專利名稱：板藍(lán)根提取物組合物及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中藥有效部位及成分的提取工藝領(lǐng)域，具體說，是板藍(lán)根的總生物堿提取物的提取和制備。本發(fā)明還涉及板藍(lán)根提取物的組合物。
背景技術(shù)：
板藍(lán)根是一種常用中藥材，是菘藍(lán)(Isatis indigotica)的根。它在中國有廣泛栽培，具有清熱解毒的功效(中華本草，pp.2346，3·709)。已有報(bào)道表明，它具有抗病毒(板藍(lán)根化學(xué)成分研究(I)，中草藥，2001年第32卷第12期，pp1057)，抗細(xì)菌內(nèi)毒素(Herald of Medicine，卷21，No.2，pp.74，2002)，抗癌，抗抑郁(中草藥，2001年第32卷第7期，pp.670-671)的功效。但是，這些方法是基于粗浸膏的注射液(中草藥，2001年第32卷第7期，pp.670-671)或氯仿提取物(中國中藥雜志，2002年6月，Vol.27，No.6，p.439-442)，尚未有用大孔樹脂精提取的生物堿部位的報(bào)道。
目前對板藍(lán)根的主要生產(chǎn)工藝是粗提取，以所得的浸膏量作為考察的依據(jù)。見例如中國藥典，2000，pp.490，其中主要是將板藍(lán)根煎煮，乙醇浸泡后取上清液，壓制得到常見的板藍(lán)根茶和顆粒，在該傳統(tǒng)工藝中并沒有對有效部位的分離。在1995年的中華人民共和國藥典中規(guī)定，以熱浸法測定，45％的乙醇浸出物不少于25％為合格產(chǎn)品。這樣獲得的產(chǎn)品有效部位含量低，質(zhì)量控制手段粗略。Huang Qiao Shu等，Planta Medica，1981，42(3)，308-310，描述了一種從中藥材板藍(lán)根提取純表告依春的方法，其方法主要是用己烷和二氯甲烷抽提，進(jìn)行硅膠層析并用TLC監(jiān)測。該方法僅適合實(shí)驗(yàn)室提取，其目的也是僅供研究使用，由于成本等原因不能用于大規(guī)模生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種制備板藍(lán)根提取物組合物的方法，其中通過乙醇回流提取，柱層析，乙醇洗脫，干燥獲得有效部位。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用上述方法獲得的板藍(lán)根提取物組合物。其中板藍(lán)根的總堿提取物含量為50-90％重量，表告依春在總組合物中的含量為10-30％重量。
本發(fā)明還提供了該組合物在制備解熱、消炎、鎮(zhèn)痛、促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖、抗病毒感染的藥物方面的用途。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種制備板藍(lán)根提取物組合物的方法，該方法包括步驟(a)用6-12倍板藍(lán)根重量的30-95％重量的乙醇水溶液回流提取，合并乙醇提取液；(b)過濾，回收乙醇，得到藥液；(c)將所得藥液過大孔樹脂吸附柱；(d)用洗滌液洗滌柱，至流出液為無色；(e)用30％-95％重量的乙醇水溶液洗脫，收集洗脫液；(f)干燥得到的洗脫液。
在本發(fā)明該方面的一個(gè)優(yōu)選例中，所述步驟(a)中的乙醇水溶液是藥材重量的8-12倍。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選例中，步驟(a)中的乙醇水溶液濃度優(yōu)選為50-80％重量，更優(yōu)選是75％重量。
在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選例中，步驟(a)優(yōu)選重復(fù)1-4次，更優(yōu)選1.5-3小時(shí)，最優(yōu)選2小時(shí)。
在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選例中，步驟(a)每次回流提取0.5-5小時(shí)，優(yōu)選回流提取1-4小時(shí)，更優(yōu)選1.5-3小時(shí)，最優(yōu)選2小時(shí)。
在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選例中，步驟(c)中大孔樹脂的用量優(yōu)選為藥材重量的1/3-4/3，最優(yōu)選2/3倍。
在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選例中，步驟(e)中的乙醇水溶液濃度優(yōu)選為65-80％重量，更優(yōu)選是75％重量。
在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選例中，所述步驟(e)中還包括用高效液相層析法在245nm波長下，流速1.0ml/分鐘，25℃下，用CH3OH∶H2O＝25∶75檢測表告依春的含量。
在本發(fā)明的該方面的另一個(gè)優(yōu)選例中，在所述步驟(f)中還包括先過濾所述洗脫液的步驟。
在本發(fā)明的該方面的另一個(gè)優(yōu)選例中，所述步驟(f)中的干燥是通過水浴蒸干，然后烘干進(jìn)行的。優(yōu)選溫度是60-100℃，更優(yōu)選為70-90℃，最優(yōu)選80℃。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種板藍(lán)根提取物組合物，該組合物是用(a)用6-12倍板藍(lán)根重量的30-95％重量的乙醇水溶液回流提取，合并乙醇提取液；(b)過濾，回收乙醇，得到藥液；(c)將所得藥液過大孔樹脂吸附柱；(d)用洗滌液洗滌柱，至流出液為無色；(e)用30％-95％重量的乙醇水溶液洗脫，收集洗脫液；(f)干燥得到的洗脫液的方法制備的，其中總堿提取物濃度為50％-90％重量，表告依春濃度為10％-30％重量，按總提取物重量計(jì)。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，還提供了上述組合物的用途，該組合物用于制備藥物，所述藥物選自解熱藥物、消炎藥、鎮(zhèn)痛藥、促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖的藥物、和抗病毒感染藥物。


圖1是板藍(lán)根提取物組合物對傷寒Vi多糖疫苗致家兔發(fā)熱模型的解毒作用(體溫變化值-小時(shí)圖)。
具體實(shí)施例方式
板藍(lán)根是常規(guī)的中藥材，可將其簡單切成飲片使用。該藥材可從各板藍(lán)根產(chǎn)地購得，例如安徽毫州藥材市場、蘇州天靈中藥飲片廠等?；蚩墒褂闷淦渌问?，例如洗凈切成條或粉碎成粗顆粒形式。
本發(fā)明的板藍(lán)根提取方法采用乙醇作為提取試劑，但與常規(guī)的乙醇粗浸取上清液不同，與其它的氯仿提取法也不同，而乙醇粗浸取上清液與本法在提取率，提取物中總生物堿及主要有效成分也有很大差異。
本發(fā)明中步驟(b)中的回收乙醇步驟，使得獲得的藥液濃縮，從而能吸附在大孔樹脂上有效分離所需的組分?；厥帐峭ㄟ^常規(guī)方法進(jìn)行的，例如蒸餾等。
本發(fā)明的柱層析使用各種常規(guī)的大孔樹脂吸附柱，可采用各種醫(yī)藥級(jí)大孔吸附樹脂，常用的樹脂選自D101，AB-8，LSA-10。優(yōu)選樹脂購自西安藍(lán)深LSA-10。在使用前可先用水平衡。上樣，洗滌，洗脫速度不受限制，但優(yōu)選在30-300ml/分鐘之間，最優(yōu)選是60ml/min。
本發(fā)明的洗滌液可使用極性溶劑，例如去離子水等對柱進(jìn)行洗滌。
該方面的另一個(gè)實(shí)施例中包括了檢測步驟，該檢測步驟是在步驟(e)洗脫過程中使用常規(guī)的HPLC(高效液相層析)，例如硅膠柱等，對洗脫液中的表告依春成分進(jìn)行檢測，檢測波長為245nm，流速為1.0ml/分鐘，25℃下，CH3OH∶H2O＝25∶75。如在該洗脫液中沒有表告依春峰出現(xiàn)則證明其洗脫完全。
本發(fā)明(f)中所使用的過濾裝置可以是各種常規(guī)過濾裝置。例如濾紙真空吸濾，多孔樹脂，分子篩，填充柱等。
本發(fā)明組合物中總堿提取物含量為50％-90％，是常規(guī)乙醇浸出法的20倍以上，提取效率達(dá)到60％以上，有效成分得率為0.3％以上，同時(shí)，由于操作步驟簡單，沒有TLC，電泳等昂貴步驟，可用于大批量工業(yè)生產(chǎn)。
本發(fā)明獲得的有效部位主要是總生物堿提取物，具有各種抗炎，抗菌，解熱，抗病毒作用。本發(fā)明獲得的主要部位毒性低，可以高劑量使用而無副作用。其可用各種常規(guī)方法方便的檢測濃度。這些常規(guī)方法包括非水滴定法，HPLC法等。
本發(fā)明獲得的主要部位可以制成成藥，例如添加甜味劑、調(diào)味劑、著色劑和防腐劑，制備口服給藥的片劑、錠劑、水或油懸液、可分散性粉末或顆粒、乳劑、硬或軟膠囊、或糖漿或酏劑。片劑含有與適用于制造片劑的無毒的可接受的賦形劑混合的活性成分。這些賦形劑可以是例如惰性稀釋劑，如碳酸鈣、碳酸鈉、乳糖、磷酸鈣或磷酸鈉；成粒劑及崩解劑，例如褐藻酸；粘合劑，如淀粉、明膠或阿拉伯膠；和潤滑劑，如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石。片劑可無糖衣或用已知技術(shù)包衣，來延遲在胃腸道內(nèi)的解體和吸收，從而在較長時(shí)間內(nèi)提供持續(xù)作用。例如，可施用延時(shí)物質(zhì)，如一硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯?？诜褂玫闹苿┻€可制成硬明膠膠囊，其中活性成分與惰性固態(tài)稀釋劑，如碳酸鈣、磷酸鈣或高嶺土混合，或制成軟明膠膠囊，其中活性成分和水或油性介質(zhì)，例如花生油、液態(tài)石蠟或橄欖油混合。
發(fā)明效果使用本發(fā)明的制備方法，可得到具有高濃度的總堿提取物和表告依春的板藍(lán)根提取物組合物，該方法可方便的用HPLC檢測其提取效率。本發(fā)明的組合物具有顯著的解熱、消炎、鎮(zhèn)痛、抗病毒作用，優(yōu)于一般的板藍(lán)根飲片等。
實(shí)施例實(shí)施例1主要部位的提取1.材料和儀器材料產(chǎn)自中國江蘇的板藍(lán)根20kg。
樹脂LSA-10，購自西安藍(lán)深儀器多功能提取罐(500L)，常州武進(jìn)孟河制藥機(jī)械廠2.提取方法將板藍(lán)根切成飲片，用8倍藥材量的50％的乙醇用提取罐回流提取，重復(fù)1次，每次0.5小時(shí)；合并乙醇提取液；用定性濾紙真空抽吸，75℃蒸餾回收乙醇；將剩余藥液加到LSA-10樹脂吸附柱上；用去離子水洗滌柱床(流速60ml/分)；直至肉眼檢測為無色；用50％重量的乙醇水溶液洗脫(流速60ml/分)，至用高效液相層析柱(C18Kromasil柱，中科院大道化學(xué)物理研究所)在245nm波長下，流速1.0ml/分鐘，25℃下，用CH3OH∶H2O＝25∶75檢測表告依春的含量，至不出現(xiàn)其峰；真空抽吸過濾；90℃水浴蒸干，60℃烘干。
每次制備重復(fù)3次，取平均值。
實(shí)施例2-4用實(shí)施例1的方法，如表1改變條件制備板藍(lán)根提取物，并用常規(guī)的酸堿滴定法測定其含量，每組進(jìn)行三次，取平均值。(用表告依春標(biāo)準(zhǔn)品濃度-峰面積作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)最終樣品中的表告依春峰面積計(jì)算出其濃度(重量％))表1反應(yīng)條件的選擇

從三次試驗(yàn)的結(jié)果可見，其中有效部位的得率均在60％以上，其中總?cè)芤褐斜砀嬉来汉烤?0％以上。
用實(shí)施例4含總堿提取物為65％重量的板藍(lán)根提取物粉末(命名為SY-1)，經(jīng)過下列試驗(yàn)證明了有效部位的藥效作用。
實(shí)施例5家兔發(fā)熱模型的解熱作用1實(shí)驗(yàn)材料1.1動(dòng)物新西蘭大耳白家兔，雄性。購自南京江寧青龍山動(dòng)物繁殖場，合格證號(hào)SCXK(蘇)2002-00271。
1.2器材DT-ITB型電子溫度計(jì)，上海醫(yī)用儀表廠，量制滬字0003591.
1.3藥品及試劑SY-1阿斯匹林(乙酸水楊酸腸溶片)，南京白敬宇制藥廠，批號(hào)20020701，傷寒Vi多糖疫苗，1ml/支，上海生物制品研究所，批號(hào)20010601032。
2.實(shí)驗(yàn)方法2.1傷寒菌苗致家免發(fā)熱模型選擇體重2kg左右、體溫范圍在38.5-39.6℃的新西蘭大耳白雄性家兔，21±2℃下恒溫適應(yīng)7天，并連續(xù)3天適應(yīng)性用體溫計(jì)測量兔直腸溫度。實(shí)驗(yàn)當(dāng)天間隔1小時(shí)測量兔體溫兩次，選取體溫波動(dòng)幅度在0.3℃以內(nèi)的家兔供實(shí)驗(yàn)用。
取兩次體溫的平均值作為基礎(chǔ)體溫，按基礎(chǔ)體溫分層隨機(jī)分成5組，每組5只，分別于-2及0小時(shí)分2次灌胃給予藥物，兩次的總劑量為阿斯匹林100mg/kg，SY-1低劑量(2.5mg/kg)，SY-1中劑量(7.5mg/kg)、SY-1高劑量(22.5mg/kg)，對照組給予等體積的水。在0小時(shí)給藥的同時(shí)，每兔均從耳緣靜注傷寒Vi多糖疫苗1.0ml/kg，在傷寒Vi多糖疫苗注射后0.5、1、2、3、4和5小時(shí)各測體溫1次；以不同時(shí)間所測的體溫與給藥前的基礎(chǔ)體溫之差作為體溫的變化值(δT，℃)，以δT(℃)為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)，作體溫變化曲線(圖1)。
3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表2 SV-1對傷寒Vi多糖疫苗致家兔發(fā)熱模型的解熱作用(n＝5)
基礎(chǔ)體溫 造模后不同時(shí)間體溫變化值(℃，X±SD)組別(℃，X±SD) 0.5 h 1h2h 3h 4h 5h模型組 39.14±0.18 0.56±0.211.12±0.27 0.98±0.19 0.72±0.18 0.46±0.23 0.34±0.11阿斯匹林39.12±0.18 0.34±0.200.58±0.16**0.42±0.16**0.38±0.14*0.28±0.21 0.20±0.18SY低劑量39.11±0.19 0.55±0.201.07±0.08 0.95±0.17 0.61±0.17 0.45±0.22 0.27±0.19SY中劑量39.16±0.22 0.50±0.110.82±0.35 0.62±0.25*0.46±0.19 0.36±0.15 0.30±0.15SY高劑量39.10±0.16 0.44±0.120.70±0.10*0.52±0.15**0.32±0.06**0.24±0.06 0.14±0.06進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理(t檢驗(yàn))，*P＜0.05，**P＜0.01，與對照組相比。
從表2可以看出，家兔在靜脈注射傷寒Vi多糖疫苗后，0.5小時(shí)體溫已開始上升，1小時(shí)迅速達(dá)到高峰，到2小時(shí)時(shí)繼續(xù)維持在較高水平，從3小時(shí)開始體溫迅速下降，到5小時(shí)時(shí)體溫已接近基礎(chǔ)水平。受試藥物SY-1對致熱家兔有明顯的解熱作用，并表現(xiàn)出一定的劑量依賴關(guān)系，高劑量組解熱作用尤為突出，與阿斯匹林組相當(dāng)。從整個(gè)過程來看，阿斯匹林解熱作用發(fā)揮較快，造模后1小時(shí)體溫上升的抑制率接近50％，SY-1高劑量組為37％，但從解熱作用維持時(shí)間來看，SY-1高劑量組要強(qiáng)于阿斯匹林組，到5小時(shí)時(shí)，SY-1高劑量組體溫與模型組相比仍有顯著性差異。
實(shí)施例6、SY-1對二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響1.實(shí)驗(yàn)材料1.1動(dòng)物雄性昆明種小鼠60只，體重22-26克，由南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物房提供1.2器材灌胃針頭，微量移液槍(20微升)，螺旋測微器。
1.3藥品及試劑SY-1阿斯匹林(乙酚水楊酸腸溶片)，南京白敬宇制藥廠，批號(hào)20020701，板藍(lán)根沖劑，南昌濟(jì)生制藥廠，批號(hào)011207二甲苯，中國杭州化學(xué)試劑廠，批號(hào)20001129。
2.實(shí)驗(yàn)方法小鼠按體重隨機(jī)分成六組模型對照組、阿斯匹林50mg/kg組、板藍(lán)根沖劑3g/kg、SY-1的5、15、45mg/kg組，于實(shí)驗(yàn)當(dāng)天分別用水、阿斯匹林、板藍(lán)根沖劑、SY-1按劑量灌胃1次，5小時(shí)后再灌胃一次，各藥物組兩次給藥的總劑量為100mg/kg，6g/kg，10、30和90mg/kg。
末次灌胃后一小時(shí)于小鼠右耳廓正、反兩面均勻涂100％二甲苯20μl/只，l小時(shí)后將小鼠頸椎脫臼至死，用螺旋測微器測量左右耳殼的厚度，以其厚度差作為腫脹度，將對照組與給藥組的腫脹程度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理(t檢驗(yàn))。
3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表3 SY-1對二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響劑量 小鼠數(shù) 耳廓腫脹度(mm)組別抑制率(％)(mg/kg) (只) (X±SD)模型組 -- 9 0.119±0.031 --SY-1低劑量組10 10 0.062±0.035**47.6SY-1中劑量組30 10 0.05±0.032**57.7SY-1高劑量組90 10 0.045±0.018**62.6阿斯匹林組 100 10 0.058±0.022**51.5板藍(lán)根組600010 0.067±0.026 43.9*P＜0.01，與對照組相比。
如表3所示，與模型組相比，SY-1對耳廓的腫脹呈現(xiàn)了劑量依賴性的抑制作用，三個(gè)劑量組均有極顯著的差異(P＜0.01)，其抑制率分別達(dá)到47.6、57.7和62.6％。阿斯匹林組和板藍(lán)根組亦明顯降低了耳廓腫脹度，抑制率分別為51.5％和43.9％。
實(shí)施例7、SY-1對蛋清所致小鼠足跖腫脹的影響1.實(shí)驗(yàn)材料1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性昆明小鼠70只，體重22-26克。由南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物房提供。
1.2器材灌胃針頭，注射器(1.0ml)，4號(hào)注射針頭，螺旋測微器。
1.3藥品及試劑SY-1。
阿斯匹林(乙酚水楊酸腸溶片)，南京白敬宇制藥廠，批號(hào)20020701，板藍(lán)根沖劑，南昌濟(jì)生制藥廠，批號(hào)011207鮮雞蛋清(10％)取新鮮雞蛋清，用生理鹽水按體積比1∶10混合均勻制成。
2.實(shí)驗(yàn)方法小鼠按體重隨機(jī)分成六組；模型對照組、阿斯匹林50mg/kg組、板藍(lán)根沖劑3g/kg、SY-1的5、15、45mg/kg組，于實(shí)驗(yàn)當(dāng)天分別用水、阿斯匹林、板藍(lán)根沖劑、SY-1按劑量灌胃1次，5小時(shí)后再灌胃一次，各藥物組兩次給藥的總劑量為100mg/kg、6g/kg。10、30和90mg/kg。末次灌胃后一小時(shí)各組小鼠于右后足跖皮下注射10％鮮雞蛋清20微升/只致炎。注射后30min分別測量左、右后足蹈的厚度，以其厚度差作為腫脹度，將對照組與給藥組的腫脹程度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理(t檢驗(yàn))。
3實(shí)驗(yàn)結(jié)果表4 SY-1對蛋清所致小鼠足跖腫脹的影響劑量 小鼠數(shù) 腳爪腫脹度(mm)組別抑制率(％)(mg/kg)(只) (X±SD)模型組 - 100.285±0.103 --SY-1低劑量組10 100.134±0.083**53.2SY-1中劑量組30 100.124±0.065**56.4SY-1高劑量組90 100.119±0.049**58.3阿斯匹林組 100100.106±0.037**62.9板藍(lán)根組6000 100.142±0.052**50.1**P＜0.01，與對照組比較。
如表3所示，與模型對照組相比，SY-1對足跖腫脹呈現(xiàn)了劑量依賴性的抑制作用，三劑量組均有極顯著的差異(P＜0.01)。阿斯匹林組和板藍(lán)根組也明顯地降低了足跖腫脹度。但其效果均不如本發(fā)明的SY-1，甚至所用劑量也大大超過了SY-1。
實(shí)施例8 SY-1對醋酸所致小鼠扭體反應(yīng)的影響1.實(shí)驗(yàn)材料1.1動(dòng)物昆明小鼠60只，雌雄各半，體重18-22克，由南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物房提供1.2器材灌胃針頭，注射器(1.0ml)；4號(hào)注射針頭。
1.3藥品及試劑SY-1阿斯匹林(乙酚水楊酸腸溶片)，南京白敬宇制藥廠；批號(hào)20020701，板藍(lán)根沖劑，南昌濟(jì)生制藥廠，批號(hào)011207
冰醋酸，上?；瘜W(xué)試劑有限公司，批號(hào)；0201101。
2實(shí)驗(yàn)方法小鼠按體重隨機(jī)分成六組模型對照組、阿斯匹林50mg/kg組、板藍(lán)根沖劑3/kg、SY-1的5、15、45mg/lcg組，于實(shí)驗(yàn)當(dāng)天分別用水、阿斯匹林、板藍(lán)根沖劑、SY-1按劑量灌胃1次，S小時(shí)后再灌胃一次，各藥物組兩次給藥的總劑量為100mg/kg、6g/kg、10、30和90mg/kg。末次灌胃后一小時(shí)各組小鼠腹腔注射0.6％的醋酸，每只0.2M，記錄注射致痛劑后，15分鐘內(nèi)各鼠的扭體次數(shù)，計(jì)算藥物鎮(zhèn)痛百分率。用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，比較組間差異。
腹腔注射0.6％的醋酸后，會(huì)引起深部的、大面積而較持久的疼痛刺激，致使小鼠產(chǎn)生“扭體’”反應(yīng)(腹部內(nèi)凹、軀干與后腿伸張、臀部高起)如表5所示，與模型對照組相比，SY-1呈現(xiàn)了顯著的鎮(zhèn)痛效果，三劑量組均有顯著的差異，其對15分鐘內(nèi)扭體次數(shù)抑制率分別達(dá)到了67.9、42.9和77.1％。阿斯匹林組亦明顯地降低了15min內(nèi)扭體數(shù)，鎮(zhèn)痛率分別達(dá)到了69.3％，板藍(lán)根組對扭體反應(yīng)的抑制率為32.3％，但其與模型組相比無顯著性差異。
表5 SY-1對醋酸所致小鼠扭體反應(yīng)的影響劑量 小鼠數(shù) 15mm內(nèi)扭體數(shù)組別鎮(zhèn)痛率(％)(mg/kg)(只) (X±SD)模型組 --9 42.4±18.512 --SY-1低劑量組101013.6±12.258**67.9SY-1中劑量組301024.2±18.996*42.9SY-1高劑量組90109.7±17.101**77.1阿斯匹林組 100 1013±8.981**69.3板藍(lán)根組6000 1028.7±24.788 32.3**P＜0.01*P＜0.05與對照組相比。
實(shí)施例9 SY-1對淋巴細(xì)胞增殖功能的影響1實(shí)驗(yàn)材料1.1動(dòng)物昆明種小鼠若干只，雌性，體重18-22克。
1.2器材手術(shù)器械一套，離心管，200目篩網(wǎng)，注射器內(nèi)芯，冰盒。
1.3藥品及試劑SY-1阿斯匹林(乙酚水楊酸腸溶片\南京白敬宇制藥廠，批號(hào)20020701，RPMI-1640，GIBICO，Lot NO.1120035三(羥甲基)胺基甲烷(Tris)，中國醫(yī)藥(集團(tuán))上?；瘜W(xué)試劑公司，批號(hào)F20020730。
新生牛血清(NBS)。杭州四季青生物工程材料有限公司，批號(hào)021008。
2.實(shí)驗(yàn)方法取小鼠，無菌摘出脾臟。于冷Hank’s液中擠壓分散成單個(gè)脾細(xì)胞懸液，經(jīng)洗滌，Tris-NH4Cl除去紅細(xì)胞后，懸浮于含10％NBS的RPMI 1640培養(yǎng)基中，制成5×104/ml的濃度供培養(yǎng)用。于96空細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入100微升的脾細(xì)胞懸液(細(xì)胞終濃度為2.5×105/ml)。再加100微升培養(yǎng)基(空白對照)、5微克/毫升ConA或100微克/毫升LPS，或含不同濃度藥物的培養(yǎng)基。置37℃，5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時(shí)，終止前4小時(shí)，加入2mg/ml MTT 40微升，4小時(shí)后，離心(1000rpm，5min)，吸棄上清，每孔加入200微升DMSO，振蕩10分鐘。在酶標(biāo)儀540nm處讀取OD值。各實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次，每次實(shí)驗(yàn)使用三復(fù)孔、按下式計(jì)算刺激指數(shù)。
刺激指數(shù)(SI)＝OD(加藥孔)/OD(空白對照)3實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1 SY-1對正常淋巴細(xì)胞增殖的影響表6 SY-1對正常淋巴細(xì)胞增殖的影響組別 濃度(g/ml)SIN 1.0±0.12F 10-31.1±0.05SY-110-81.14±0.1410-71.19±0.210-61.2±0.1810-51.3±0.16*10-41.7±0.03**P＜0.01 VS N組從表6可知，SY-1有一定的促進(jìn)正常淋巴細(xì)胞增殖的趨勢。
3.2 SY-1對ConA刺激的淋巴細(xì)胞增殖的影響表7 SY-1對ConA刺激的淋巴細(xì)胞增殖的影響組別濃度(g/ml) SIConA2.5×10-65.6±0.5#F 10-35.6±0.45SY-110-86.3±0.5610-76.5±0.9810-67.0±1.17*10-56.6±0.19*10-46.9±0.77*#P＜0.01 VS N組，*P＜0.05 VS ConA組如表7所示，ConA組的SI達(dá)到5.6±0.5，SY-1可促進(jìn)ConA刺激的淋巴細(xì)胞的增殖，在10-6g/ml以上濃度時(shí)有顯著性差異。
3.3 SY-1對LPS刺激的淋巴細(xì)胞增殖的影響表8 SY-1對LPS刺激的淋巴細(xì)胞增殖的影響組別 濃度(g/ml) SILPS 5×10-53.6±0.6#F 10-33.6±0.8SY-110-84.6±1.210-74.2±0.910-64.6±1.210-55.2±1.4*10-44.5±1.0#P＜0.01 VS N組，*P＜0.05 VS ConA組如表8所示，LPS組的SI達(dá)到3.6±0.57，SY-1可促進(jìn)LPS刺激的淋巴細(xì)胞的增殖，在10-5g/ml濃度處有顯著性差異。
實(shí)施例10 SY-1抗小鼠病毒感染的實(shí)驗(yàn)一、抗流感病毒的結(jié)果1.材料和方法1.藥物
SY-1陽性對照利巴韋林注射液(國藥準(zhǔn)字XF19990719，批號(hào)20020511)。湖北潛江制藥股份有限公司。
對照藥物板藍(lán)根(衛(wèi)藥準(zhǔn)字1999第129203號(hào)，廠商？)2.動(dòng)物ICR小鼠14-16g，雌雄各半，由江蘇省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。
3.病毒FMI鼠肺適應(yīng)株A/FM1/1/47/(H1N1)南京醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)與免疫學(xué)系保存。
4.小鼠對流感病毒感染的死亡保護(hù)實(shí)驗(yàn)第一次實(shí)驗(yàn)分組和藥物劑量如下第一組SY-1高劑量組(90mg/kg)第二組SY-1中劑量組(30mg/kg)第三組SY-1低劑量組(10mg/kg)第四組利巴韋林組(100mg/kg)第五組板藍(lán)根組(3g/kg)第六組病毒對照組第七組正常對照組每組小鼠數(shù)見表，小鼠均在乙醚輕度麻醉下，鼻腔內(nèi)接種0.03ml/只相當(dāng)于2-5LD50含流感病毒的雞胚尿囊液。
給藥方法SY-1各組，板藍(lán)根組及利巴韋林組于病毒感染前2小時(shí)灌腸法給藥1次，以后2次/天，0.2ml/次，共給藥5天。病毒對照組及正常對照組按同法給予等量蒸餾水替代。
自病毒感染后連續(xù)觀察15天，逐日觀察并記錄小鼠發(fā)病和死亡數(shù)，計(jì)算死亡率、死亡保護(hù)率、平均生活日和延長生命率。
5.小鼠感染流感病毒后肺指數(shù)及肺病變程度的變化實(shí)驗(yàn)分6組，分組方法、攻毒和給藥方法都與死亡保護(hù)實(shí)驗(yàn)相同。
感染后第6天，處死小鼠，稱體重后取出全肺，用生理鹽水洗凈，并用干凈濾紙吸干，稱肺重，計(jì)算肺指數(shù)和肺指數(shù)抑制率，觀察肺病變，無病變記為(-)，＜25％病變記為(1+)，25-50％病變記為(2+)，50-75％病變記為(3+)，＞75％病變記為(4+)，死亡小鼠肺病變記為(5+)，計(jì)算肺病變減輕率。
2.2結(jié)果表9對小鼠流感病毒感染死亡保護(hù)作用

注與第6組相比，*為P＜0.05，**P＜0.01表10對小鼠流感病毒感染肺指數(shù)及肺病變的影響

注與第6組相比，*為P＜0.05，**P＜0.013.結(jié)論SY1對小鼠流感病毒引起的肺炎的死亡保護(hù)、肺病變減輕程度和降低肺指數(shù)方面無明顯意義，但其中劑量組在平均生活日延長方面有顯著意義。
二、SY1抗仙臺(tái)病毒試驗(yàn)1.材料和方法病毒仙臺(tái)病毒鼠肺適應(yīng)株，南京醫(yī)科大學(xué)微生物及免疫學(xué)系保存。
陽性對照藥、試驗(yàn)的動(dòng)物分組和劑量、實(shí)驗(yàn)方法同上。
2.結(jié)果表11對小鼠仙臺(tái)病毒感染死亡的保護(hù)作用


注與第6組相比，*為P＜0.05，**P＜0.01表12對小鼠流感病毒感染肺指數(shù)及肺病變的影響

注與第6組相比，*為P＜0.05，**P＜0.013.結(jié)論SY1對小鼠仙臺(tái)病毒引起的肺炎的平均生活日延長有顯著意義，高劑量和中劑量在減輕肺病變程度和降低肺指數(shù)方面有顯著意義。
如上所述，本發(fā)明的方法能夠高效的提取板藍(lán)根提取物，工藝簡單，有效成分含量高。另外，所得到的產(chǎn)品在抗病毒、抗菌、消炎、清熱鎮(zhèn)痛上均具有卓越的作用。
如上描述了本發(fā)明所公開的板藍(lán)根提取物制備方法和制得的產(chǎn)品及其用途。但需理解其中包含了本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的變化和改變。這些變化和改變也包含在權(quán)利要求所限定的本發(fā)明的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種制備板藍(lán)根提取物組合物的方法，其特征在于，該方法包括步驟(a)用6-12倍板藍(lán)根重量的30-95％重量的乙醇水溶液回流提取，合并乙醇提取液；(b)過濾，回收乙醇，得到藥液；(c)將所得藥液過大孔樹脂吸附柱；(d)用洗滌液洗滌柱，至流出液為無色；(e)用30％-95％重量的乙醇水溶液洗脫，收集洗脫液；(f)干燥得到的洗脫液。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(a)中的乙醇水溶液是藥材重量的8-12倍。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(a)中的乙醇水溶液濃度是50-80％重量。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，重復(fù)所述步驟(a)1-4次，每次回流提取0.5-5小時(shí)。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(e)中的乙醇是65-80％重量的水溶液。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(e)中還包括用高效液相層析法在245nm波長下，流速1.0ml/分鐘，25℃下，用CH3OH∶H2O＝25∶75檢測表告依春的含量。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步驟(f)中還包括先過濾所述洗脫液的步驟。
8.一種板藍(lán)根提取物組合物，其特征在于該組合物是用權(quán)利要求1所述的方法制備的，其中總堿提取物濃度為50％-90％重量，表告依春濃度為10％-30％重量。
9.權(quán)利要求8所述的組合物的用途，其特征在于，該組合物用于制備藥物，所述藥物選自解熱藥物、消炎藥、鎮(zhèn)痛藥、促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖的藥物、和抗病毒感染藥物。
全文摘要
提供了一種制備板藍(lán)根提取物組合物的方法，該方法包括步驟(a)用6－12倍板藍(lán)根重量的30－95％重量的乙醇水溶液回流提取，合并乙醇提取液；(b)過濾，回收乙醇，得到藥液；(c)將所得藥液過大孔樹脂吸附柱；(d)用洗滌液洗滌柱，至流出液為無色；(e)用30％－95％重量的乙醇水溶液洗脫，收集洗脫液；(f)干燥得到的洗脫液。還提供了用該方法制備的板藍(lán)根提取物組合物，及其用于制備藥物，所述藥物選自解熱藥物、消炎藥、鎮(zhèn)痛藥、促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖的藥物、和抗病毒感染藥物。
文檔編號(hào)A61P29/00GK1535707SQ0311030
公開日2004年10月13日 申請日期2003年4月4日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月4日
發(fā)明者徐麗華, 徐強(qiáng), 黃芳 申請人:蘇州市思源醫(yī)藥科技有限公司