專利名稱：體外光除去法與抗－tnf治療的組合的制作方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及免疫相關(guān)病癥的治療。
自身免疫疾病包括與自身組織抗性反應(yīng)的免疫細(xì)胞的不適當(dāng)活化作用。這些活化的免疫細(xì)胞促進(jìn)與該疾病病理學(xué)相關(guān)的細(xì)胞因子和自身抗體的產(chǎn)生。其它包含T-細(xì)胞的疾病包括發(fā)生在移植事件中的移植物抗宿主病(GVHD)。在GVHD中供體T-細(xì)胞通過對受體身體發(fā)動攻擊而排斥受體的組織和器官。宿主的其它疾病包括宿主免疫系統(tǒng)的無規(guī)則性。一些用藥物能很好地治療，一些用生物方法，其它的用例如體外光除去法治療，而還有一些治療選擇很有限。
體外光除去法(ECP)在某些T-細(xì)胞介導(dǎo)的疾病中已顯示出一種有效的治療。在GVHD情況下，光除去法已被用作與典型的氟羥脫氫皮醇膏劑、抗真菌、抗病毒、抗生素、免疫球蛋白和氨甲蝶呤一起聯(lián)合治療。ECP也已與免疫抑制劑如霉酚酸酯、他克莫司、強(qiáng)的松、環(huán)孢菌素、羥氯喹、類固醇、FK-506和用于cGVHD和難治cGVHD的沙立度胺一起使用。對于實(shí)體器官移植，ECP已與免疫抑制劑聯(lián)合使用以減少與腎同種異體移植和心臟移植相關(guān)的急性同種異體移植排斥事件的數(shù)量。例如，ECP已與OKT3和/或免疫抑制劑強(qiáng)的松、硫唑嘌呤和環(huán)孢菌素一起使用，以逆轉(zhuǎn)急性腎同種異體移植排斥。ECP也已與環(huán)磷酰胺、分次全身照射和鬼臼亞乙苷一起用于急性骨髓白血病、急性淋巴母細(xì)胞白血病、慢性骨髓白血病、非霍奇金淋巴瘤或者嚴(yán)重再生障礙性貧血的異體基因骨髓移植。
盡管目前ECP與其它治療劑的聯(lián)合使用，仍然需要一種ECP與伴隨劑的組合以治療患有免疫介導(dǎo)疾病、特異性超敏感癥或者GVHD的患者，現(xiàn)有的治療不象它們可能的那么有效，或者它們可能具有嚴(yán)重的副作用或者很難以任一治療其自身釋放的水平給藥。
單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子(TNF-α)在對內(nèi)毒素或者其它刺激物的應(yīng)答中作為一種細(xì)胞因子。TNF-α是一種17kD蛋白亞單位的可溶性同源三聚體。除了單核細(xì)胞或者巨噬細(xì)胞外的細(xì)胞也產(chǎn)生TNF-α。例如，人非單核細(xì)胞腫瘤細(xì)胞系能產(chǎn)生TNF。TNF-α已涉及炎癥疾病、自身免疫疾病、病毒、細(xì)菌和寄生蟲感染、惡性腫瘤和/或神經(jīng)發(fā)生性疾病，是一種疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和局限性回腸炎的特定生物治療有用靶物質(zhì)，抗體給藥作為一種治療已經(jīng)不是問題。例如，用一種TNF-α拮抗劑，在某些情況下已經(jīng)有助于嚴(yán)重感染的發(fā)生。減少該物質(zhì)的劑量會減少治療的并發(fā)癥。
成功使用TNF拮抗劑如英夫單抗和etanercept與氨甲蝶呤(MTX)組合用于關(guān)節(jié)炎治療已有報(bào)道，這些試劑中的幾個(gè)目前被制定規(guī)章機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)用于該用途。這些試劑對于關(guān)節(jié)炎治療已向前進(jìn)的一大步，由于各種原因?qū)嵸|(zhì)上存在少數(shù)病人，他們對于這些試劑不應(yīng)答或者應(yīng)答較弱。對于患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的病人仍然存在難治療的問題。許多目前的治療具有高的副反應(yīng)發(fā)生率或者不能完全防止疾病發(fā)展。即使像氨甲蝶呤、類固醇和其它化學(xué)治療劑的試劑在各種免疫疾病包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療中有很長的使用歷史，使用這些化合物的病人可能具有較大的毒作用，如肝、肺、腎和骨髓的異常。使用這些化合物的病人可能也具有較小的副作用如口腔炎、身體不適、惡心、腹瀉、頭痛和輕微脫發(fā)；然而，這些可以補(bǔ)充葉酸治療。因此，需要一種更安全的、除目前批準(zhǔn)的產(chǎn)品以外的與TNF拮抗劑一起組合治療關(guān)節(jié)炎。
發(fā)明概述一方面，本發(fā)明是一種用有效量的程序性死亡細(xì)胞和TNFα拮抗劑的組合來治療患有自身免疫疾病或反應(yīng)、特應(yīng)性疾病、GVHD或者移植排斥的個(gè)體的方法。
另一方面，本發(fā)明是一種在移植之前用體外光除去法和TNFα拮抗劑的組合來治療移植供體和/或移植受體，或者植入受體的方法。
另一方面，在收獲移植之前用體外光除去法和TNFα拮抗劑的組合來治療移植供體。還有另一方面，移植受體在接受移植后進(jìn)行進(jìn)一步治療。
還有另一方面，在接受植入之前用體外光除去法和TNFα拮抗劑的組合來治療植入受體。植入受體接受植入后可能進(jìn)行進(jìn)一步治療。
還有另一方面，在ECP中使用的可光活化化合物是補(bǔ)骨脂素或者補(bǔ)骨脂素衍生物。
本發(fā)明的方法通過能降低TNFα抑制劑的劑量(因而減少了毒性)、延長輸注之間的時(shí)間和增加細(xì)胞治療(如ECP)和TNFα抑制劑的功效，改善了GVHD和其它免疫相關(guān)病癥的治療。
發(fā)明詳述說明書中引用的所有參考文獻(xiàn)以其整體加入到該說明中。術(shù)語“個(gè)體”或者“患者”可交換使用，指一種動物，優(yōu)選哺乳動物，更優(yōu)選人。
一個(gè)“細(xì)胞群”一般包括血液中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)細(xì)胞類型。該術(shù)語可以包括一個(gè)或更多類型的血細(xì)胞，特別地，紅細(xì)胞、血小板和白細(xì)胞。一個(gè)細(xì)胞群可以包含白細(xì)胞的亞型，例如，T-細(xì)胞、樹狀細(xì)胞、B-細(xì)胞等。在一個(gè)實(shí)施方案中，一個(gè)細(xì)胞群可以包含一種細(xì)胞類型的混合物或者庫?？晒┻x擇地，一個(gè)細(xì)胞群可以包含一個(gè)基本上純化的細(xì)胞類型，例如，T-細(xì)胞或者樹狀細(xì)胞。
“ECP處理過程”或者“ECP”是指體外光除去法，也被認(rèn)為是體外光治療。它是一種細(xì)胞群經(jīng)受UVA光和可光活化化合物的治療。優(yōu)選細(xì)胞群源自器官或組織；更優(yōu)選地，細(xì)胞群是血液的一部分；最優(yōu)選地，細(xì)胞群是血沉棕黃層。ECP有時(shí)用于其中存在DNA交聯(lián)劑如補(bǔ)骨脂素(優(yōu)選8-MOP)時(shí)用UVA光使細(xì)胞群經(jīng)受程序性細(xì)胞死亡誘導(dǎo)程序的過程。
本說明書中所指的副作用是治療性伴隨劑的不想要的和不利的作用。不利作用總是不想要的，但是不想要的作用不一定是不利的。治療劑的不利作用可能是有害的或者不舒服的或者危險(xiǎn)的。用抗TNF-α給藥治療的副作用可能包括，但不限于感染和超敏感反應(yīng)的危險(xiǎn)。其它副作用的范圍從非特異性癥狀如發(fā)燒或者受風(fēng)寒、搔癢癥或者風(fēng)疹，與心肺相關(guān)的反應(yīng)如胸痛、低血壓、高血壓或者呼吸困難，到如肌痛和/或關(guān)節(jié)痛、皮疹、面部、手或嘴唇浮腫、吞咽困難、喉嚨痛和頭痛等作用。還有其它副作用可能包括，但不限于腹部疝氣、脾臟梗死、脾腫大、眩暈、上部運(yùn)動神經(jīng)元損傷、紅斑狼瘡綜合病癥、類風(fēng)濕性結(jié)節(jié)、耵聹分泌過多、腹痛、腹瀉、胃潰瘍、腸梗阻、腸穿孔、腸狹窄、惡心、胰腺炎、嘔吐、背痛、骨折、腱病癥或損傷、心衰竭、心肌萎縮、淋巴瘤、血小板減少、蜂窩組織炎、焦慮、慌亂、精神錯(cuò)亂、壓抑、嗜眠、自殺企圖、貧血、砂眼、細(xì)菌感染和膿血癥。
術(shù)語“病癥”和“疾病”在本說明書中可交換使用。術(shù)語“特應(yīng)性疾病”可與術(shù)語“炎癥病癥”交換使用，是指個(gè)體的一種情形，其特征是炎癥如慢性炎癥。自身免疫病癥可能與或者可能不與炎癥相關(guān)。此外，炎癥可能是或者可能不是由自身免疫病癥引起的。因此，某些病癥可能具有自身免疫和炎癥病癥的特征。
本發(fā)明的伴隨劑包括一種與TNF-α相關(guān)的免疫調(diào)節(jié)劑。一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合治療中使用的免疫調(diào)節(jié)劑是一種TNF-α拮抗劑。這些優(yōu)選地為REMICADE、HUMIRA或者ENBREL治療劑。也可以使用具有TNF-α抑制作用的小分子如p38抑制劑進(jìn)行治療。
本發(fā)明的腫瘤壞死因子抗體或者它們的片斷和其類似物在體外、原位和/或優(yōu)選在體內(nèi)降低、阻止、抑制、取消或者干擾TNFα活性。例如，本發(fā)明合適的人抗體可以結(jié)合TNFα，包括特異性結(jié)合TNFα的抗-TNF抗體、其抗原結(jié)合片斷和其特定的突變體或者結(jié)構(gòu)域。一個(gè)合適的抗-TNFα抗體或者片斷也能降低、阻止、取消、干擾、防止和/或抑制TNF RNA、DNA或者蛋白質(zhì)的合成、TNFα的釋放、TNFα受體信號、膜TNFα剪切、TNFα活性、TNFα產(chǎn)生和/或合成。
嵌合抗體cA2由高親和性中和小鼠抗人TNFαIgG1抗體的抗原結(jié)合可變區(qū)、設(shè)計(jì)的A2和人IgG1的恒定區(qū)、kappa免疫球蛋白組成。人IgG1 Fc區(qū)增強(qiáng)了異源抗體效應(yīng)物功能，增加了循環(huán)血清的半衰期和降低了抗體的免疫原性。嵌合抗體cA2的親和力和表位特異性源自鼠抗體A2的可變區(qū)。一個(gè)特別的實(shí)施方案中，編碼鼠抗體A2可變區(qū)的核酸的優(yōu)選來源是A2雜交瘤細(xì)胞系。
嵌合體A2(cA2)以劑量依賴的方式幫助中和天然和重組人TNFα的細(xì)胞毒素作用。根據(jù)嵌合抗體cA2和重組人TNFα的結(jié)合試驗(yàn)，計(jì)算出嵌合抗體cA2的親和常數(shù)為1.04×1010M-1。
一個(gè)特別的實(shí)施方案中，鼠單克隆抗體A2是由命名為c134A的細(xì)胞系產(chǎn)生的。嵌合抗體cA2是由命名為c168A的細(xì)胞系產(chǎn)生的?？捎糜诒景l(fā)明中的單克隆抗-TNFα抗體的另外例子描述在文獻(xiàn)中(見例如美國專利5,231,024；Moller，A.等人，Cytokine 2(3)162-169(1990)；美國專利申請07/943,852(1992-09-11)；Rathjen等人，國際公開號WO91/02078(1991-02-21公開)；Rubin等人，EPO專利公開號0 218 868(1987-04-22公開)；Yone等人，EPO專利公開號0 288 088(1988-10-26)；Liang，等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.137847-854(1986)；Meager，等人，Hybridoma 6305-311(1987)；Fendly等人，Hybridoma6359-369(1987)；Bringman，等人，Hybridoma 6489-507(1987)；和Hirai，等人，J.Immunol.Meth.9657-62(1987)。
本發(fā)明中有用的優(yōu)選的TNF受體分子是高親和性結(jié)合TNFα和選擇地?fù)碛械兔庖咴缘哪切┓肿?。特別的，55kDa(p55 TNFα-R)和75kDa(p75TNF-R)TNFα細(xì)胞表面受體在本發(fā)明中是有用的。這些受體的截?cái)嘈问剑ㄊ荏w的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(ECD)或者其功能部分在本發(fā)明中也是有用的。TNF接受者的截?cái)嘈问剑‥CD，已在尿和血清中被檢測到為30kDa和40kDaTNF-α抑制性結(jié)合蛋白。
本發(fā)明中有用的TNFα受體多聚體分子包含兩個(gè)或多個(gè)TNFα受體的ECD的所有或者功能部分，其通過一個(gè)或多個(gè)多肽連接體或者其它非肽連接體如聚乙二醇(PEG)連接。多聚體分子可以進(jìn)一步包含一個(gè)分泌蛋白質(zhì)的信號肽以指導(dǎo)多聚體分子的表達(dá)。這些多聚體分子和它們的產(chǎn)生方法已在美國申請?zhí)?8/437,533(1995-05-09入檔)中描述了。
TNF受體分子的功能等同物、衍生物、片斷或區(qū)域是指TNF受體分子的部分，或者編碼TNFα受體分子的TNF受體分子序列的部分，其具有足夠大小和序列以功能類似于可用于本發(fā)明的TNFα受體分子(例如高親和性結(jié)合TNFα和擁有低免疫原性)。TNFα受體分子的功能等同物也包括修飾的TNFα受體分子，其功能類似于可用于本發(fā)明的TNFα受體分子(例如高親和性結(jié)合TNFα和擁有低免疫原性)。例如，TNFα受體分子的功能等同物可含有一個(gè)“沉默”密碼子或者一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代、缺失或添加(例如一個(gè)酸性氨基酸取代另一個(gè)酸性氨基酸；或者一個(gè)編碼相同或不同疏水性氨基酸的密碼子取代另一個(gè)編碼疏水性氨基酸的密碼子)。
優(yōu)選的人治療劑是那些高親和性抗體和片斷、區(qū)域和衍生物，其在體內(nèi)具有有效的TNFα抑制和/或阻止TNF誘導(dǎo)IL-6分泌的中和活性。也優(yōu)選的人治療用途是這些高親和性抗TNFα抗體，其片斷、區(qū)域和衍生物，其阻止TNF誘導(dǎo)的前凝血劑活性，包括在體內(nèi)和體外阻止TNF誘導(dǎo)的細(xì)胞粘附分子如ELAM-I和ICAM-I的表達(dá)以及阻止TNF促有絲分裂的活性。
本發(fā)明的TNFα拮抗劑優(yōu)選通過腸胃外、皮下、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)或者關(guān)節(jié)內(nèi)方式給藥。其它方式也是可能的，包括支氣管內(nèi)、腹內(nèi)、膠囊內(nèi)、軟骨內(nèi)、腔內(nèi)、腹腔內(nèi)、小腦內(nèi)、腦室內(nèi)、結(jié)腸內(nèi)、子宮頸內(nèi)、胃內(nèi)、肝內(nèi)、心肌內(nèi)、骨骼內(nèi)、骨盆內(nèi)、心包內(nèi)、腹膜內(nèi)、胸膜內(nèi)、前列腺內(nèi)、肺內(nèi)、直腸內(nèi)、腎內(nèi)、視網(wǎng)膜內(nèi)、脊髓內(nèi)、滑膜內(nèi)、胸內(nèi)、子宮內(nèi)、膀胱內(nèi)、丸劑、陰道、直腸、口腔、舌下、鼻內(nèi)或者經(jīng)皮膚的方式。
本發(fā)明的實(shí)施方案中提供了防止、治療或者改善個(gè)體中與自身免疫或者特應(yīng)性疾病相關(guān)的一個(gè)或更多癥狀的組合治療，該治療包括給予個(gè)體一個(gè)細(xì)胞群，該細(xì)胞群已經(jīng)經(jīng)受了程序性細(xì)胞死亡誘導(dǎo)處理，例如，細(xì)胞群已經(jīng)進(jìn)行了體外光除去法(ECP)，和至少一種TNFα拮抗劑。
ECP和伴隨劑(即TNFα拮抗劑)的組合在個(gè)體中產(chǎn)生了比任一單獨(dú)治療更好的治療作用。在某些實(shí)施方案中，ECP和伴隨劑的組合在患有自身免疫疾病、特應(yīng)性疾病、GVHD或移植排斥的個(gè)體中取得了任一單獨(dú)治療的2倍或更好(優(yōu)選10至20倍)的治療作用。在其它實(shí)施方案中，ECP和一個(gè)或多個(gè)TNF拮抗劑的組合在患有自身免疫疾病、特應(yīng)性疾病、GVHD和植入或移植排斥的個(gè)體中具有更多的附加作用。本發(fā)明的組合治療對患有自身免疫或者特應(yīng)性疾病的個(gè)體能降低ECP給藥的頻率以達(dá)到治療作用；能降低用于結(jié)合ECP以防止或者治療自身免疫性免疫疾病、特應(yīng)性疾病或者GVHD的TNFα拮抗劑的劑量和/或?qū)加凶陨砻庖呒膊?、特?yīng)性疾病或者GVHD的個(gè)體降低TNFα拮抗劑給藥的頻率，以達(dá)到治療作用。它們減少或避免了與用于自身免疫疾病、特應(yīng)性疾病或者GVHD的目前單獨(dú)試劑治療和/或現(xiàn)有的組合治療給藥相關(guān)的不想要的或不利的副作用，其依次改善了患者對治療的方案服從。
降低對患有自身免疫或特應(yīng)性疾病的個(gè)體進(jìn)行ECP或者伴隨劑給藥的劑量和/或頻率，改善了經(jīng)歷該治療的患者的生活質(zhì)量。對患有自身免疫或炎癥疾病的個(gè)體進(jìn)行ECP或者伴隨劑給藥的劑量和/或頻率可以降低，且在患者特定器官、組織或關(guān)節(jié)的炎癥中仍然達(dá)到20％或更高的效果(優(yōu)選90％-98％或更大的降低)。
一個(gè)實(shí)施方案中，使用ECP與單克隆抗-TNFα抗體組合。最優(yōu)選的單克隆抗TNF抗體是英夫單抗(Remicade)、etanercept(Enbrel)和(HUMIRA)。一個(gè)特別的實(shí)施方案中，用于本發(fā)明的組合和方法中的TNFα拮抗劑是英夫單抗(REMICADE)；Centocor)，其衍生物、類似物或者抗原結(jié)合片斷。英夫單抗(REMICADE)是一種結(jié)合腫瘤壞死因子α(TNF-α)的嵌合單克隆抗體。英夫單抗一般給藥的劑量是每4至8周約1至20mg/kg體重。根據(jù)個(gè)體給藥劑量可以為每4至8周約3至10mg/kg體重。
本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，REMICADE(英夫單抗)是以靜脈輸注的無菌凍干粉供給的，用10ml無菌水重組用于注射。每個(gè)單獨(dú)用小瓶REMICADE(英夫單抗)含有100mg英夫單抗、500mg蔗糖、0.5mg聚山梨醇酯80、2.2mg磷酸二氫鈉和6.1mg磷酸氫二鈉。根據(jù)醫(yī)師工作參考(55ed.，2001)，重組產(chǎn)物的總劑量必須進(jìn)一步用0.9％氯化鈉注射液，USP稀釋至250ml，輸注濃度范圍介于0.4mg/ml和4mg/ml之間。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，REMICADE的推薦劑量是0.1至10mg/kg，更優(yōu)選1至7mg/kg，甚至更優(yōu)選2至6mg/kg，最優(yōu)選3至5mg/kg。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，劑量不超過3mg/kg。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，REMICADE(英夫單抗)通過靜脈內(nèi)輸注給藥，接著在首次輸注后，在2和6周以附加劑量，然后每8周進(jìn)行。
本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，REMICADE(英夫單抗)以約為0.01mg/kg至50mg/kg的劑量與ECP組合給藥，更優(yōu)選約為1mg/kg至40mg/kg，最優(yōu)選約為2.5mg/kg至約20mg/kg。更優(yōu)選的實(shí)施方案中，當(dāng)協(xié)同作用很強(qiáng)且疾病許可(如GVHD)時(shí)，Remicade的量顯著地較低以降低毒性。在這些實(shí)施方案中，ECP和/或抗TNFα治療的頻率減少20％，更優(yōu)選40％，最優(yōu)選至少50％。因此，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過靜脈內(nèi)輸注給予最多600mgREMICADE(英夫單抗)，接著在首次輸注后，在2和6周給予附加劑量，然后每8周進(jìn)行。其它的實(shí)施方案中，在1至12周給予附加劑量，優(yōu)選4至12周，更優(yōu)選6至12周，甚至更優(yōu)選8至12周；優(yōu)選每隔一周給予ECP治療一天或者，更優(yōu)選，每月一次，總計(jì)不超過20次治療。
另一方面，本發(fā)明的組合物和方法中使用的TNF-α拮抗劑是etanercept(ENBREL)或者adalimulab(HUMIRA)，或者其片斷、衍生物或類似物。Etanercept(例如ENBREL)是一種結(jié)合腫瘤壞死因子(TNF)和阻止其與TNF受體相互作用的二聚體融合蛋白。一般給予etanercept的劑量約為成人每周10至100mg，優(yōu)選劑量約為每周50mg。青少年個(gè)體的劑量范圍約為每周0.1至50mg/kg體重，最大約為每周50mg。本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，ENBREL是以無菌無防腐劑凍干粉供給的，其用1ml供給的用于注射的無菌抑菌水，USP(含有0.9％苯甲基乙醇)重組后用于腸胃外給藥。根據(jù)醫(yī)師工作參考(55th ed.，2001)，每個(gè)單獨(dú)使用小瓶ENBREL含有25mg etanercept、40mg甘露醇、10mg蔗糖和1.2mg三羥甲基氨基甲烷。
ECP以任一順序與本發(fā)明的TNFα拮抗劑有順序地給藥。這也可以周期性實(shí)施。周期性治療包括給予伴隨劑一段時(shí)間，接著給予包含程序性死亡細(xì)胞的細(xì)胞群一段時(shí)間，且重復(fù)這樣順序的給藥。優(yōu)選地，包含程序性死亡細(xì)胞(如ECP期間獲得的)的細(xì)胞群在伴隨劑之前或之后至少約15-60分鐘給藥。然而，包含程序性死亡細(xì)胞的細(xì)胞群可以在TNFα拮抗劑之前或之后以更大的時(shí)間間隔給藥。例如，某些情況下可能在給予伴隨劑之前或之后至少約1天至30天或更長，用包含程序性死亡細(xì)胞的細(xì)胞群給藥，且仍然獲得該組合治療的有益作用。
本發(fā)明治療方法中有用的細(xì)胞群包含“程序性死亡細(xì)胞”，其包括細(xì)胞和細(xì)胞體，即程序性死亡細(xì)胞體，其呈現(xiàn)或?qū)⒁尸F(xiàn)一種或多種程序性死亡描述的特征。程序性死亡細(xì)胞可以包含處于誘導(dǎo)期、效應(yīng)期或者降解期的任何細(xì)胞。本發(fā)明治療中的細(xì)胞群也可以包含程序性死亡誘導(dǎo)劑處理過并仍然活著的細(xì)胞。例如，在對個(gè)體給藥后，該細(xì)胞可以在某點(diǎn)上呈現(xiàn)程序性死亡描述的特征。
ECP直接誘導(dǎo)顯著的程序性死亡水平。這已被觀察到，例如，在CTCL、GVHD和硬化病病人的淋巴細(xì)胞中。程序性死亡細(xì)胞有助于觀察到的臨床作用。
程序性死亡描述的特征可以包括，但不限于磷脂酰絲氨酸的表面暴露，如通過標(biāo)準(zhǔn)的、認(rèn)可的檢測方法如Annexin V染色觀察到的；通過標(biāo)準(zhǔn)的、認(rèn)可的方法(例如Salvioli et al.，411 FEBS LETTERS 77-82(1997))測量的線粒體膜滲透性的改變；DNA分裂的證據(jù)如從細(xì)胞中提取DNA后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳DNA梯度的出現(xiàn)(Teiger et al.，97 J.CLIN.INVEST.2891-97(1996))，或者通過原位標(biāo)記(Gavrieli et al.，1992，參考上面)。
本發(fā)明中使用的細(xì)胞群可以被誘導(dǎo)成來自體內(nèi)即體外進(jìn)行的程序性死亡，且與那些個(gè)體、供體或者受體的相容。細(xì)胞群實(shí)質(zhì)上可以從任何類型的哺乳動物細(xì)胞包括培養(yǎng)的細(xì)胞系中制備。例如，細(xì)胞群可以從源自哺乳動物個(gè)體自身的細(xì)胞類型或者從建立的細(xì)胞系中制備。特別地，細(xì)胞群可以從與哺乳動物個(gè)體血液相容的白細(xì)胞中，更優(yōu)選地，從個(gè)體自身的白細(xì)胞中，甚至更特別地從個(gè)體自身的T細(xì)胞中制備。
細(xì)胞群也可以從建立的細(xì)胞系中制備。本發(fā)明方法中可能有用的細(xì)胞系包括，例如Jurkat細(xì)胞(ATCC No.TIB-152)。本發(fā)明方法中適合使用的其它細(xì)胞系可以由本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員識別和/或檢測。在對個(gè)體、供體或受體給藥之前，可以體外制備細(xì)胞群。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，可以不考慮個(gè)體血液、受體血液或供體血液的等分試樣，例如通過靜脈穿刺，而且至少其白細(xì)胞的一部分在體外經(jīng)受了程序性死亡誘導(dǎo)的條件。
一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞群可以包含細(xì)胞的特定亞型包括，但不限于樹狀細(xì)胞、CD25+CD4 T-調(diào)節(jié)細(xì)胞和CD4+T-細(xì)胞。血液組分的分離和純化是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員熟知的。的確，血液組分治療的出現(xiàn)已經(jīng)引起許多設(shè)計(jì)用于特定血液組分收集的系統(tǒng)。這些收集系統(tǒng)的幾個(gè)可以從例如Immunicon公司(Huntingdon Valley，PA)、Baxter International(Deerfield，IL)和Dynal Biotech(Oslo，Norway)商業(yè)性獲得。
Immunicon的分離系統(tǒng)是使用與血樣中目標(biāo)組分連接即形成復(fù)合物的抗體包裹的磁納米顆粒(鐵磁流體)來分離血液組分。然后將血樣在強(qiáng)大的磁場中孵育，目標(biāo)復(fù)合物從剩余樣品中移出，然后可以將其收集。見例如美國專利6,365,362；6,361,749；6,228,624；6,136,182；6,120,856；6,013,532；6,013,188；5,993,665；5,985,153；5,876,593；5,795,470；5,741,714；5,698,271；5,660,990；5,646,001；5,622,831；5,597,531；5,541,072；5,512,332；5,466,574；5,200,084；5,186,827；5,108,933；和4,795,698。
Dynal’s DynabeadsBiomagnetic分離系統(tǒng)是使用與血樣中目標(biāo)組分連接的抗體包裹的磁珠，形成Dynabeads目標(biāo)復(fù)合物來分離血液組分。然后用磁粒濃縮器(Dynal MPC)將該復(fù)合物從樣品中除去。使用該分離系統(tǒng)可以收集幾個(gè)不同的細(xì)胞類型，包括例如源自單核細(xì)胞的樹狀細(xì)胞(單核細(xì)胞負(fù)向分離試劑盒，Prod.No.113.09)、源自CD34+細(xì)胞的樹狀細(xì)胞(DynalCD34原初細(xì)胞選擇系統(tǒng)，Prod.No.113.01)和人單核細(xì)胞(DynabeadsCD14用于分子分析的單核細(xì)胞正向分離，Prod.Nos.111.11或111.12)。T細(xì)胞和T細(xì)胞亞型也可以正向或負(fù)向從自全血、血沉棕黃層、梯度單核細(xì)胞或組織消化物中分離或排除，使用例如CELLectionTMCD2試劑盒(Prod.No.116.03)、DynabeadsM-450CD2(Prod.No.111.01/02)、DynabeadsCD3(Prod.No.111.13/14)、Dynabeadsplus DETACHaBEAD(Prod.No.113.03)、DynabeadsM-450 CD4(Prod.No.111.05/06)、CD4負(fù)向分離試劑盒(Negative Isolation Kit)(T輔助/誘導(dǎo)細(xì)胞)(Prod.No.113.17)、CD8正向分離試劑盒(Positive Isolation Kit)(Prod.No.113.05)、DynabeadsCD8(Prod.No.111.07/08)、CD8負(fù)向分離試劑盒(Negative Isolation Kit)(Prod.No.113.19)、T細(xì)胞負(fù)向分離試劑盒(NegativeIsolation Kit)(Prod.No.113.11)、DynadeadsCD25(Prod.No.111.33/34)和DynabeadsCD3/CD28 T細(xì)胞擴(kuò)增器(Prod.No.111.31)。Baxter International已發(fā)展了幾個(gè)基于離心特性的脫落系統(tǒng)，包括CS-3000血細(xì)胞分離器、Amicus分離器和Autopheresis-C系統(tǒng)。CS-3000 Plus血細(xì)胞分離器能收集細(xì)胞脫落產(chǎn)物和血漿。它包含一個(gè)具有收集脫落產(chǎn)物的雙室離心系統(tǒng)的持續(xù)流動分離器。Amicus以持續(xù)流動或間斷流動形式操作來收集單個(gè)供體的血小板和血漿。Autopheresis-C系統(tǒng)被設(shè)計(jì)用于收集供體的血漿，且能收集多于250mL的血漿。一般見美國專利6,451,203；6,442,397；6,315,707；6,284,142；6,251,284；6,033,561；6,027,441；和5,494,578。
本發(fā)明最優(yōu)選的實(shí)施方案中，ECP用于誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡。這包括添加可光活化化合物到來自體內(nèi)的細(xì)胞群。該光敏感化合物可以給予包含血細(xì)胞的細(xì)胞群，接著在紫外光暴露之前或之時(shí)，在情況可能時(shí)，將其從個(gè)體、受體或供體中回收，。如果目標(biāo)血細(xì)胞或血液組分接受光敏感化合物，則光敏感化合物可以給予包含全血或其片斷的細(xì)胞群。另一方面，個(gè)體血液、受體血液或者供體血液的部分能先用已知的方法處理以基本上除去紅細(xì)胞，然后光活性化合物可以給予得到的包含富有白細(xì)胞片斷的細(xì)胞群。
一個(gè)可供選擇的實(shí)施方案中，可光活化的化合物可以體內(nèi)給予。光敏感化合物，當(dāng)給予包含個(gè)體血液、受體血液或供體血液的細(xì)胞群時(shí)，情況可能時(shí)，在體內(nèi)可以口服給藥，但也可以靜脈內(nèi)給藥和/或通過其它常用的給藥途徑。光敏感化合物的口服劑量范圍可以為約0.3至0.7mg/kg，更特別地，約0.6mg/kg。當(dāng)口服給藥時(shí)，光敏感化合物可以在光除去法處理之前至少約1小時(shí)給予，且在光除去法處理之前不超過約3小時(shí)。
根據(jù)本發(fā)明使用的可光活化的化合物包括，但不限于已知的補(bǔ)骨脂素(或呋喃餅香豆精)及其衍生物化合物，如描述于例如美國專利4,321,919和美國專利5,399,719。優(yōu)選的化合物包括8-甲氧基補(bǔ)骨脂素；4，5′，8-三甲基補(bǔ)骨脂素；5-甲氧基補(bǔ)骨脂素；4-甲基補(bǔ)骨脂素；4，4-二甲基補(bǔ)骨脂素；4-5′-二甲基補(bǔ)骨脂素；4′-氨基甲基-4，5′，8-三甲基補(bǔ)骨脂素；4′-羥基甲基-4，5，8-三甲基補(bǔ)骨脂素；4′，8-甲氧基補(bǔ)骨脂素；和4-(ω-氨基2-氧雜)烷基-4，5′，8-三甲基補(bǔ)骨脂素，包括但不限于4-(4-氨基-2-氧雜)丁基-4，5，8-三甲基補(bǔ)骨脂素。一個(gè)實(shí)施方案中，可使用的光敏感化合物包含補(bǔ)骨脂素衍生物、amotosalen(S-59)(Cerus，Corp.，Concord，CA)。另一個(gè)實(shí)施方案中，光敏感化合物包含8-甲氧基補(bǔ)骨脂素(8MOP)。
將已加入可光活化化合物的細(xì)胞群用激活可光活化化合物的波長的光線處理。激活可光活化化合物的處理步驟優(yōu)選使用長波長紫外光(UVA)進(jìn)行，例如，波長范圍在320至400nm。光除去法處理期間紫外光的暴露優(yōu)選給予足夠長的時(shí)間以傳遞約1-2J/cm2給細(xì)胞群。
本發(fā)明方法中有用的體外光除去法儀器包括那些由Therakos，Inc.制造的，(Exton，PA)名稱為UVAR的儀器。該儀器的說明在美國專利4,683,889中可找到。UVAR系統(tǒng)使用一個(gè)處理系統(tǒng)，由三個(gè)階段組成，包括1)收集血沉棕黃層級分(富含白細(xì)胞)，2)照射收集的血沉棕黃層級分，和3)再輸注處理后的白細(xì)胞。收集階段有6個(gè)血液回收、離心和再輸注步驟的循環(huán)。每一循環(huán)期間，在一個(gè)提取碗中離心和分離全血。從該分離中，在每一收集循環(huán)中保存血漿(每次循環(huán)中由UVAR儀器操作者檢測的體積)和40ml血沉棕黃層。在開始下一個(gè)收集循環(huán)之前，將紅細(xì)胞和所有附加的血漿重新輸注給患者。最后，總計(jì)240ml血沉棕黃層和300ml血漿被分離并保存用于UVA照射。
在首次收集循環(huán)的血沉棕黃層收集期間，開始照射循環(huán)內(nèi)富含白細(xì)胞的血液的照射。用200ml肝素化標(biāo)準(zhǔn)鹽和200mg UVADEX(水溶性8-甲氧基補(bǔ)骨脂素)將收集的血漿和血沉棕黃層混合。該混合物通過插入兩層PHOTOSETTEUVA燈的PHOTOCEPTOR光活化室流入一個(gè)1.4mm的厚層。PHOTOSETTEUVA燈照射該UVA透明的PHOTOCEPTOR室的兩邊，允許暴露于紫外A光180分鐘，使每個(gè)淋巴細(xì)胞平均暴露為1-2J/cm2。最后的血沉棕黃層制備包含估計(jì)全部外周血單核細(xì)胞組分的20％至25％，且具有血細(xì)胞比容為2.5％至7％。光活化階段之后，將該容量在30至45分鐘內(nèi)重新輸注給患者。美國專利申請09/480,893(這里結(jié)合作參考)描述了另一個(gè)ECP給藥中使用的系統(tǒng)。美國專利5,951,509；5,985,914；5,984,887，4,464,166；4,428,744；4,398,906；4,321,919；PCT公開WO 97/36634；和WO 97/36581也包含在這點(diǎn)上有用的裝置和方法的說明。
本發(fā)明方法中可能有用的另一個(gè)系統(tǒng)在美國專利申請09/556,832中描述了。該系統(tǒng)包括一個(gè)儀器，通過它可減少在ECP期間從個(gè)體收集或除去的凈流量。傳送給細(xì)胞群的光能有效量可以使用美國專利6,219,584中描述的方法和系統(tǒng)檢測。
在細(xì)胞群中誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡的各種其它方法是熟知的，可以被本發(fā)明采納使用。一種這樣的處理包含使細(xì)胞群經(jīng)受電離輻射(γ-射線、X-射線等)和/或非電離電磁輻射包括紫外光、加熱、冷卻、血清剝奪、生長因子剝奪、酸化、稀釋、堿化、離子強(qiáng)度變化、血清剝奪、輻射或者其組合?？晒┻x擇地，程序性細(xì)胞死亡可以通過使細(xì)胞群經(jīng)受超聲波進(jìn)行誘導(dǎo)。
還有另外的誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡的方法，包含體外運(yùn)用氧化加壓給細(xì)胞群。這個(gè)可以通過在懸浮中用化學(xué)氧化劑如過氧化氫、其它過氧化物和過氧化氫物、臭氧、高錳酸鹽、高碘酸鹽及其類似物處理細(xì)胞群達(dá)到?？墒褂蒙飳W(xué)上可接受的氧化劑以減少與如此形成的程序性細(xì)胞死亡誘導(dǎo)的細(xì)胞群殘余和污染相關(guān)的潛在問題。
在制備程序性細(xì)胞死亡誘導(dǎo)的細(xì)胞群中，應(yīng)注意不要運(yùn)用過高水平的氧化壓、輻射、藥物治療等，因?yàn)榉駝t在治療中可能存在引起至少一些細(xì)胞壞死的重大危險(xiǎn)。壞死引起細(xì)胞膜破裂并釋放細(xì)胞內(nèi)容物，經(jīng)常伴有生物學(xué)上有害的后果，特別是炎癥事件，以致于最好避免壞死細(xì)胞和其組分與包含程序性死亡細(xì)胞的細(xì)胞群一起存在。誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡的細(xì)胞群處理的適合水平和選擇誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡的處理類型，是本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易確定的。
本發(fā)明的一個(gè)過程包含個(gè)體細(xì)胞或者相容性哺乳動物細(xì)胞系的培養(yǎng)。然后可將培養(yǎng)后的細(xì)胞體外處理以誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡，并從中產(chǎn)生細(xì)胞群?？蓮囊韵陆M中選擇體外處理抗體、化學(xué)治療劑、輻射、體外光除去法、超聲波、蛋白質(zhì)和氧化劑。然后，可以按照如下顯示的，對懸浮于個(gè)體血漿或者另外合適的懸浮培養(yǎng)基，如鹽或平衡的哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)基中的細(xì)胞給藥。
檢測和定量程序性細(xì)胞死亡的方法對于本發(fā)明中測定對個(gè)體給藥的制品中程序性細(xì)胞死亡的存在和水平是有用的。要求獲得所要求的個(gè)體臨床效益的細(xì)胞群中程序性死亡細(xì)胞的數(shù)量，可以根據(jù)細(xì)胞來源、個(gè)體條件、個(gè)體的年齡和體重及其它相關(guān)因素而改變，這通過熟知的方法很容易確定。優(yōu)選地，給予患者的程序性死亡細(xì)胞的數(shù)量為10至500億，更優(yōu)選地10至100且最優(yōu)選地25至75億。
一方面，可以通過瓊脂糖凝膠電泳上呈現(xiàn)的，由于DNA剪切成一系列片斷而產(chǎn)生的特征性梯狀DNA來識別經(jīng)受程序性死亡的細(xì)胞，。另一方面，細(xì)胞上磷脂酰絲氨酸的表面表達(dá)可以用于識別和/或定量程序性死亡誘導(dǎo)的細(xì)胞群。反映線粒體膜滲透性變化的線粒體膜電位變化的測量，是識別細(xì)胞群的另一個(gè)公認(rèn)的方法。許多識別經(jīng)受程序性死亡的細(xì)胞和細(xì)胞群的其它方法，許多對細(xì)胞群使用抗特定標(biāo)記的單克隆抗體，在科學(xué)文獻(xiàn)中也已經(jīng)描述了。
本發(fā)明程序性死亡細(xì)胞和TNF-α拮抗劑的給藥在治療關(guān)節(jié)炎和其它自身免疫疾病中發(fā)現(xiàn)了效用。其在細(xì)胞、組織、器官、動物或患者中的至少一種自身免疫相關(guān)疾病的治療或預(yù)防中也是有用的，包括但不限于急性和慢性免疫和自身免疫病癥，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、thyroidosis、移植物抗宿主病、硬皮病、糖尿病、葛雷夫斯氏病和類似的；特應(yīng)性疾病，如慢性炎癥病變和血管炎癥病變，包括慢性炎癥病變?nèi)缛鈽恿霾　⒙匝仔阅c病、潰瘍性結(jié)腸炎和Crohn’s病癥，以及血管炎癥病變，例如但不限于彌漫性血管內(nèi)凝血、動脈粥樣硬化和川崎病。
作為例子，通過本發(fā)明的方法處理實(shí)體器官移植比通過單獨(dú)給予TNF-α拮抗劑更加有效。肺移植后30％至60％的患者發(fā)生急性實(shí)體器官移植排斥，由于免疫抑制劑的成效，肝臟、腎臟、心臟等程度更低。淋巴細(xì)胞(細(xì)胞)介導(dǎo)的抗移植抗原的免疫反應(yīng)是急性排斥的主要機(jī)理。移植后幾個(gè)月至幾年內(nèi)延遲的或慢性的排斥引起移植破壞，且特點(diǎn)在于導(dǎo)致移植組織壞死的血管破壞。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)則該排斥通常在較大程度上不被抑制，因此更加持續(xù)的免疫耐受性的需要是一個(gè)明顯未滿足的需求。
偶爾發(fā)生晚期移植惡化，且該慢性類型排斥經(jīng)常危險(xiǎn)地發(fā)展，盡管增強(qiáng)了免疫抑制劑治療。該病理圖不同于急性排斥的。主要涉及動脈內(nèi)皮，具有大范圍的增殖，其可以逐漸地閉塞管腔，導(dǎo)致移植缺血和纖維化。
免疫抑制劑通常廣泛地用于控制排斥反應(yīng)，主要負(fù)責(zé)成功移植。然而，這些藥物抑制所有的免疫學(xué)反應(yīng)，因此在移植受體中使無法抵抗的感染成為死亡的主導(dǎo)原因。
在不同移植類型的情況下，存在的免疫抑制劑治療可以不同。肝臟的同種異體移植比其它器官的同種異體移植具有更少的攻擊性排斥。例如，在對HLA抗原或ABO不相容預(yù)敏感的患者中，肝臟移植的過急性排斥總是不會發(fā)生。成人中典型的免疫抑制劑治療包含使用環(huán)孢菌素，通常在移植時(shí)開始以4至6mg/kg/天給予IV型，然后當(dāng)供給達(dá)到耐藥性時(shí)給予8至14mg/kg/天。如果腎臟發(fā)生功能病癥，則向下調(diào)整劑量，且血液水平用作足夠劑量的近似測量。
在心臟移植中，免疫抑制劑控制類似于腎臟或肝臟移植的。然而，在肺和心肺移植中，急性排斥在＞80％的患者中發(fā)生但可以成功地控制。用皮質(zhì)甾類治療患者，以高劑量迅速地給予IV、ATG或者OKT3。在移植后的第一個(gè)兩周期間也經(jīng)常給予預(yù)防疾病的ALG或者OKT3。胰腺移植在血管化器官移植中是獨(dú)特的其嘗試穩(wěn)定或防止I型糖尿病目標(biāo)器官并發(fā)癥的破壞，而不是用于救治生命。因?yàn)槭荏w以免疫抑制的危險(xiǎn)交換了胰島素注射的危險(xiǎn)，胰腺移植一般主要限制于已經(jīng)需要接受免疫抑制劑藥物的患者(即腎衰竭的、正接受腎臟移植的糖尿病患者)。
患有急性骨髓或淋巴母細(xì)胞白血病的患者可以受益于骨髓移植(BMT)。由于其在治療患有遺傳疾病(例如，地中海貧血癥、鐮狀細(xì)胞血癥、免疫缺陷癥、先天性代謝缺陷)的兒童具有潛力，兒科的BMT已經(jīng)擴(kuò)展。BMT的另一選擇是自體同源移植(當(dāng)完全免除已被誘導(dǎo)時(shí)，切除患者自己的骨髓，接著切除性治療具有破壞任何殘余腫瘤希望的患者，并用患者自己的骨髓進(jìn)行拯救)。由于使用自體移植，免疫抑制是不必要的，除了短期高劑量的化療用于腫瘤根除和骨髓切除；GVHD的移植后問題是最小的。
從HLA一致性供體中用于白血病患者移植的排斥率小于5％。對于多重輸血的患有再生障礙性貧血的患者，由于移植誘導(dǎo)期間增加的免疫抑制也已經(jīng)顯著地減少了排斥率。雖然如此，并發(fā)癥可能出現(xiàn)包括由骨髓移植的宿主引起的排斥、急性GVHD和感染。后期的并發(fā)癥包括慢性GVHD、延長的免疫缺陷和疾病復(fù)發(fā)。
用本發(fā)明的方法治療移植物抗宿主病(GVHD)比單獨(dú)給予TNF-α拮抗劑或者ECP更加有效。在同種異源骨髓移植(BMT)之后，慢性移植物抗宿主病(cGVHD)在30％至60％的患者中發(fā)生。ECP和抗TNFα治療在該疾病中都已顯示出肯定的作用，但兩者都是不完善的，抗TNFα已與一系列不利結(jié)果相關(guān)。
許多其它移植與本發(fā)明的治療結(jié)合可以更加有效。例子包括角膜移植、皮膚同種異體移植、軟骨同種異體移植、骨移植和小腸移植。
用本發(fā)明的方法能更加有效地治療其它病癥的宿主。例如，皮膚的T-細(xì)胞淋巴瘤是一種T-淋巴細(xì)胞變得惡化且影響皮膚的疾病。通常使用三種治療輻射、化療和光除去法。皮膚T-細(xì)胞淋巴瘤的治療依據(jù)疾病的發(fā)展階段和患者的年齡和整體健康狀況。由于過去研究中其在患者中的效力可以考慮標(biāo)準(zhǔn)治療，或者可以考慮臨床試驗(yàn)的參與。許多患有皮膚T細(xì)胞淋巴瘤的患者用標(biāo)準(zhǔn)治療沒有治愈，且一些標(biāo)準(zhǔn)治療可能具有比期望的更多的副反應(yīng)。用本發(fā)明的方法治療同樣可以用于治療該疾病。
本發(fā)明的方法也可以用于移植手術(shù)，例如，移植手術(shù)通常實(shí)施于美容或者非美容的整型手術(shù)。這樣的移植可以包括牙齒，脂肪移植例如到臉頰、嘴唇和屁股，面部移植包括移植到鼻子、臉頰、前額、下巴和腦殼，屁股移植，胸部移植等。其它移植包括，但不限于角膜環(huán)、皮層、眼眶、耳蝸、肌肉(所有肌肉，包括胸肌、臀肌、腹肌、腓腸肌、比目魚肌、二頭肌、三頭肌)、異源的關(guān)節(jié)和骨替代物、骨修復(fù)移植(螺旋狀、桿狀、珠狀、條狀、彈簧狀)、金屬板、脊髓、脊椎、頭發(fā)、botox/膠原/restylane/perlane注射、陰莖移植、前列腺結(jié)實(shí)移植、乳房移植(美容和重建)、子宮間裝置、荷爾蒙移植、胚胎或干細(xì)胞移植、起搏器、除纖顫器、人造動脈/靜脈/閥和人造器官。
用本發(fā)明的方法也可以更加有效地治療自身免疫疾病。這些是免疫系統(tǒng)對于內(nèi)生性抗原產(chǎn)生自身抗體的疾病，結(jié)果傷害了組織。用幾種方法可以識別個(gè)體患有疾病，包括但不限于HLA連鎖定型、基于血液或血清的試驗(yàn)，或者基因突變的識別，例如，單核苷酸多態(tài)性(SNPs)。例如，一旦個(gè)體被測定具有HLA DR4連鎖，且已被診斷為具有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，可以采取ECP和TNF-α拮抗劑的組合治療。最優(yōu)選地，TNF-α拮抗劑是REMICADE、HUMIRA或者ENBRELTNF-α拮抗劑。其它HLA等位基因，也被認(rèn)為是MHC等位基因，其與自身免疫疾病相關(guān)包括B27(連結(jié)脊椎炎)；DQA1*0501和DQB1*0201(腹腔疾病)；DRB1*03、DRB1*04、DQB1*0201、DQB1*0302和DMA*0101(I型糖尿病)；和Cw6(牛皮癬)。這些等位基因也可以用于測定個(gè)體是否正在經(jīng)受自身免疫疾病，從而是否可以使用ECP和TNF-α拮抗劑的組合治療。
基于血液或血清的試驗(yàn)可以用于評定疾病的誘因。例如，有一種試驗(yàn)檢測血清中自身核抗體的存在，其可能導(dǎo)致狼瘡的發(fā)作。也存在用于預(yù)測自身免疫心肌炎的基于血清的試驗(yàn)。另外，基于血清的試驗(yàn)可以用于測定胰島素水平(糖尿病)或其它疾病的肝臟或心臟的酶。T-3水平可以預(yù)測Hashimotos甲狀腺炎。在個(gè)體用基于血液或血清的試驗(yàn)被測定為患有一種疾病之后，本發(fā)明的方法可以用于防止或延遲這些疾病的發(fā)作或減少其影響。通過識別遺傳變異包括但不限于SNP，可以識別個(gè)體易患疾病。因此，本發(fā)明的進(jìn)一步方面，首先進(jìn)行測定患者患有自身免疫病癥或者易患某種疾病，然后對患者采取ECP(或其它程序性死亡細(xì)胞的給予)和TNF-α拮抗劑的組合治療。
本發(fā)明的方法也可以用于治療特應(yīng)性疾病，其是一種過敏性疾病，個(gè)體對于外在過敏原很敏感。特應(yīng)性疾病包括，但不限于過敏性皮炎、過敏性支氣管哮喘、風(fēng)疹、過敏性鼻炎、過敏性腸胃炎及其類似的。
標(biāo)準(zhǔn)診斷測試可以用于測定患者是否患有上面描述類型的病癥。
實(shí)施例如下非限制性的實(shí)施例進(jìn)一步描述了本發(fā)明。
在實(shí)施例1-5中，獲得如下單核細(xì)胞衍生的樹狀細(xì)胞通過Ficoll-Hypaque梯度離心分餾從健康供體的外周血細(xì)胞中分離PBMC。用MACS CD14分離試劑盒和Automacs系統(tǒng)(Miltenyi Biotec，德國)正向篩選單核細(xì)胞。在補(bǔ)充了40ng/ml IL-4和GM-CSF(R&D系統(tǒng))的完全培養(yǎng)基RPMI中培養(yǎng)CD14+單核細(xì)胞5天。用脂多糖(“LPS”，Sigma)刺激樹狀細(xì)胞來誘導(dǎo)細(xì)胞因子分泌。標(biāo)準(zhǔn)的ELISA方法用于測定培養(yǎng)物上清液中TNFα和IL-12(R&D系統(tǒng))的水平。
實(shí)施例1(TNFα生產(chǎn)抑制的體外研究)將剛分離的CD14+細(xì)胞和單核細(xì)胞衍生的樹狀細(xì)胞(5×105細(xì)胞/孔)在具有ECP處理的CD15+細(xì)胞(2.5×106細(xì)胞/孔)的24孔組織培養(yǎng)板中共培養(yǎng)。2小時(shí)后，將0.5mg/ml LPS加入到這些培養(yǎng)物中。刺激24小時(shí)后，從這些培養(yǎng)物中收集上清液用于細(xì)胞因子測定。從LPS活化的抗原呈遞細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)ECP處理過的細(xì)胞抑制TNFα產(chǎn)生。
實(shí)施例2(TNFα生產(chǎn)抑制的體外研究)將單核細(xì)胞衍生的樹狀細(xì)胞(1×105細(xì)胞/孔)在提供增量的LPS中單獨(dú)或者和ECP-處理的CD15+細(xì)胞(5×105細(xì)胞/孔)、和單獨(dú)的200ng/ml RemicademAb、或者和mAb與ECP處理的CD15+細(xì)胞的組合物一起培養(yǎng)。48小時(shí)后從這些培養(yǎng)物中收獲培養(yǎng)物上清液用于TNFα產(chǎn)生的測定。發(fā)現(xiàn)用Remicade mAb單獨(dú)處理的細(xì)胞具有約100pg/ml TNFα。發(fā)現(xiàn)那些用ECP單獨(dú)處理的細(xì)胞具有約1000pg/ml。這些處理的每一個(gè)表示相對于超過1000pg/ml的基線值的降低，當(dāng)使用本發(fā)明的方法時(shí)，該水平降至少于50pg/ml的平均值。
實(shí)施例3(TNFα生產(chǎn)抑制的體外研究)將單核細(xì)胞衍生的樹狀細(xì)胞(1×105細(xì)胞/孔)在提供0.1mg/ml LPS中單獨(dú)或者和ECP處理的新鮮CD15+細(xì)胞(5×105細(xì)胞/孔)、和單獨(dú)的200ng/mlRemicade Mab、或者和mAb與ECP處理的CD15+細(xì)胞的組合物一起培養(yǎng)。48小時(shí)后從這些培養(yǎng)物中收獲培養(yǎng)物上清液用于TNFα生產(chǎn)的定量。發(fā)現(xiàn)用Remicade mAb單獨(dú)處理的細(xì)胞具有約500pg/ml TNFα。發(fā)現(xiàn)那些用ECP單獨(dú)處理的細(xì)胞具有約1700pg/ml。這些處理的每一個(gè)表示相對于超過2300pg/ml的基線值的降低，當(dāng)使用本發(fā)明的方法時(shí)，該水平降至約100pg/ml的平均值。
實(shí)施例4(TNFα生產(chǎn)抑制的體外研究)將單核細(xì)胞衍生的樹狀細(xì)胞(1×105細(xì)胞/孔)在提供增量的LPS中單獨(dú)或者和ECP-處理的CD15+細(xì)胞(5×105細(xì)胞/孔)、和單獨(dú)的200ng/ml RemicademAb、或者和Remicade mAb與ECP處理的CD15+細(xì)胞的組合物一起培養(yǎng)。48小時(shí)后從這些培養(yǎng)物中收獲培養(yǎng)上清液用于TNFα生產(chǎn)的測定。將另一組樹狀細(xì)胞進(jìn)行類似處理，48小時(shí)后從這些培養(yǎng)物中收獲培養(yǎng)物上清液用于TNFα生產(chǎn)的定量。發(fā)現(xiàn)用約2ng/ml Remicade mAb單獨(dú)處理的細(xì)胞具有將近1000pg/ml TNFα。當(dāng)給予該相同劑量的Remicade mAb時(shí)，ECP的誘導(dǎo)水平降至約1500pg/ml。當(dāng)單獨(dú)給予8ng/ml Remicade mAb時(shí)，該水平大于1300pg/ml；附加的ECP處理將其降至約100pg/ml。含或不含ECP組合物的40ng/ml和更多的Remicade mAb的劑量，將該水平降低至少于100pg/ml。在低水平給予Remicade mAb(例如，2ng/ml)時(shí)組合治療的作用是最顯著的。該劑量通常不認(rèn)為具有治療性，而在不利作用非正常預(yù)期的水平時(shí)證明功效。
實(shí)施例5(其它促炎細(xì)胞因子抑制的體外研究)將單核細(xì)胞衍生的樹狀細(xì)胞(1×105細(xì)胞/孔)在提供增量的Remicade mAb中單獨(dú)或者和ECP-處理的新鮮CD15+細(xì)胞(5×105細(xì)胞/孔)的組合物一起培養(yǎng)。然后用0.8ng/ml LPS刺激細(xì)胞。48小時(shí)后從這些培養(yǎng)物中收獲培養(yǎng)物上清液用于IL-12生產(chǎn)的測定。通過使用ECP，IL-12水平從約150pg/ml的基線值降低至約125pg/ml。ECP和2ng/ml Remicade mAb的組合物導(dǎo)致IL-12水平降低至約10pg/ml。當(dāng)與ECP組合使用200ng/ml Remicade mAb時(shí)，幾乎無法檢測到IL-12的水平。因此，ECP處理過的細(xì)胞和Remicade mAb的組合物顯著地減少樹狀細(xì)胞的IL-12生產(chǎn)。
實(shí)施例6(體內(nèi)應(yīng)用的小鼠模型)(預(yù)測的)小鼠雄性C3H/HeJ(C3H；H2k)、(B6xC3H)F1(H2bxk)、(B6xDBA/2)F1(H2bxd)、C57BL/6(B6；H2b)和CBA/JCr(CBA；H2k)小鼠可購自國家癌癥學(xué)會研究和發(fā)展中心(Frederick，MD)。B10.BR(H2k)小鼠可購自Jackson實(shí)驗(yàn)室(Bar Harbour，ME)。用于試驗(yàn)的小鼠可在6-10周齡之間，養(yǎng)在一個(gè)特定的無病菌的設(shè)備中的無菌的微小隔離籠中，接受高壓滅菌過的食物和水進(jìn)行飼養(yǎng)。
培養(yǎng)基磷酸緩沖鹽(PBS)補(bǔ)充了0.1％牛血清白蛋白(BSA；Sigma Chemical Co.，St Louis，MO)可用于供體骨髓和淋巴細(xì)胞的所有體外操作。在馬上注射之前，沖洗細(xì)胞并在僅有PBS中重懸浮。為維持細(xì)胞系和體外試驗(yàn)，將使用補(bǔ)充了10％胎牛血清(FBS；GIBCO，Grand Island，NY)、2mmol/L L-谷氨酸鹽、50IU/mL青霉素和50μg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基(Mediatech，Herndon，VA)。
抗體cV1q(aka.CNTO 2213)mAb，一種用對鼠TNFα特異性的大鼠(Fab)2單位構(gòu)建的大鼠/小鼠Fc嵌合IgG2a，和其同型對照M-T412，一種人抗-CD4mAb將由Centocor，Malvem，PA提供。含有mAb的腹水將產(chǎn)生自特異于Thy-1.2(J1j；ATTC TIB-184)、CD4(RL172)或CD8(3.168)蛋白質(zhì)的雜交瘤系，將用于細(xì)胞移植的準(zhǔn)備。親和純化的山羊抗小鼠IgG(Cappel，Cosa Mesa，CA)將用于B細(xì)胞缺失。豚鼠補(bǔ)體將購自Rockland Immunochemicals(Gilbertsville，PA)。抗CD3、抗CD4、抗CD8、抗B220和同型對照mAb，所有連接于藻紅蛋白(PE)，將全部購自BD Biosciences(Palo Alto，CA)。
試驗(yàn)性光除去法脾細(xì)胞收獲自同源同窩出生的健康小鼠，并通過在PBS中用注射器的背面研磨制成單細(xì)胞懸液。這些細(xì)胞將重新懸浮，且在12.5×106細(xì)胞/mL PBS中重懸浮之前，用PBS清洗細(xì)胞兩次。清洗細(xì)胞后將其在冰冷培養(yǎng)基中重懸浮，并以約106細(xì)胞/ml接種在T75燒瓶中。添加補(bǔ)骨脂素(UVADEX溶液)至終濃度為200ng/ml，其是將Therakos提供的母液稀釋了100倍。將燒瓶平躺放置在UVA輻射室中并給予約1.5J/cm2的光，其相應(yīng)于當(dāng)盤離光源6cm時(shí)1.5分鐘的底光。快速地將細(xì)胞從燒瓶中除去以避免粘附并置于合適的濃度用于注射。如果存在粘附，則將燒瓶輕輕地刮擦或輕拍以除去大多數(shù)細(xì)胞。
骨髓移植骨髓收獲自供體小鼠的脛骨和股骨，用含有0.01％BSA的PBS(PBS/BSA)沖洗。于37℃使用以1∶100稀釋的抗-Thy 1.2mAb(J1j；美國典型培養(yǎng)收集，Rockville，MD)和以1∶6稀釋的豚鼠補(bǔ)體(Rockland Immunochemicals，Gilbertsville，PA)45分鐘，將減少骨髓細(xì)胞的T細(xì)胞。淋巴細(xì)胞分離自供體小鼠的脾臟和淋巴結(jié)。用含有0.7％氯化銨(NH4Cl)的Gey’s平衡鹽細(xì)胞溶解液處理脾細(xì)胞以除去紅細(xì)胞(RBCs)。除去RBC后，通過平鋪在塑料有蓋培養(yǎng)皿上，將脾臟和淋巴結(jié)細(xì)胞合并且除去B細(xì)胞，并在4℃用5mg/ml稀釋的山羊抗小鼠IgG預(yù)涂1小時(shí)。預(yù)計(jì)這些處理導(dǎo)致約90％-95％的CD3+細(xì)胞的供體細(xì)胞群，用熒光流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器定量。然后通過使用抗CD8(3.168)或抗CD4mAb(RL172)和補(bǔ)體進(jìn)行負(fù)向選擇分離T細(xì)胞亞型。預(yù)計(jì)這些處理將降低目標(biāo)T細(xì)胞亞型群至背景水平，用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析測定。將受體小鼠暴露于來自137CS源的以1.43Gy/min進(jìn)行13Gy整體輻射，以每次6.5Gy的分開劑量傳送，分離3小時(shí)。然后將這些小鼠用2×106抗Thy 1.2處理過的骨髓細(xì)胞(ATBMT細(xì)胞除去的)與指定數(shù)量的合適T細(xì)胞(供體CD4或CD8富集的T細(xì)胞)一起經(jīng)尾部靜脈進(jìn)行靜脈內(nèi)(i.v.)移植。在移植前用cV1q抗TNF-α或同型對照M-T412mAb(1mg；i.p.)處理小鼠1天，且在第0、4、8和12天再次處理(所有以0.5mg；i.p.)。對于GVL試驗(yàn)，在供體ATBM和T細(xì)胞移植之前1天，用注射MMB3.19細(xì)胞(0.5mLPBS中1×105個(gè)；i.p.)激發(fā)B6受體小鼠，用相似進(jìn)程表進(jìn)行抗TNFαmAb處理。在GVHD和GVL試驗(yàn)中，每天檢查小鼠的發(fā)病率和死亡率直到試驗(yàn)完成。從2-3個(gè)分離的試驗(yàn)中合并數(shù)據(jù)，通過所有天數(shù)的死亡數(shù)據(jù)點(diǎn)包括零點(diǎn)，測定半數(shù)存活時(shí)間(MST)作為插入的線性回歸的50％存活點(diǎn)。通過非參數(shù)性Wilcoxon空白測試，在試驗(yàn)組之間進(jìn)行存活的統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。通過T測試在個(gè)體時(shí)間點(diǎn)上測定重量比較的顯著性。
流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器在4℃下將容量為25μL的合適mAbs與96孔U-底微平板孔中的2-5×105個(gè)細(xì)胞一起孵育30分鐘，以1500rpm離心3分鐘，用含有0.1％BSA和0.01％疊氮化鈉的PBS(清洗緩沖液)清洗。計(jì)算每一樣品的陽性細(xì)胞的百分率和熒光亮度的算數(shù)平均值。
病理分析全濃度的耳朵活組織檢查(3×2mm)取樣自各種處理組別的每只小鼠，并立即用4％戊二醛固定過夜，然后用0.1M二甲砷酸鈉緩沖液(pH7.4)沖洗。將組織用2％鋨酸后固定2小時(shí)，用梯度乙醇脫水并用Epon 812包埋。用Porter-Blum MT2B超薄切片機(jī)切成1微米厚的切片，用甲苯胺藍(lán)染色，最后在95％乙醇中浸泡用于光學(xué)顯微鏡分析。如先前測定的角化不良表皮細(xì)胞/長度mm的數(shù)量，將在×100物鏡和×10目鏡的光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)。在每一動物中和每一時(shí)間點(diǎn)上評定大于10長度mm的表皮。對于治療組在黑暗條件下進(jìn)行分析。
在CD8 T細(xì)胞介導(dǎo)的GVHD中抗TNFαmAb的作用為了測定抗TNFαmAb治療是否能影響CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的GVHD的發(fā)展，將利用MHC匹配的、miHA-異種B10.BRaCBA GVHD模型，因?yàn)槠渚哂泻芎媒⒌牟≡瓕W(xué)。將CBA小鼠進(jìn)行致命性輻射(13Gy，分劑量)，并單獨(dú)或附加地用B10.BR ATBM細(xì)胞(2×106)移植，以高度富集CD8+T細(xì)胞(3×106)的群體(95％)。將小鼠或者不處理、或者在移植前一天(1mg，i.p.)和在第0、4、8和12天(0.5mg，i.p.)用同型匹配的對照MT412 mAb處理、或者進(jìn)行抗TNFαmAb(cV1q)mAb。然而所有單獨(dú)ATBM細(xì)胞的受體至少存活70天，用供體T細(xì)胞移植的和未處理的或者用對照MT412 mAb處理的小鼠將死于GVHD，其相似的MST值約為20天。相反，供體T細(xì)胞的CBA受體，但給予cV1q mAb，顯示出約40％存活，其MST約為50天，其明顯不同于MT412對照組。另外，存活的抗TNFαmAb處理的小鼠沒有顯示明顯的GVHD癥狀(例如，褶皺的皮毛、皮膚損傷、體態(tài)隆起或者腹瀉)，且它們的體重在一個(gè)相對恒定的水平，比對照的ATBM移植組體重低范圍5-12％。存在cV1q時(shí)發(fā)展成致命的GVHD的小鼠是這樣的，其比未處理的或MT412處理組具有更慢的動力學(xué)。當(dāng)以0.1mg i.p.給予cV1q時(shí)，GvHD發(fā)作沒有顯著的減少。
與BMT同一天及3天后，通過靜脈內(nèi)注射來自同窩出生的對照小鼠的107同源脾細(xì)胞而給予試驗(yàn)性ECP。供體T細(xì)胞的CBA受體，但給予ECP處理的細(xì)胞，顯示出約20％存活，其MST約為30天，這明顯不同于對照組。另外，存活的ECP處理的小鼠顯示出GVHD癥狀(例如，褶皺的皮毛、皮膚損傷、體態(tài)隆起或者腹瀉)的減少跡象，且它們的體重在一個(gè)相對恒定的水平，比對照的ATBM移植組體重低范圍5-20％。存在ECP處理的細(xì)胞時(shí)發(fā)展成致命的GVHD的小鼠是這樣的，其比未處理組具有更慢的動力學(xué)。
ECP治療和較有效劑量的抗TNFα治療結(jié)合會優(yōu)于任何一種單獨(dú)治療。供體T細(xì)胞的CBA受體，但以0.1mg與ECP一起給予cV1q mAb，顯示出約60％存活，其MST約為70天，這明顯不同于對照組。另外，存活的雙重處理的小鼠沒有顯示出明顯的GVHD癥狀(例如，褶皺的皮毛、皮膚損傷、體態(tài)隆起或者腹瀉)，且它們的體重在一個(gè)相對恒定的水平，比對照的ATBM移植組體重低范圍5-12％。存在雙重治療時(shí)發(fā)展成致命的GVHD的小鼠是這樣的，其比未處理組具有更慢的動力學(xué)且比單獨(dú)ECP或者抗TNF組更低。
交叉有MHC障礙的GVHD中抗TNFαmAb的作用利用單倍同一性的C3Ha(B6×C3H)F1小鼠模型測定由cV1q處理的TNFα的中和反應(yīng)是否能影響交叉有完全MHC障礙的GVHD的過程。將C3H T細(xì)胞(CD4+和CD8+；5×106)和ATBM細(xì)胞(2×106)靜脈內(nèi)移植到致命性輻射的(13Gy，分劑量)(B6×C3H)F1小鼠中，其誘導(dǎo)迅速的急性GVHD應(yīng)答，特征為嚴(yán)重的體重降低和早期死亡(MST約為5天)。用對照的MT412mAb處理的受體中獲得相似的結(jié)果，但是那些用cV1q處理的小鼠(前一天以1mgi.p.，在第0、4、8和12天以0.5mg)顯示出約40％的長期存活，其MST約為40天，其明顯不同于未處理的或者M(jìn)T412對照組。用0.1mg cV1q治療對于GvHD發(fā)作具有非顯著的但值得注意的作用。
與BMT同一天及3天后，通過靜脈內(nèi)注射來自同窩出生的對照小鼠的107個(gè)同源脾細(xì)胞而給予試驗(yàn)性ECP。供體T細(xì)胞的CBA受體，但給予ECP處理的細(xì)胞，顯示出約20％存活，其MST約為10天，這不同于但非顯著不同于對照組。另外，存活的ECP處理的小鼠顯示出GVHD癥狀(例如，褶皺的皮毛、皮膚損傷、體態(tài)隆起或者腹瀉)減少的跡象，且它們的體重在一個(gè)相對恒定的水平，比對照的ATBM移植組體重低范圍5-20％。存在ECP處理的細(xì)胞時(shí)發(fā)展成致命的GVHD的小鼠是這樣的，其比未處理組具有更慢的動力學(xué)。
ECP治療和較有效劑量的抗TNFα治療結(jié)合會優(yōu)于任何一種單獨(dú)治療。供體T細(xì)胞的CBA受體，但以0.1mg與ECP一起給予cV1q mAb，顯示出約60％存活，其MST約為70天，這顯著不同于對照組。另外，存活的雙重處理的小鼠沒有顯示出明顯的GVHD癥狀(例如，褶皺的皮毛、皮膚損傷、體態(tài)隆起或者腹瀉)，且它們的體重在一個(gè)相對恒定的水平，比對照的ATBM移植組體重低范圍5-12％。存在雙重治療時(shí)發(fā)展成致命的GVHD的小鼠是這樣的，其比未處理組具有更慢的動力學(xué)且比單獨(dú)ECP或者抗TNF組更低。
根據(jù)體重降低，由于輻射條件在開始的幾天內(nèi)最初輕微的下降之后，對照的ATBM小鼠在整個(gè)剩下的試驗(yàn)中會穩(wěn)定地獲得重量。另一方面，用供體的T細(xì)胞移植未處理的和MT412處理的組不會從最初的下降恢復(fù)，可能取而代之的是繼續(xù)迅速地降低體重直到它們死亡，這與嚴(yán)重的GVHD一致。然而，cV1q抗TNFαmAb-處理的小鼠到第9天會恢復(fù)一點(diǎn)，第37天后存活的動物在試驗(yàn)的剩余過程中會繼續(xù)獲得體重，追蹤低于ATBM組約6-12％。用0.1mg cv1q處理的動物會以僅僅稍微較好的動力學(xué)降低體重，雖然非顯著地不同于對照動物。ECP處理的動物會獲得顯著改善的體重，且抗TNF和ECP的組合實(shí)質(zhì)上與不給予BMT的對照動物或者1mg抗TNF組是同樣的。
CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的GVHD中抗TNFαmAb的作用當(dāng)移植完整的供體T細(xì)胞接種體時(shí)，在C3Ha(B6×C3H)F1模型中由于供體CD4+T細(xì)胞應(yīng)答趨向于支配GVHD的發(fā)展，且根據(jù)最初觀察到的抗TNFαmAb處理的適度作用，我們將注意力集中在CD4介導(dǎo)的GVHD組分。將3×106個(gè)C3H CD4+T細(xì)胞與2×106個(gè)ATBM細(xì)胞一起注射到輻射(13Gy，分劑量)過的(B6×C3H)F1小鼠中，會導(dǎo)致多數(shù)未處理的(約75％；MST為10-30天)和對照MT412處理的(約80％；MST為10-30天)小鼠死于嚴(yán)重的急性GVHD。相反，100％的用cV1q抗-TNFαmAb處理(前一天以1mg i.p.，在第0、4、8和12天以0.5mg)的小鼠存活超過60天。相應(yīng)于ATBM對照組，這些小鼠沒有顯示出任何顯著的GVHD癥狀，且輻射后從它們最初的體重降低迅速地恢復(fù)，繼續(xù)獲得體重直到試驗(yàn)結(jié)束。在CD4介導(dǎo)的GVHD中cV1q處理對于存活的高顯著作用，暗示了先前用整個(gè)供體T細(xì)胞接種體的轉(zhuǎn)移觀察到的更加適度的作用可能歸因于CD8介導(dǎo)的抗MHC類型I應(yīng)答的較少抑制。然而，這不能在該模型中直接測定，因?yàn)榧兓腃3H CD8+T細(xì)胞在不存在CD4+T細(xì)胞時(shí)，其自身不能介導(dǎo)致命的GVHD。
用0.1mg cV1q抗TNFα抗體治療在抑制GvHD上具有更加適度的作用。約40％的動物存活超過60天。存活的小鼠顯示出GvHD的最初跡象，但它們會衰弱且體重降低不會像1mg cV1q組中改善得那樣快，但明顯不同于對照的。
與BMT同一天及3天后，通過靜脈內(nèi)注射來自同窩出生的對照小鼠的107個(gè)同源脾細(xì)胞而給予試驗(yàn)性ECP。供體T細(xì)胞的F1受體，但給予ECP處理的細(xì)胞，顯示出約20％存活，其MST約為10-25天，這不同于但非明顯不同于對照組。另外，存活的ECP處理的小鼠顯示出GVHD癥狀(例如，褶皺的皮毛、皮膚損傷、體態(tài)隆起或者腹瀉)減少的跡象，且它們的體重在一個(gè)相對恒定的水平，比對照的ATBM移植組體重低范圍5-20％。存在ECP處理的細(xì)胞時(shí)發(fā)展成致命的GVHD的小鼠是這樣的，其比未處理組具有更慢的動力學(xué)。
ECP治療和較有效劑量的抗TNFα治療結(jié)合會優(yōu)于任何一種單獨(dú)治療。供體T細(xì)胞的CBA受體，但以0.1mg cV1q mAb與ECP一起給予，在第60天顯示出約90％存活，這明顯不同于對照組。另外，存活的雙重處理的小鼠沒有顯示出明顯的GVHD癥狀(例如，褶皺的皮毛、皮膚損傷、體態(tài)隆起或者腹瀉)，且它們的體重在一個(gè)相對恒定的水平，比對照的ATBM移植組體重低范圍5-12％。存在雙重治療時(shí)發(fā)展成致命的GVHD的小鼠是這樣的，其比未處理組具有更慢的動力學(xué)，且雖然不是統(tǒng)計(jì)上顯著，但比單獨(dú)ECP或者抗TNF組更低。
實(shí)施例7(對于協(xié)同增加和降低單獨(dú)抗TNFα治療毒性的人類應(yīng)用)(預(yù)測的)實(shí)施例概述該實(shí)施例將證實(shí)與ECP一起的抗-TNFα的強(qiáng)度控制比那些在文獻(xiàn)中建議的具有明顯更好的毒性圖譜。最初使用1mg/kg的英夫單抗抗TNFα。然而，有用劑量的范圍可以為從0.1mg/kg至10mg/kg的范圍。
患者根據(jù)位點(diǎn)和相一致的協(xié)議使用標(biāo)準(zhǔn)控制的規(guī)定，患者將接受同種異體的造血干細(xì)胞(HSC)移植，且不限于以下藥物治療；包括口服和靜脈內(nèi)給予皮質(zhì)類固醇、環(huán)孢菌素、他克莫司、西羅莫司、霉酚酸酯(MMF)。接受非重度骨髓抑制HSC移植的患者，將接受用百消安和氟達(dá)拉濱條件性的化療和全面的不同GVHD預(yù)防控制。供體-受體對的CMV血清狀況和半數(shù)追蹤時(shí)間要相似。在HSC之前用標(biāo)準(zhǔn)方法給予ECP，可能在HSC后以不同次數(shù)給予。在HSC后以0.5mg/kg的劑量給予英夫單抗。用標(biāo)準(zhǔn)方法如改良的Glucksberg尺度追蹤評價(jià)患者，且收集關(guān)于GVHD預(yù)防控制、發(fā)作數(shù)據(jù)和最大的全面和器官特異性級別的數(shù)據(jù)。
根據(jù)2002年歐洲癌癥研究和治療組織(EORTC)/國家過敏和感染疾病學(xué)會(NIAID)的國際性一致意見將IFIs進(jìn)行分類。通過查看一群鑒定過的所有患者的醫(yī)療記錄和所有的病理學(xué)、微生物學(xué)、感染控制和放射醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)庫，鑒定IFI的情況。醫(yī)生們在不知道英夫單抗輻射情況下記錄了他們的發(fā)現(xiàn)。不屬于假絲酵母種的僅僅被證實(shí)的或可能的IFI將被考慮分析。當(dāng)實(shí)施診斷方法用于證實(shí)的IFI的那一天，或者當(dāng)對于臨床醫(yī)生而言可獲得用于可能的IFI的放射醫(yī)學(xué)和微生物學(xué)數(shù)據(jù)的那一天，將記錄為IFI日期。如果在死亡后進(jìn)行IFI診斷，則IFI日期被認(rèn)為是死亡日期，但如果在尸體檢查時(shí)確定可能的IFI診斷，則IFI日期被記錄為當(dāng)進(jìn)行可能的IFI診斷的那一天。
用皮質(zhì)類固醇等價(jià)表，將患有嚴(yán)重GVHD的患者獲得的任何皮質(zhì)類固醇的所有劑量轉(zhuǎn)換成強(qiáng)的松等同物。計(jì)算調(diào)整體重的累積皮質(zhì)類固醇的劑量，從HSCT的那一天開始直到死亡、IFI的發(fā)展、同組追蹤末期，或者當(dāng)皮質(zhì)類固醇漸縮在20mg/d以下作用多于30天。記錄經(jīng)驗(yàn)的和預(yù)防性的抗真菌用途。
在那天或在那天之前最后一次觀察時(shí)檢查存活的患者。通過合適的控制/調(diào)節(jié)身體完成該研究。
統(tǒng)計(jì)分析2-邊Fisher精確檢驗(yàn)、Wilcoxon檢驗(yàn)或t檢驗(yàn)將用作合適的基線特征的比較。根據(jù)不同輻射種類，從HSCT組移植的那天起和從發(fā)展成嚴(yán)重GVHD的患者GVHD發(fā)作的那天起，計(jì)算IFI的影響速度和影響速度比率；在死亡或追蹤結(jié)束前最后一次觀察時(shí)檢查患者。用Haensze和Byar方法分別計(jì)算影響速度和影響速度比率的置信區(qū)間。計(jì)算Kaplan-Meier曲線用于從移植之日起的存活和到IFI的時(shí)間。在那些患嚴(yán)重GVHD的患者中，也計(jì)算從急性GVHD發(fā)作起到IFI的時(shí)間。用log-排列測試比較事件的次數(shù)。將進(jìn)行從GVHD發(fā)作起到IFI的時(shí)間的時(shí)間依賴性Cox衰退分析，以控制在患嚴(yán)重GVHD患者的變量中可能的混淆或相互作用。對于患嚴(yán)重GVHD患者中所有可能的危險(xiǎn)因素計(jì)算單變量的Cox模型。所有IFI單變量Cox分析中與小于0.2的P值共變的量將在多變量Cox模型中考慮。英夫單抗將被模擬成一個(gè)時(shí)間依賴性變量；一旦開始每周的輸注，則假定其輻射是恒定的。只有在最終模型中與IFI統(tǒng)計(jì)上顯著相關(guān)的(P＜0.05)候選變量才被保留除非顯著混淆是明顯的。用于Windows的8.01版本的SAS系統(tǒng)將用于以上分析。
結(jié)果對于急性GVHD的影響和治療在HSC之前第10天至HSC之前第4天給予ECP約2次。另外，在移植后的第一個(gè)100天中約每周給予ECP治療以進(jìn)一步防止急性GvHD的發(fā)展。初步分析證明在不患GVHD和患I至II級GVHD的患者中具有相似的存活和IFI比率；因此，將這些組一起合并到?jīng)]有或非嚴(yán)重的GVHD中。嚴(yán)重GVHD定義為III或IV級的全部。群體中約20％將發(fā)展成急性嚴(yán)重GVHD。當(dāng)與群體中其余的比較時(shí)，患嚴(yán)重GVHD的患者中無關(guān)的供體的比例會更高；另外，基線特征是相似的。在重度骨髓抑制和非重度骨髓抑制的HSC移植受體中，任何級別的GVHD或嚴(yán)重GVHD的比例是相似的。
診斷患有嚴(yán)重GVHD的患者可以接受多重藥物治療，其可以包括以最初劑量至少為2mg/kg/d的MMF和皮質(zhì)類固醇以漸縮應(yīng)答，和鈣神經(jīng)素抑制劑或西羅莫司的附加或增加劑量。
在最初的急性GVHD診斷后開始給予英夫單抗約10-50天?；颊咭悦恐芑騼芍?mg/kg的基準(zhǔn)接受2-15次劑量。當(dāng)與不接受英夫單抗的患者比較時(shí)，受體更可能具有GVHD的跡象和癥狀。
群體中的IFI在觀察期間，將診斷群體中不屬于假絲酵母種(曲霉病、接合菌病等)的證實(shí)的或可能的IFI。
患嚴(yán)重GVHD的患者中全面的IFI IR約為1例/1000 GVHD患者-天。在基線特征中，非重度骨髓抑制性HSCT與顯著增加的約為3例/1000 GVHD患者-天的IFI IR相關(guān)，然而已發(fā)展成嚴(yán)重GVHD的重度骨髓抑制性HSC移植受體具有小于1例/1000 GVHD患者-天的IFI IR。非重度骨髓抑制性HSCT協(xié)議的特征，如條件控制、接受外周血干細(xì)胞和用于GVHD預(yù)防的環(huán)孢菌素，也與稍微較高危險(xiǎn)的IFI相關(guān)。
通過使用10mg/kg英夫單抗，將患嚴(yán)重GVHD的患者中從GVHD發(fā)作開始到IFI的時(shí)間進(jìn)行分級。在英夫單抗受體中存在顯著更高的IFI概率。用ECP治療沒有顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)上IFI的顯著增加。
在患嚴(yán)重GVHD的患者中用于發(fā)展IFI的時(shí)間依賴性Cox衰退分析模型將被開發(fā)。對所有可能的IFI危險(xiǎn)因素計(jì)算單變量危險(xiǎn)比率(HRs)。只有具有小于0.20的未調(diào)整HR P值的特征才會在多變量模型中考慮。
分別不包括與描述的非重度骨髓抑制性HSCT共線的變量，且假設(shè)分析10IFIs時(shí)，在最終模型中保留具有最高HR和小于0.05的P值的2個(gè)共變量。假設(shè)將英夫單抗優(yōu)先給予患嚴(yán)重腸胃GVHD的患者，且在單變量Cox中發(fā)現(xiàn)腸胃器官特異性級別3或4與IFI顯著相關(guān)，則根據(jù)指示將該共變量保留在最終模型中以將混淆減至最低，即使存在其它共變量的模型中其變得不是顯著的。作為一種時(shí)間依賴性共變量的用英夫單抗調(diào)整的HR約為14；調(diào)整的非重度骨髓抑制性HSCT的HR約為8。在存在使用英夫單抗和移植類型作為共變量時(shí)，嚴(yán)重腸胃器官特異性級別3或4GVHD的調(diào)整的HR約為4。10mg/kg英夫單抗輻射的IFI危險(xiǎn)作用劃分的時(shí)間顯示出增加的危險(xiǎn)時(shí)間。使用1mg/kg或更少的英夫單抗不顯示HR顯著的增加。單獨(dú)ECP顯示出HR非顯著不同于那些僅用標(biāo)準(zhǔn)控制治療的患者。低劑量英夫單抗與ECP組合比單獨(dú)高劑量的英夫單抗具有顯著更低的HR。與增加的功效一起給予，該治療控制是一種更加有效的、安全的治療形式。
存活在追蹤結(jié)束時(shí)整個(gè)群體的半數(shù)存活約為250-400天。當(dāng)根據(jù)GVHD的嚴(yán)重性分級時(shí)，患嚴(yán)重GVHD患者的半數(shù)存活顯著低于不患或患非嚴(yán)重GVHD的患者。在患嚴(yán)重GVHD的患者中，10mg/kg英夫單抗受體的半數(shù)存活可以顯著低于非受體。ECP治療的患者比標(biāo)準(zhǔn)控制的患者或者接受單獨(dú)低劑量英夫單抗的患者具有更顯著的存活模式。更加降低英夫單抗的劑量至1mg/kg與標(biāo)準(zhǔn)ECP控制結(jié)合，將導(dǎo)致GvHD評價(jià)中顯著的改善，然而與更高水平英夫單抗相關(guān)的IFI將在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著地減少。
權(quán)利要求
1.一種治療自身免疫疾病或改善一種或多種其癥狀的方法，包括a)給予患者已經(jīng)受程序性細(xì)胞死亡誘導(dǎo)處理的細(xì)胞群；和b)給予個(gè)體有效量的TNF拮抗劑。
2.權(quán)利要求1的方法，其中細(xì)胞是自體白細(xì)胞。
3.權(quán)利要求1的方法，其中程序性細(xì)胞死亡誘導(dǎo)處理是ECP處理過程，其使用可光活化化合物與活化所述可光活化化合物的一定波長的光。
4.權(quán)利要求2的方法，其中可光活化化合物是補(bǔ)骨脂素，光是UVA。
5.權(quán)利要求4的方法，其中補(bǔ)骨脂素是8-MOP。
6.權(quán)利要求1的方法，其中TNF-α拮抗劑選自REMICADE、HUMIRA和ENBREL治療劑。
7.一種用于治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、甲狀腺炎、移植物抗宿主病、硬皮病、糖尿病、葛雷夫斯氏病；肉樣瘤病、慢性炎性腸病、潰瘍性結(jié)腸炎、彌漫性血管內(nèi)凝血、動脈粥樣硬化、和川崎病、多發(fā)性硬化和急性橫向脊髓炎；皮質(zhì)脊髓系統(tǒng)損傷；基底神經(jīng)節(jié)病癥或小腦障礙；亨廷頓舞蹈病和老年舞蹈??；藥物誘導(dǎo)的運(yùn)動障礙、帕金森氏癥；進(jìn)行性核上麻痹癥；小腦和脊髓小腦障礙、脊髓小腦變性(脊髓共濟(jì)失調(diào)、弗里德賴希氏共濟(jì)失調(diào)、小腦皮層惡化、多發(fā)性系統(tǒng)變性(Mencel、Dejerine-Thomas、Shi-Drager和Machado-Joseph)；和系統(tǒng)性病癥(Refsum’s疾病、β-脂蛋白缺血癥、共濟(jì)失調(diào)、毛細(xì)管擴(kuò)張和線粒體多系統(tǒng)病癥)；多發(fā)性硬化、急性橫向脊髓炎；神經(jīng)原性肌肉、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化、嬰兒脊髓肌肉萎縮和青少年脊髓肌肉萎縮；阿爾茨海默病；中年Down’s綜合病癥；彌漫性雷維小體疾??；雷維小體型老年癡呆；Wernicke-Korsakoff綜合病癥；慢性酒精中毒；Creutzfeldt-Jakob疾?。粊喖毙杂不X炎、Hallerrorden-Spatz疾??；和拳擊員癡呆pugilistica，白血??；霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，和酒精誘導(dǎo)的肝炎的方法，包含a)將細(xì)胞群給予需要其的個(gè)體，該細(xì)胞群獲自經(jīng)受了用UVA光和8-MOP的ECP處理過程的個(gè)體血液的一部分；和b)給予個(gè)體有效量的TNF-α拮抗劑。
8.權(quán)利要求7的方法，其中TNF-α拮抗劑是REMICADE、HUMIRA或ENBREL治療劑。
9.權(quán)利要求7的方法，其中TNF-α拮抗劑是REMICADE治療劑。
10.一種治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或改善其的一種或多種癥狀的方法，包括a)將細(xì)胞群給予需要其的個(gè)體，該細(xì)胞群獲自經(jīng)受了用UVA光和8-MOP的ECP處理過程的個(gè)體血液的一部分；和b)給予個(gè)體TNF-α拮抗劑，其選自REMICADE、HUMIRA和ENBREL。
11.權(quán)利要求10的方法，其中TNF-α拮抗劑是REMICADE。
12.一種治療特應(yīng)性疾病或改善其的一種或多種癥狀的方法，包括a)將細(xì)胞群給予需要其的個(gè)體，該細(xì)胞群獲自經(jīng)受了程序性細(xì)胞死亡誘導(dǎo)處理的個(gè)體血液的一部分；和b)給予個(gè)體有效量的TNFα拮抗劑。
13.一種方法包括a)在移植前，給予移植受體獲自移植受體血液一部分的細(xì)胞群，其中所述的細(xì)胞群經(jīng)受了程序性細(xì)胞死亡誘導(dǎo)處理；和b)給予所述的移植受體有效量的TNFα拮抗劑。
14.權(quán)利要求13的方法，其中步驟a)和b)根據(jù)選自以下的時(shí)間表實(shí)施在移植之前的一周進(jìn)行2天；在收獲所述移植之前的一周進(jìn)行3天；在移植之前進(jìn)行2周，每周進(jìn)行2天；和在移植之前進(jìn)行3周，每周進(jìn)行3天。
15.權(quán)利要求13的方法，其中可光活化化合物是補(bǔ)骨脂素，光是UVA。
16.一種方法包括a)在所述受體接受所述植入前，給予植入受體獲自植入受體血液一部分的細(xì)胞群，其中所述的細(xì)胞群經(jīng)受了程序性細(xì)胞死亡誘導(dǎo)處理；b)給予所述的植入受體有效量的TNFα拮抗劑；和c)在所述受體接受所述移植后，給予所述受體獲自所述受體血液一部分的細(xì)胞群，其中所述的細(xì)胞群經(jīng)受了程序性細(xì)胞死亡誘導(dǎo)處理。
17.權(quán)利要求15的方法，其中步驟a)和b)根據(jù)選自以下的時(shí)間表實(shí)施在所述接受者接受所述植入之前的一周進(jìn)行2天；在所述接受者接受所述植入之前的一周進(jìn)行3天；在所述接受者接受所述植入之前進(jìn)行2周，每周進(jìn)行2天；和在所述接受者接受所述植入之前一周3天進(jìn)行3周；和步驟c)根據(jù)選自以下組成的時(shí)間表實(shí)施每周一次、每月一次、每月兩次、每月三次、每隔一月一次、每三個(gè)月一次、每六個(gè)月一次和每年一次。
18.一種治療患有病癥或傾向于患有病癥的患者的方法，包括測試患者以測定該患者是否患有病癥，如果該患者患有病癥或傾向于患有病癥，則給予TNFα拮抗劑和ECP。
全文摘要
治療自身免疫疾病、特應(yīng)性疾病、移植排斥或GVHD或者改善其的一種或多種癥狀的方法，包括使用組合治療。該治療包括給予個(gè)體體外光除去法和TNFα拮抗劑。
文檔編號A61P25/28GK1660427SQ20041007574
公開日2005年8月31日 申請日期2004年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月23日
發(fā)明者D·佩里特, K·坎貝爾, J·吉爾斯-科馬, G·哈里曼 申請人:特拉科斯有限公司