糖、核糖和/或鼠李糖。
實施例3虎乳靈芝堿-超聲提取物用與實施例1相同的方法制備菌核粉末。將大約20克菌核粉末以1∶25的比例(重量體積比，w∶v)浸泡在1M的氫氧化鈉水溶液中使之溶漲48小時。然后將混合物轉(zhuǎn)移到大燒杯中并用4M的鹽酸中和直至pH7.0。在盛有混合物的大燒杯中放入超聲頭(Sonics，VCX600，600W)和機械攪拌棒(Stuart Scientific Stirrer，SS10，80W，50Hz)，在冰浴的條件下不停攪拌混合物，超聲提取30分鐘。然后混合物在10,000rpm條件下離心30分鐘分離上清液，剩余殘渣記為I。將收集到的上清液對蒸餾水透析(孔徑為6000-8000MWCO)然后凍干。這樣得到白色粉末狀產(chǎn)物，標(biāo)記為SonE。
SonE的產(chǎn)率為菌核干重的73.1％，利用質(zhì)譜方法對其進(jìn)行組分分析表明，它的多糖含量高達(dá)97％，其中98.55％由葡萄糖組成，還含有1.17％的葡萄糖胺，此外含有痕量的甘露糖和木糖(見表1)。
實施例4虎乳靈芝提取殘渣的再提取超聲提取后的殘渣I用蒸餾水洗滌三次除去殘渣中的鹽分，每次均在5000rpm的條件下離心30分鐘。除去鹽分的殘渣用于下一步的熱水提取，方法為用95-100℃的熱水提取2小時。冷卻到室溫后，混合物在10,000rpm條件下離心30分鐘分離上清液。將上述提取方法重復(fù)三次并將三次提取的上清液合并，剩余殘渣記為II。將收集到的上清液對蒸餾水透析(孔徑為6000-8000MWCO)然后凍干。這樣得到白色粉末狀產(chǎn)物，標(biāo)記為HWE2。
HWE2的產(chǎn)率占菌核干重的0.38％，其中糖類的總含量為59.7％，其中93.6％由葡萄糖組成，還含有3.21％甘露糖，1.79％的葡萄糖胺，此外有痕量的核糖和鼠李糖(見表1)。
水提取后的殘渣繼續(xù)用于以下提取殘渣II浸于0℃ 4M的氫氧化鈉水溶液中在不斷機械攪拌的情況下提取2小時?；旌衔镌?0,000rpm條件下離心30分鐘分離出上清液。上述提取方法重復(fù)兩次并將得到的上清液合并，剩余殘渣記為III。上清液用4M鹽酸中和，然后對蒸餾水透析(孔徑為6000-8000MWCO)，凍干得到白色粉末狀產(chǎn)物，標(biāo)記為CAE。
CAE的產(chǎn)率占菌核干重的0.86％，其中糖類的總含量為90.1％，其中95.4％由葡萄糖組成，還含有2.03％甘露糖，1.18％的葡萄糖胺，此外有痕量的核糖，阿拉伯糖和鼠李糖(見表1)。
剩下的殘渣III用于最后一種提取物的提取殘渣在95-100℃，4M的熱堿中提取兩小時。將混合物冷卻到室溫后，在10,000rpm條件下離心30分鐘分離出上清液。上述提取方法重復(fù)兩次并將所得上清液合并。然后將上清液用4M鹽酸中和，對蒸餾水透析(孔徑為6000-8000MWCO)，凍干得到白色粉末狀產(chǎn)物，標(biāo)記為HAE。
HAE的產(chǎn)率占菌核干重的1.89％，其中糖類的總含量為43.7％，其中96.8％由葡萄糖組成，還含有1.57％的葡萄糖胺，此外有痕量的甘露糖，半乳糖，阿拉伯糖和鼠李糖(見表1)。
表1.虎乳靈芝提取物的產(chǎn)率，單糖組成、蛋白和糖類含量和產(chǎn)率

-未檢測到實施例5虎乳靈芝提取物腫瘤抑制作用的生物活性分析(體外、體內(nèi))A.材料與方法虎乳靈芝提取物的用量將虎乳靈芝提取物(HWE1)調(diào)制為以下6種濃度12.5μg/ml，25μg/ml，50μg/ml，100μg/ml，200μg/ml，400μg/ml的HWE1，然后將其分別加入不同細(xì)胞株的各組中，來觀察對培養(yǎng)細(xì)胞的影響。
細(xì)胞株的來源人體急性白血病細(xì)胞(HL-60)(CCL-240，ATCC)
人體慢性白血病細(xì)胞(K562)(CCL-243，ATCC)實體瘤(S180)(TIB-66，ATCC)人體乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)(HTB-22，ATCC)人體肝癌細(xì)胞(HepG2)(HB-8065，ATCC)正常猴腎細(xì)胞(VERO)(CCL-81，ATCC)培養(yǎng)液主要有兩種培養(yǎng)液RPMI-1640(Sigma，R-6540)和DMEM(GIBCO，12100-046)。在使用之前加入10％胎牛血清(GIBCO，26140-079)，1％青霉素-鏈霉素(GIBCO，P0781)及0.1％兩性霉素B(GIBCO，15290-018)。
培養(yǎng)條件與檢測方法各組細(xì)胞(HL-60，K562，S180)培養(yǎng)72小時后，加入等量的0.4％臺盼藍(lán)(Trypan blue)進(jìn)行染色，在顯微鏡下計數(shù)活細(xì)胞，從而計算出細(xì)胞生長抑制率。
在細(xì)胞(MCF-7，HepG2，VERO)培養(yǎng)72小時后，以噻唑藍(lán)(MTT)比色法作為測定方法。MTT被加進(jìn)細(xì)胞后會放置在保溫箱5小時，然后倒去所有培養(yǎng)液(包括MTT)，再加入異丙醇作為溶液，待其完全溶解后在酶聯(lián)反應(yīng)儀上測量于570nm波長的吸光度值，從而計算出細(xì)胞生長抑制率。
流式細(xì)胞儀的分析方法2×105cells/ml濃度的細(xì)胞與200μg/ml的HWE1一同培養(yǎng)，并于24，48，72時后以流動細(xì)胞分析儀(Beckman Coutler，XL-MCL，USA)檢測并且用Multicycle Analysis AV software(Phoenix Flow Systems，San Diego，USA)作出分析。
動物實驗由中文大學(xué)實驗動物中心提供7-8星期的雄性小白鼠(每一組均由十只白鼠組成)。0.2毫升的無菌HWE1(20mg/kg)連續(xù)十天注射進(jìn)小鼠腹腔。在殺死小鼠并且切除其腫瘤后，已注射HWE1的小鼠組別與對照組之腫瘤的重量會作出比較，從而計算出HWE1對實體瘤的抑制比率。
統(tǒng)計學(xué)方法數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，利用組間t檢驗(t-test)分析組間差異。
B.結(jié)果體外活性實驗表明，該多糖蛋白復(fù)合物對人體乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)和HepG2肝癌細(xì)胞無抑制作用，對慢性白血病癌細(xì)胞(K562)顯示一定的抑制作用，而對人體急性白血病細(xì)胞(HL-60)和實體瘤(Sarcoma S-180)顯示完全抑制作用(見表2)，而且對正常猴腎細(xì)胞(Vero)的增殖無毒副作用。體內(nèi)活性實驗表明，該多糖蛋白復(fù)合物對植入雄性小白鼠(BALB/c)體內(nèi)的實體瘤(Sarcoma S-180)的生長具有明顯抑制作用(見表3)，同時對照組顯示該多糖蛋白復(fù)合物無毒副作用。
表2 虎乳靈芝提取物HWE1在不同濃度條件下的體外抗腫瘤活性(抑制％)

*p值小于0.05，與對照組比較有明顯差別；-檢測不到活性流動細(xì)胞儀檢測該多糖蛋白復(fù)合物體外對HL-60腫瘤細(xì)胞周期的影響，發(fā)現(xiàn)與腫瘤細(xì)胞作用24小時后，細(xì)胞的增殖開始在G1階段被阻斷，72小時后細(xì)胞死亡率達(dá)78％(見表5)。
體外活性可能是因為它阻斷腫瘤細(xì)胞周期的G1階段從而導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡。上述水溶性多糖蛋白復(fù)合物HWE1可作抗腫瘤藥物或提高機體免疫功能的保健品。
SonE的體外抗腫瘤活性不明顯，但是體內(nèi)活性實驗表明該提取物對植入雄性小白鼠(BALB/c)體內(nèi)的實體瘤(Sarcoma S-180)的生長具有明顯抑制作用(79.4％)，同時對照組顯示該提取物無毒副作用(見表3)。
表3虎乳靈芝提取物的體內(nèi)抗S180活性

HWE2的體外抗腫瘤活性不明顯，但是體內(nèi)活性實驗表明該提取物對植入雄性小白鼠(BALB/c)體內(nèi)的實體瘤(Sarcoma S-180)的生長具有一定的抑制作用(64.3％)，同時對照組顯示該提取物無毒副作用(見表3)。
CAE的體外抗腫瘤活性不明顯，但是體內(nèi)活性實驗表明該提取物對植入雄性小白鼠(BALB/C)體內(nèi)的實體瘤(Sarcoma S-180)的生長具有一定的抑制作用(43.7％)，同時對照組顯示該提取物無毒副作用(見表3)。
HAE的體外抗腫瘤活性不明顯，但是體內(nèi)活性實驗表明該提取物對植入雄性小白鼠(BALB/c)體內(nèi)的實體瘤(Sarcoma S-180)的生長具有較好的抑制作用(53.5％)，同時對照組顯示該提取物無毒副作用(見表3)。
實施例6虎乳靈芝提取物免疫力系統(tǒng)調(diào)控的生物活性分析A.材料與方法動物7-8星期大的雄性小白鼠由香港中文大學(xué)實驗中心提供(每一組均由十只小鼠組成)，而它們并未被植入實體瘤及未有被注射LPS。
給藥方法5mg/kg或50mg/kg的HWE1會連續(xù)十天被注射進(jìn)小鼠腹腔內(nèi)。
檢測方法血清從血液分離后，會采用細(xì)胞因子芯片測試內(nèi)含細(xì)胞因子水平，及后再以ELISA作量化。另外，被注射HWE1小白鼠的脾臟重量會與對照組作出比較，從而檢視免疫系統(tǒng)有否因HWE1而提升。
B.結(jié)果采用細(xì)胞因子芯片測試發(fā)現(xiàn)，接受該多糖蛋白復(fù)合物注射的小鼠體內(nèi)血清中與對照組相比含有較高水平的細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素(interleukin)IL-5，IL-6，IL-9，IL-10，IL-12和IL-13等，其中尤以IL-13的增加最為明顯(見表4)。
接受該多糖蛋白復(fù)合物(HWE1)注射的小鼠體內(nèi)脾臟重量與對照組相比有顯著地增加(見表4)。因此，該多糖蛋白復(fù)合物的體內(nèi)活性可能是因為它調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)促進(jìn)細(xì)胞因子水平的提高和脾臟的增大。
表4 水溶性提取物HWE1腹腔注射給藥后，BALB/c小鼠體內(nèi)白細(xì)胞介素(IL-13)含量和脾臟重量的變化

*增加百分率的計算[(給藥組-對照組)/對照組]×100％#用ELISA方法測28.5-251表示，給藥組(劑量50mg/kg)中個體小鼠體內(nèi)IL-13增加的百分含量最少28.5％，最多251％；同樣，11.5-154表示劑量為(5mg/kg)的給藥組中個體小鼠體內(nèi)IL-13增加的百分含量最少11.5％，最多154％。
表5.HWE1與腫瘤細(xì)胞HL-60和K562分別作用24，48，72小時后，不同細(xì)胞周期的百分比

*表示，統(tǒng)計分析的結(jié)果顯示于對照組有明顯差別，p值小于0.05。
總的來說，虎乳靈芝這五種提取物無毒副作用，都具有較好的體內(nèi)抗S180腫瘤活性。SonE，CAE，HAE，HWE2這四種提取物的體外抗腫瘤細(xì)胞株的活性不明顯。只有HWE1同時具有非常顯著的體內(nèi)體外活性，成份分析表明HWE1是一種多糖蛋白復(fù)合物，它在體內(nèi)可以增強免疫系統(tǒng)的功能，提高細(xì)胞因子IL-13表達(dá)水平和脾臟的增大；在體外可以阻斷腫瘤細(xì)胞(HL-60)周期的G1階段從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的凋亡。這些多糖提取物，尤其是HWE1，可用于制備抗腫瘤藥物和提高機體免疫功能的保健品。
應(yīng)該理解，本發(fā)明的實施例僅是為了更好地理解本發(fā)明而對本發(fā)明做出的非限制性說明。本領(lǐng)域的技術(shù)人員在沒有偏離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)可對本發(fā)明做出各種修改、替換和變更，這些修改、替換和變更仍屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
參考文獻(xiàn)[1]黃年來，食用菌學(xué)報，1999，6(1)30-32[2]Mosmann，T.(1983).細(xì)胞生長和活存的快速比色分析在增殖與細(xì)胞毒性分析中的應(yīng)用(Rapid colorimetric assay for cellular growth and survivalapplication to proliferation and cytotoxicity assay).J.Immunol.Methods.63，55-63. Wang，C.C.Huang，R.P.Lisoukov，H.Sommer，M.Huang，R.Lin，Y.andBurke，J.(2002).人細(xì)胞因子與趨化因子的陣列為寄基礎(chǔ)的多元篩選與定量(Array-based multiplex screening and quantitation of human cytokines andchemokines).J.Proteome Res.1，337-343. Loken，M.R.and Stall，A.M.(1982).免疫學(xué)中流式細(xì)胞儀作為分析和制備的工具(Flow cytometry as an analytical and preparative tool in immunology).J.Immunol.Methods.50.R85-R112.
權(quán)利要求
1.虎乳靈芝提取物，含有占所述提取物55％-65％重量百分比的蛋白質(zhì)。
2.如權(quán)利要求1所述的提取物，還含有占所述提取物45％-35％重量百分比的多糖。
3.如權(quán)利要求2所述的提取物，其中所述的多糖含有80-97％的葡萄糖。
4.如權(quán)利要求2所述的提取物，其中所述多糖含有80.5-85.5％重量百分比的葡萄糖，11-13％重量百分比的甘露糖，2.0-3.0％重量百分比的半乳糖，1.0-2.0％重量百分比的核糖，和0.5-1.5％重量百分比的鼠李糖。
5.如權(quán)利要求1-4中任一權(quán)利要求的虎乳靈芝提取物，其中所述提取物由下列方法制備，包括將虎乳靈芝與熱水混合提取1-2小時；收集上清。
6.如權(quán)利要求5所述的提取物，其中所述虎乳靈芝與熱水的比例為1∶25。
7.如權(quán)利要求5-6中任一權(quán)利要求所述的提取物，其中所述的熱水的溫度為95-100℃。
8.如權(quán)利要求5-7中任一權(quán)利要求所述的提取物，其中所述上清是通過離心方法獲得的。
9.如權(quán)利要求8所述的提取物，其中所述的離心方法為9,000-10,000×g離心20-40分鐘。
10.權(quán)利要求1-9中任一權(quán)利要求所述提取物的制備方法，包括將虎乳靈芝與熱水混合提取1-2小時；收集上清。
11.虎乳靈芝提取物，含有占所述提取物95％以上重量百分比的多糖。
12.如權(quán)利要求11所述的提取物，其中所述多糖含有占所述多糖95％以上重量百分比的葡萄糖。
13.如權(quán)利要求11所述的提取物，其中所述多糖含有90-98％重量百分比的葡萄糖；和1-2％重量百分比的葡萄糖胺。
14.如權(quán)利要求11-13中任一權(quán)利要求所述的提取物，其中所述提取物是由以下方法制備的，包括將虎乳靈芝菌核粉末浸泡在堿溶液中24-48小時；進(jìn)行超聲處理；收集上清。
15.如權(quán)利要求14所述的提取物，其中所述方法還包括在所述超聲處理之前用酸中和混合物。
16.如權(quán)利要求14或15所述的提取物，其中所述虎乳靈芝菌核粉末與所述堿溶液的重量體積比例為1∶20至1∶25。
17.如權(quán)利要求14-16任一權(quán)利要求所述的提取物，其中所述超聲處理是在冰浴下攪拌進(jìn)行的。
18.如權(quán)利要求14-17任一權(quán)利要求所述的提取物，其中所述超聲處理進(jìn)行20-30分鐘。
19.如權(quán)利要求14所述的提取物，其中所述堿溶液為1M的氫氧化鈉水溶液。
20.如權(quán)利要求15所述的提取物，其中所述酸為4M鹽酸。
21.如權(quán)利要求14-20任一權(quán)利要求所述的提取物，其中所述上清是通過離心收集的。
22.如權(quán)利要求21所述的提取物，其中所述離心為9,000-10,000×g條件下離心20-40分鐘。
23.如權(quán)利要求14-22中任一權(quán)利要求所述的提取物，還包括將所述上清中的鹽去除。
24.權(quán)利要求13-23中任一權(quán)利要求所述的提取物的制備方法，包括將虎乳靈芝菌核粉末浸泡在堿溶液中24-48小時；進(jìn)行超聲處理；收集上清。
25.抗腫瘤細(xì)胞增殖的藥物組合物或功能食品，其含有有效量的權(quán)利要求1-9或權(quán)利要求11-23中任一權(quán)利要求所述的虎乳靈芝提取物。
26.增強免疫功能的藥物組合物或功能食品，其含有有效量的權(quán)利要求1-9或權(quán)利要求11-23中任一權(quán)利要求所述的虎乳靈芝提取物。
27.乳靈芝提取物在制備含有其抗腫瘤細(xì)胞增殖的藥物組合物或功能食品中的用途，其中所述虎乳靈芝提取物選自權(quán)利要求1-9或權(quán)利要求11-23中任一權(quán)利要求所述的虎乳靈芝提取物。
28.虎乳靈芝提取物在制備含有其增強免疫功能的藥物組合物或功能食品中的用途，其中所述虎乳靈芝提取物選自權(quán)利要求1-9或權(quán)利要求11-23中任一權(quán)利要求所述的虎乳靈芝提取物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種藥用菇類－虎乳靈芝提取物的制備方法和其組成特征。這些提取物對癌細(xì)胞顯示很強的抗增殖作用，可以調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能。本發(fā)明涉及的以上提取物的藥學(xué)組合物在癌癥預(yù)防和治療方面很有效，也可以作為免疫增強劑使用。本發(fā)明還提供了一種以含有有效劑量的上述提取物為活性成分的功能食品。
文檔編號A61P35/00GK1951403SQ200510114299
公開日2007年4月25日 申請日期2005年10月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月21日
發(fā)明者張志強, 黎建明, 張玫, 招志明, 黃榮春 申請人:香港中文大學(xué)