專利名稱：一種防護和/或修復(fù)dna氧化損傷的組合物(rcud)及其方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種對于保護和/或修復(fù)DNA免于氧化損傷有用的組合物，所述組合物包含重蒸牛尿蒸餾物(RCUD)，其中RCUD含有苯甲酸和己酸成分，組合物中氨的含量范圍是5-15mg/L，并選擇性含有抗氧化劑；以及一種使用權(quán)利要求1中的組合物保護和/或修復(fù)DNA免于氧化損傷的方法，所述方法包括以下步驟估計樣品中折疊的DNA的量，在DNA暴露在DNA氧化損傷試劑之前或者之后，將所述組合物混合到所述DNA中，并確定混合物中表示折疊的DNA的百分比，其表示了對DNA氧化損傷的防護和/或修復(fù)。
背景技術(shù)：
在吠陀經(jīng)中，將牛產(chǎn)品與神酒進行了比較(梨俱吠陀10.15pp.47)。在印度草醫(yī)學(xué)中，牛尿是潘克戈亞(Panchagavya)的成分之一。根據(jù)沙許拉特(Susrut)，牛尿具有若干藥物特性(45/221，pp-61，72，220，221)。沙拉克(Charak)[斯洛卡(Solka)-100 pp.72]也描述了其性質(zhì)。牛尿被廣泛地應(yīng)用于印度草醫(yī)學(xué)中，用以純化否則會具有毒性的某些材料(pp.73)。然而，文獻和經(jīng)文中沒有提到尿或其蒸餾物作為保護細胞免受DNA損傷和染色體變異的保護者的作用。為了研究牛尿蒸餾物的性質(zhì)，申請人得到了KamdhenuArk，這是由Govigyan Anusandhan Kendra(GVAK)，Nagpur(印度)制備銷售的牛尿蒸餾物。這種尿蒸餾物被建議用于口服以增進大眾健康(general health)和控制體重增加、浮腫、胃痛、消化不良、皮膚病以及心臟問題等。KamdhenuArk的生產(chǎn)過程表明，牛尿應(yīng)該是新鮮并且不含氨。在NEERI進行的試驗顯示，牛尿的貯藏會導(dǎo)致氨的形成，這可以從下面的表1中看出。
表1牛尿中氨的含量

申請人以前的工作是關(guān)于香煙煙霧產(chǎn)生的氧化損傷能夠被維生素C防止。作者證實，將亞臨床或者維生素C少量缺乏的豚鼠(guinea pig)暴露在香煙煙霧中會引起膜蛋白的氧化以及肺微粒體蛋白大量氧化降解。進一步，共軛二烯烴、丙二醛和熒光色素的形成表明，暴露于煙霧也可以誘導(dǎo)微粒體脂質(zhì)過氧化。然而，當(dāng)對豚鼠喂食維生素C時，則產(chǎn)生對蛋白質(zhì)的損傷和脂類過氧化的完全防護作用。同時，當(dāng)中止暴露在香煙煙霧并進行抗壞血酸治療后，煙誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)和脂類的損傷得到逆轉(zhuǎn)。如果推廣到人的話，這個結(jié)果提示相對大劑量的維生素C可以保護吸煙者免受香煙煙霧引起的氧化損傷以及相關(guān)聯(lián)的退化性疾病。(Panda，chattopadhyay和Chatterjee；free radicalbiology & medicine，Vol.29，No.2，pp.115-124，2000)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的是開發(fā)一種防止和矯正DNA損傷的天然組合物。
本發(fā)明的另一個主要目的是開發(fā)一種防止和矯正DNA損傷的方法。
本發(fā)明的另一個目的是開發(fā)一種制備RCUD的工藝。
主要目的是提供Kamdhenu Ark作為DNA損傷保護物的新應(yīng)用。
發(fā)明的另一個目的是提供去除Kamdhenu Ark中氨的方法，其目的是去除氨的毒性(如果有的話)并提高其防護DNA損傷的活性。
發(fā)明的另一個目的是鑒定重蒸Kamdhenu Ark作為DNA損傷保護劑的活性成分。
一種對于保護和/或修復(fù)DNA免于氧化損傷有用的組合物，所述組合物包含重蒸牛尿蒸餾物(RCUD)，其中RCUD含有苯甲酸和己酸成分，組合物中氨的含量范圍是5-15mg/L，并選擇性含有抗氧化劑；以及一種使用權(quán)利要求1中的組合物保護和/或修復(fù)DNA免于氧化損傷的方法，所述方法包括以下步驟確定樣品中折疊的DNA的量，在DNA暴露在氧化損傷DNA的試劑之前或者之后，將所述組合物混合到所述DNA中，并確定混合物中折疊的DNA的百分比，用以表示對DNA氧化損傷的防護和/或修復(fù)。


圖1表示的是在注射重蒸Kamdhenu-Ark后GCMS的探測器響應(yīng)。
本發(fā)明是尋找具有保護暴露在DNA損傷化學(xué)試劑的細胞免于DNA損傷的性質(zhì)的天然抗氧化劑的結(jié)果。在這方面的努力中，通過對按照古代經(jīng)文和文獻描述，給牛專門喂食含有特殊草藥，并對牛的尿進行蒸餾而制備了Kamdhenu Ark。這些牛是在GVAK，Deolapar(Nagpur區(qū))在GVAK，Nagpur的發(fā)明人的嚴(yán)格監(jiān)督下飼養(yǎng)的。在所得到的蒸餾物(大約400ml/批)中加入加入10-25ml(25％)正磷酸(分析純)進行重蒸餾，使蒸餾的Ark的pH值降低至2以下。將重蒸和改良的Ark用于所有以后進行的NEERI實驗。
具體實施例方式
一種對于保護和/或修復(fù)DNA免于氧化損傷有用的組合物，所述組合物包含重蒸牛尿蒸餾物(RCUD)，其中RCUD含有苯甲酸和己酸成分，組合物中氨的含量范圍是5-15mg/L，并選擇性含有抗氧化劑；以及一種使用權(quán)利要求1中的組合物保護和/或修復(fù)DNA免于氧化損傷的方法，所述方法包括以下步驟確定樣品中折疊的DNA的量，在DNA暴露在氧化損傷DNA的試劑之前或者之后，將所述組合物混合到所述DNA中，并確定混合物中折疊的DNA的百分比，用以表示對DNA氧化損傷的防護和/或修復(fù)。
本發(fā)明的一種實施方式中，其中一種對于保護和/或修復(fù)DNA免于氧化損傷有用的組合物，所述組合物包含重蒸牛尿蒸餾物(RCUD)，其中RCUD含有苯甲酸和己酸成分，組合物中氨的含量范圍是5-15mg/L，并選擇性含有抗氧化劑。
在本發(fā)明的另一種實施方式中，其中RCUD是無色的。
在本發(fā)明的又一種實施方式中，其中RCUD是水溶性的。
在本發(fā)明的再一種實施方式中，其中RCUD具有大約1.006的比重。
在本發(fā)明的又一種實施方式中，其中RCUD具有3.0-5.0范圍內(nèi)的pH值。
在本發(fā)明的另一種實施方式中，其中RCUD氨氮(NH3N)的含量在5-15mg/L的范圍內(nèi)。
在本發(fā)明的另一種實施方式中，其中RCUD所含揮發(fā)性脂肪酸的含量在1000-3000mg/L的范圍內(nèi)。
在本發(fā)明的另一種實施方式中，其中抗氧化劑從包含揮發(fā)性酸、喹啉和烴衍生物的組中選擇。
在本發(fā)明的另一種實施方式中，其中揮發(fā)性脂肪酸是乙酸、丙酸和丁酸的衍生物。
在本發(fā)明的另一種實施方式中，其中揮發(fā)性脂肪酸的衍生物是乙酸-2-丙烯酯；乙酸巰基甲酯；2-丁烯二腈；富馬腈(Fumanonitrile)；2，2，3-三氯丙酸、3-氯丙酸、3-甲基-2-戊烯酸；異戊酸；3-羥基丁酸乙醚；4-甲基-2-三甲基苯甲酸；(鄰-三乙基硅烷氧基)苯基三乙基甲硅烷基乙酸；3-苯基丙酸(肉桂酸)；巰基乙酸；1-氫吲哚-3-ol-醋酸酯；乙酸苯酯；3-甲基喹啉。
在本發(fā)明的另一種實施方式中，其中喹啉從包含3-甲硫基喹啉和3-甲基喹啉的組中選擇。
在本發(fā)明的另一種實施方式中，其中組合物聞起來像尿。
在本發(fā)明的另一種實施方式中，其中組合物被用作藥物組合物。
在本發(fā)明的另一種實施方式中，其中組合物用于分析遺傳材料。
在本發(fā)明的另一種實施方式中，其中一種使用權(quán)利要求1中的組合物保護和/或修復(fù)DNA免于氧化損傷的方法，所述方法包括以下步驟·估計樣品中折疊的DNA的量，·在DNA暴露在氧化損傷DNA的試劑之前或者之后，將所述組合物混合到所述DNA中，以及·確定混合物中折疊的DNA的百分比，其表示對DNA氧化損傷的防護和/或修復(fù)。
在本發(fā)明的另一種實施方式中，其中DNA被從包含放線菌素D、二氧化錳(MnO2)和過氧化氫(H2O2)的組中選擇的化合物所損傷。
在本發(fā)明的另一種實施方式中，其中所述組合物大約增強150-250倍抗基因毒性效果。
在本發(fā)明的另一種實施方式中，其中一種去除牛尿蒸餾物中的氨以得到重蒸牛尿蒸餾物(RCUD)的方法，所述方法包括下列步驟使用濃度為82％-88％的正磷酸對牛尿蒸餾物進行重蒸，并得到重蒸牛尿蒸餾物(RCUD)。
在本發(fā)明的另一種實施方式中，其中一種如權(quán)利要求15中所述的方法，其使用正磷酸處理將蒸餾物的pH值降低至2以下。
在本發(fā)明的另一種實施方式中，其中一種權(quán)利要求15所述的方法，其中在大約100℃的溫度下對蒸餾物進行重蒸。
在本發(fā)明的另一種實施方式中，其中權(quán)利要求15所述的方法，其中重蒸可以幫助去除牛尿的毒性。
在本發(fā)明的另一種實施方式中，其中權(quán)利要求15所述的方法，其中所述方法使蒸餾物的氨水平從1000-1500mg/L濃度范圍降低到5-15mg/L范圍。
公開了一種包含抗氧化劑的含有牛尿蒸餾物的藥物組合物，其中該牛尿蒸餾物的含量可有效防護DNA損傷。抗氧化劑可以是揮發(fā)性脂肪酸。
本發(fā)明涉及低氨含量的重蒸的牛尿蒸餾物在DNA損傷保護中的新應(yīng)用。DNA是危險化學(xué)品和廢物最主要的細胞靶位之一，其可以在暴露之后因堿基改變和糖磷脂骨架斷裂而被損傷。
如果細胞內(nèi)發(fā)生DNA損傷，與基因組完整性和DNA損傷修復(fù)機制相關(guān)的基因會被誘導(dǎo)，其結(jié)果是，將細胞周期阻止在G1期。接著，損傷的DNA被修復(fù)，進而被阻止的細胞周期也得到恢復(fù)，細胞進入S期(DNA合成期)。然而，如果損傷不能夠被修復(fù)的話，在正常情況下執(zhí)行修復(fù)任務(wù)的同樣基因會誘導(dǎo)細胞發(fā)生凋亡(程序式細胞死亡)，從而維持系統(tǒng)不含有缺陷的細胞。本發(fā)明直接參與幫助由損傷DNA的化學(xué)試劑例如過氧化氫(H2O2)、放線菌素D和二氧化錳(MnO2)引起的損傷修復(fù)。
氨來源于牛尿中的尿，是由存在于大量微生物內(nèi)的脲酶的酶水解作用產(chǎn)生的。盡管氨對人的健康是有毒的，但在Kamdhenu Ark中的劑量并未對人的健康或者健康人帶來負面作用。然而，在人使用之前，將其從Ark中去除掉至少對于敏感人群是理想的。因此，對從GVAK，Nagpur獲得的Kamdhenu Ark使用正磷酸處理后進行再次蒸餾。重蒸餾的過程需要將10-25ml(85％)正磷酸(分析純)加入到400ml K-Ark中以使其pH值降低至2以下，這可以將氨固定在殘留物中。重蒸餾是在大約100℃的溫度下進行的，并檢測了蒸餾物中的氨。據(jù)檢測，蒸餾物中氨的水平是5-15mg/L。去除氨的結(jié)果是，細胞毒性表現(xiàn)消失，而該毒性表現(xiàn)是可以在重蒸前含氨的K-Ark中觀察到的。使用氨水平在5到15mg/L之間變化的Kamdhenu-Ark(RCUD)進行以后的實驗。本發(fā)明是設(shè)計的實驗的結(jié)果，證明Kamdhenu-Ark具有作為保護暴露于DNA損傷化學(xué)試劑的細胞免于DNA損傷的保護者性質(zhì)。
牛尿作為Panchagavya的一個組分被認(rèn)為可以引起體重減少、消除某些心臟疾病、消化不良、胃痛和水腫。然而，其在防止DNA損傷方面的作用還沒有在任何文獻和經(jīng)文中被提到過。所以，申請人認(rèn)為確定重蒸Kamdhenu-Ark在體外保護暴露于DNA損傷化學(xué)試劑的細胞內(nèi)的DNA損傷的效率是值得的。申請人還用氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)對重蒸Kamdhenu-Ark進行了分析，并鑒定出可能作為抗氧化劑的成分，其與其他已知的保護DNA損傷的抗氧化劑作用方式相似。
發(fā)明涉及牛尿蒸餾物作為細胞DNA損傷化學(xué)試劑例如放線菌素、過氧化氫和二氧化錳的防護物的新應(yīng)用。在重蒸牛尿蒸餾物中鑒定的化合物擔(dān)當(dāng)抗實施例在下面的步驟中，證明了Kamdhenu Ark對放線菌素D、H2O2和MnO2所引起的DNA損傷的防護作用。在這方面的努力中，申請人測驗了放線菌素D、H2O2和MnO2對多形核白細胞的DNA損傷作用以及按上述方法得到的測試組分經(jīng)過改良的Kamdhenu Ark(重蒸牛尿蒸餾物)所產(chǎn)生的保護作用。這些實驗將在下面的實施例中介紹。
不論是預(yù)先用重蒸牛尿蒸餾物對多形核白細胞處理，還是在加入DNA損傷化學(xué)試劑時再用用重蒸牛尿蒸餾物對多形核白細胞處理，都觀察到對DNA損傷的防護作用。
事實上，重蒸牛尿蒸餾物對由于上述DNA損傷試劑所引起的DNA損傷也有統(tǒng)計學(xué)上顯著的減輕作用。
下面提供的實施例僅僅是本申請的發(fā)明的詳細描述，而不應(yīng)理解為對本實施例-I詳細闡述重蒸牛尿蒸餾物介導(dǎo)的對DNA損傷化學(xué)試劑放線菌素-D引起的多形核白細胞的DNA損傷的防護作用(表-2)。
表2放線菌素D所誘導(dǎo)的DNA損傷以及重蒸牛尿蒸餾物(改良的K-Ark)的保護作用各組的百分比

結(jié)果是5組實驗的平均值。*P值是與陰性對照(0.1％DMSO)比較計算得到的。測試的K-Ark劑量是60μl，NS＝不顯著。
已知的DNA損傷化學(xué)試劑放線菌素-D所引起的DNA損傷在統(tǒng)計上顯著的；P值＜0.001。
如果將體積為30μl的牛尿蒸餾物未經(jīng)過改良的Kamdhenu Ark與放線菌素D同時加入，與對照組比較盡管觀察到統(tǒng)計學(xué)顯著的DNA損傷，但還是有少許減輕作用的。另一方面，30μl和60μl的重蒸牛尿蒸餾物與放線菌素D同時加入時，對DNA損傷有減輕作用。所觀察到的異常可能是由于未改良的Kamdhenu Ark中含有氨。在暴露到放線菌素之前，用60μl的重蒸牛尿蒸餾物預(yù)處理多形核白細胞(PMNs)的結(jié)果是，沒有產(chǎn)生顯著的DNA損傷，這表明重蒸牛尿蒸餾物可以保護細胞免受DNA損傷。
在暴露到放線菌素-D之后，再用重蒸牛尿蒸餾物對PMNs進行后處理，也不會引起統(tǒng)計上顯著的DNA損傷。
實施例-2詳細闡述重蒸牛尿蒸餾物介導(dǎo)的對DNA損傷化學(xué)試劑過氧化氫(H2o2)引起的多形核白細胞的DNA損傷的保護作用(表-3)。
表3過氧化氫(H2O2)所引起的DNA損傷以及重蒸牛尿蒸餾物的保護作用各組的百分比

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結(jié)果是5組實驗的平均值。*P值是與陰性對照(0.1％DMSO)比較計算得到的。測試的K-Ark劑量是60μl，NS＝不顯著。已知的DNA損傷化學(xué)試劑過氧化氫(H2O2)所引起的DNA損傷是統(tǒng)計上顯著的；(P值＜0.001)。
用60μl的重蒸牛尿蒸餾物預(yù)處理多形核白細胞(PMNs)的結(jié)果是，暴露于H2O2的細胞沒有發(fā)生顯著的DNA損傷，并且牛的重蒸產(chǎn)物表現(xiàn)出重蒸牛尿蒸餾物可以保護細胞免受DNA損傷。
在PMNs暴露于過氧化氫10分鐘后，同時加入H2O2和重蒸牛尿蒸餾物，如此用重蒸牛尿蒸餾物進行后處理，得到了同樣的結(jié)果，也沒有產(chǎn)生統(tǒng)計上顯著的DNA損傷。
實施例-3詳細闡述重蒸牛尿蒸餾物介導(dǎo)的對DNA損傷化學(xué)試劑二氧化錳(MnO2)引起的多形核白細胞的DNA損傷的保護作用(表-4)。
表4二氧化錳(MnO2)所引起的DNA損傷以及重蒸牛尿蒸餾物的保護作用各組的百分比

結(jié)果是5組實驗的平均值。*P值是與陰性對照(0.1％DMSO)比較計算得到的。測試的K-Ark劑量是60μl，NS＝不顯著。已知的DNA損傷化學(xué)試劑二氧化錳所引起的DNA損傷是統(tǒng)計上顯著的；(P值＜0.001)。將多形核白細胞(PMNs)同時暴露到MnO2和60μl重蒸牛尿蒸餾物中，未觀察到統(tǒng)計上顯著的DNA損傷。
實施例-4詳細闡述重蒸牛尿蒸餾物(1μl濃縮物)介導(dǎo)的對DNA損傷化學(xué)試劑過氧化氫(H2O2)引起的多形核白細胞的DNA損傷的保護(表-5)
表5過氧化氫(H2O2)所引起的DNA損傷以及重蒸牛尿蒸餾物(1μl濃縮物)的保護作用各組的百分比

結(jié)果是5組實驗的平均值。*P值是與陰性對照(0.1％DMSO)比較計算得到的。測試的K-Ark劑量是60μl，NS＝不顯著。已知的DNA損傷化學(xué)試劑過氧化氫(H2O2)所引起的DNA損傷是統(tǒng)計上顯著的；(P值＜0.001)。
用1μl重蒸牛尿蒸餾物和H2O2同時處理多形核白細胞(PMNs)的結(jié)果是沒有觀察到統(tǒng)計上顯著的DNA損傷，這說明重蒸牛尿蒸餾物在1μl的水平能夠保護細胞免受DNA損傷。
實施例-5詳細闡述牛尿蒸餾物(1μl濃縮物)與重蒸牛尿蒸餾物(1μl濃縮物)對DNA損傷化學(xué)試劑過氧化氫(H2O2)引起的多形核白細胞的DNA鏈斷裂的保護作用的比較(表-6)。
表6牛尿蒸餾物(1μl濃縮物)與重蒸牛尿蒸餾物(1μl濃縮物)對過氧化氫(H2O2)所引起的DNA鏈斷裂保護作用的比較各組的百分比

結(jié)果是5組實驗的平均值。*P值是與陰性對照(0.1％DMSO)比較計算得到的。測試的K-Ark劑量是60μl，NS＝不顯著。已知的DNA損傷化學(xué)試劑過氧化氫(H2O2)所引起的DNA損傷是統(tǒng)計上顯著的；(P值＜0.001)。
用1μl牛尿蒸餾物和H2O2同時處理多形核白細胞(PMNs)表現(xiàn)出統(tǒng)計上顯著的DNA損傷。然而，重蒸牛尿蒸餾物可以保護細胞免受DNA損傷。
本發(fā)明是尋找具有保護暴露在DNA損傷化學(xué)試劑的細胞免于DNA損傷的性質(zhì)的天然抗氧化劑的結(jié)果。
在本發(fā)明的一種實施方式中，將重蒸牛尿蒸餾物作為針對DNA損傷化學(xué)試劑的陽性試劑進行試驗。
在一種實施方式中，發(fā)現(xiàn)重蒸牛尿蒸餾物含有抗氧化劑例如1)苯甲酸和己酸。在另一種實施方式中，重蒸牛尿蒸餾物用作放線菌素D所引起的DNA損傷的陽性試劑。
在一種實施方式中，發(fā)現(xiàn)重蒸牛尿蒸餾物含有抗氧化劑例如1)苯甲酸和己酸。在另一種實施方式中，重蒸牛尿蒸餾物用作針對H2O2所引起的DNA損傷的保護試劑。
在一種實施方式中，發(fā)現(xiàn)重蒸牛尿蒸餾物含有抗氧化劑。在另一種實施方式中，重蒸牛尿蒸餾物用作針對MnO2所引起的DNA損傷的陽性試劑。
在另一種實施方式中，重蒸牛尿蒸餾物作為針對DNA損傷化學(xué)試劑的保護試劑的效果是通過在PMN暴露到DNA損傷化學(xué)試劑之前的預(yù)處理、同時處理以及后處理進行研究的。
在另一種實施方式中，牛尿蒸餾物表現(xiàn)出具有損傷DNA的性質(zhì)，這可以通過重蒸將牛尿蒸餾物中的氨從1000-1500mg/L去除到5-15mg/L來減輕。
在另一種實施方式中，60μl重蒸牛尿蒸餾物(RCUD)可以為暴露到放線菌素D的PMN提供保護。
在另一種實施方式中，60μl重蒸牛尿蒸餾物(RCUD)可以為暴露到MnO2的PMN提供保護。
在另一種實施方式中，60μl重蒸牛尿蒸餾物(RCUD)可以為暴露到H2O2的PMN提供保護。
在另一種實施方式中，1μl重蒸牛尿蒸餾物(RCUD)可以為暴露到H2O2的PMN提供保護。
試劑的制備●溶液A ●平衡鹽溶液(BSS)
5mM葡萄糖●溶液B ●溶液C 9M-尿素 10mM-NaOH 2.5mM-EDTA 0.1％十二烷基硫酸鈉●溶液D 0.2N-NaOH●溶液E1M-葡萄糖100μl-巰基乙醇●溶液F 6.7μg/mL溴化乙啶●1μg/ml放線菌素D的0.1％DMSO(二甲基亞砜)溶液●H2O2 150μM●MnO2 250ppm或者250mg/L(貯存)DNA損傷以及RCUD對其保護的分析將15ml溶液A加入到5ml全血中，充分混合并在2-4℃下保持30分鐘。將混合物以800×g離心10分鐘。去掉上清，用平衡鹽溶液清洗沉淀，以800×g離心10分鐘后去掉清洗液。將此步進行兩次。用溶液B溶解包含外周多形核白細胞(PMN)的沉淀。
分別用10μl放線菌素D、10μl H2O2和2.5-20mg/Ml(終體積)的MnO2處理1ml含有大約1×106細胞的懸浮于溶液B中的PMN；還有一個試管中加入0.1％DMSO(陰性對照)作為對照。在每個試管中加入BBS溶液以補足2ml。將混合物在5％CO2、95％的濕度的恒溫箱中于37℃孵育1小時。孵育后，在每個試管中加入5ml冰冷的0.9％ NaCl，800g離心10分鐘，去掉上清。在每個試管的沉淀中加入1.5ml溶液B。將試管(對照和三個試驗組)充分混合并把混合物平均地分配到三個試管中，0.2ml/試管，標(biāo)記為B、P和T，接著加入200μl溶液C。充分混勻后，將三個試管B、P和T在冷的條件(0℃)下保持10分鐘以裂解細胞。
在試管T中加入400μl溶液E。之后在所有試管B、P和T中均加入200μl溶液D。將試管保持在0℃30分鐘。接著，對試管B中的物質(zhì)進行三次30秒的超聲降解處理。進一步，將B、P和T在20℃孵育1個小時。在試管B和P中，加入400μl溶液E并在0℃孵育10分鐘。在所有試管中，均加入1.5ml溶液F后在渦流混合器上進行勻漿處理，之后在520nm的激發(fā)光和590nm的發(fā)射光下進行15分鐘的熒光光譜分析。使用下面的公式確定殘余雙鏈DNA的百分比.[Krishnamurthi等(2003)和Birnboim、Jevcak(1981)]。
其中，P、B和T是590nm處的發(fā)射熒光。
將含有大約1×106細胞的懸浮在溶液B中的PMN置于四個試管A、B、C和D中。在試管B中加入60μl重蒸牛尿蒸餾物(RCUD)后，37℃孵育10分鐘。在試管C中加入DNA損傷化學(xué)試劑(放線菌素D或者H2O2或者MnO2)后，在37℃孵育10分鐘，之后加入60μl RCUD。在試管A中，只加入60μl RCUD，用BSS補足體積。將混合物在95％的濕度的5％CO2恒溫箱中37℃下孵育1個小時。其他步驟按照在C和D中描述的進行。
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2.Bimboim H.C和J.J.Jevcak(1981)用于快速檢測低計量輻射對人類白細胞造成的DNA鏈斷裂的熒光方法(Fluorometric Method for Rapid Detectionof DNA strand breaks in Human white blood cells produced by low Doses ofRadiation)Cancer Res.，411889-1892.
權(quán)利要求
1.一種對于防護和/或修復(fù)DNA氧化損傷有用的組合物，所述組合物包含重蒸牛尿蒸餾物RCUD，其中RCUD含有苯甲酸和己酸成分，組合物中氨的含量范圍是5-15mg/L，并選擇性含有抗氧化劑。
2.權(quán)利要求1所述的組合物，其中RCUD是無色的。
3.權(quán)利要求1所述的組合物，其中RCUD是水溶性的。
4.權(quán)利要求1所述的組合物，其中RCUD的比重大約為1.006。
5.權(quán)利要求1所述的組合物，其中RCUD的pH值在3.0-5.0的范圍內(nèi)。
6.權(quán)利要求1所述的組合物，其中RCUD氨氮(NH3N)的濃度在5-15mg/L的范圍內(nèi)。
7.權(quán)利要求1所述的組合物，其中RCUD中揮發(fā)性脂肪酸的含量在1000-3000mg/L的范圍內(nèi)。
8.權(quán)利要求1所述的組合物，其中抗氧化劑從包含揮發(fā)性酸、喹啉和烴衍生物的組中選擇。
9.權(quán)利要求1所述的組合物，其中揮發(fā)性脂肪酸是乙酸、丙酸和丁酸的衍生物。
10.權(quán)利要求9所述的組合物，其中揮發(fā)性脂肪酸的衍生物是乙酸-2-丙烯酯，乙酸巰基甲酯，2-丁烯二腈，富馬腈，2，2，3-三氯丙酸，3-氯丙酸，3-甲基-2-戊烯酸，異戊酸，3-羥基丁酸乙酯，4-甲基-2-三甲基苯甲酸，(鄰-三乙基硅烷氧基)苯基三乙基甲硅烷基乙酸，3-苯基丙酸(肉桂酸)，巰基乙酸，1-氫吲哚-3-ol-乙酸酯，乙酸苯酯，3-甲基喹啉。
11.權(quán)利要求9所述的組合物，其中喹啉從包含3-甲硫基喹啉和3-甲基喹啉的組中選擇。
12.權(quán)利要求1所述的組合物，其中組合物聞起來像尿。
13.權(quán)利要求1所述的組合物，其中組合物用作藥物組合物。
14.權(quán)利要求1所述的組合物，其中組合物用于分析遺傳材料。
15.一種使用權(quán)利要求1的組合物防護和/或修復(fù)DNA氧化損傷的方法，所述方法包括以下步驟確定樣品中折疊的DNA的量，在DNA暴露在氧化損傷DNA的試劑之前或者之后，將所述組合物混合到所述DNA中，以及確定混合物中折疊的DNA的百分比，其表示的是對DNA氧化損傷的防護和/或修復(fù)。
16.權(quán)利要求15所述的方法，其中DNA被從包含放線菌素D、二氧化錳MnO2和過氧化氫H2O2的組中選擇的化合物所損傷。
17.權(quán)利要求15所述的方法，其中所述組合物大約增強150-250倍的抗基因毒性效果。
18.一種去除牛尿蒸餾物中的氨以得到重蒸牛尿蒸餾物(RCUD)的方法，所述方法包括下列步驟使用濃度為82％-88％的正磷酸對牛尿蒸餾物進行重蒸餾，并得到重蒸牛尿蒸餾物RCUD。
19.權(quán)利要求18所述的方法，其中使用正磷酸處理將蒸餾物的pH值降低至2以下。
20.權(quán)利要求18所述的方法，其中在大約100℃的溫度下對蒸餾物進行重蒸餾。
21.權(quán)利要求18所述的方法，其中重蒸餾有助于去除牛尿的毒性。
22.權(quán)利要求18所述的方法，其中所述方法使蒸餾物中氨的濃度從1000-1500mg/L降低到5-15mg/L。
全文摘要
一種對于防護和/或修復(fù)DNA氧化損傷有用的組合物，所述組合物包含重蒸牛尿蒸餾物(RCUD)，其中RCUD含有苯甲酸和己酸成分，組合物中氨的含量范圍是5－15mg/L，并選擇性含有抗氧化劑；以及一種使用權(quán)利要求1中的組合物防護和/或修復(fù)DNA氧化損傷的方法，所述方法包括以下步驟確定樣品中折疊的DNA的量，在DNA暴露在氧化損傷DNA的試劑之前或者之后，將所述組合物混合到所述DNA中，并確定混合物中折疊的DNA的百分比，其表示對DNA氧化損傷的防護和/或修復(fù)。
文檔編號A61K45/06GK1771045SQ03826375
公開日2006年5月10日 申請日期2003年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月31日
發(fā)明者查卡巴提·他潘, 薩拉瓦納·德維·斯萬賽, 克里什那莫提·坎南, 都塔·迪潘威塔, 辛·里施·那瑞恩, 曼辛卡·蘇尼爾·巴克里施那, 道爾·蘇伊什·哈里鮑 申請人:印度科學(xué)工業(yè)研究所