專(zhuān)利名稱(chēng)：治療高血糖癥個(gè)體的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及治療高血糖癥個(gè)體的組合物和方法，特別是患II型糖尿病的個(gè)體，更特別是超重的糖尿病個(gè)體。
背景技術(shù)：
糖尿病，是指源自多種病因因素的疾病過(guò)程，該疾病的特征是升高的血清葡萄糖水平，該情況被稱(chēng)為高血糖癥。按照美國(guó)糖尿病協(xié)會(huì)(American DiabetesAssociation)估計(jì)糖尿病影響大約全球6％的人口。由于增加的微血管疾病和大血管疾病的危險(xiǎn)，包括腎病、神經(jīng)病、視網(wǎng)膜病、高血壓、腦血管疾病和冠心病，難以控制的高血糖癥與增加的死亡率和早產(chǎn)兒死亡率有關(guān)。因此，控制高血糖癥是治療糖尿病的重要步驟。
糖尿病有兩種主要形式1型糖尿病(以前稱(chēng)為胰島素依賴(lài)型糖尿病或IDDM)；和2型糖尿病(以前稱(chēng)為非胰島素依賴(lài)型糖尿病或NIDDM)。1型糖尿病是胰島素絕對(duì)不足的結(jié)果，該激素調(diào)節(jié)葡萄糖的利用。這種胰島素絕對(duì)不足常常以胰腺中胰島的β細(xì)胞破壞為特征。2型糖尿病可以從胰島素抵抗為主合并胰島素相對(duì)不足到胰島素不足為主合并某種胰島素抵抗。胰島素抵抗是胰島素在寬范圍濃度中發(fā)揮生物作用的能力下降。在胰島素抵抗的個(gè)體中，機(jī)體分泌不正常的大量胰島素以補(bǔ)償這種缺陷。當(dāng)釋放的胰島素的量不足以補(bǔ)償胰島素抵抗和不足以控制葡萄糖時(shí)，產(chǎn)生了葡萄糖耐受受損的狀態(tài)。在相當(dāng)數(shù)量的個(gè)體中，胰島素分泌進(jìn)一步下降，血清葡萄糖水平上升，導(dǎo)致糖尿病的臨床表現(xiàn)。
大部分2型糖尿病個(gè)體的治療或使用刺激β細(xì)胞釋放胰島素的降糖制劑，或使用增加個(gè)體組織對(duì)胰島素敏感性的制劑，或使用胰島素?；酋ｋ孱?lèi)藥物是刺激β細(xì)胞釋放胰島素的制劑的例子。在用于增加組織對(duì)胰島素敏感性的制劑中，二甲雙胍是代表性例子。盡管磺酰脲類(lèi)藥物廣泛用于II型糖尿病的治療，但該治療在大多數(shù)情況下，并不滿(mǎn)意。在大量的II型糖尿病個(gè)體中，磺酰脲類(lèi)藥物不能夠使血糖水平正常，因此，個(gè)體有糖尿病并發(fā)癥的高風(fēng)險(xiǎn)。而且，許多個(gè)體逐漸喪失了對(duì)磺酰脲類(lèi)藥物治療的反應(yīng)能力和逐漸被迫使用胰島素治療。個(gè)體這種從口服降糖制劑向胰島素治療的轉(zhuǎn)變常常歸因于II型糖尿病個(gè)體胰腺中β細(xì)胞的耗竭。
胰島素刺激骨骼肌和脂肪組織攝入葡萄糖主要通過(guò)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(GLUT4)從細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存位置易位到細(xì)胞表面。(Saltiel，A.R.和Kahn，C.R.(2001)Nature 414799-806；Saltiel，A.和Pessin，J.E.(2002)Trends in Cell Biol.1265-71；White，M.F.(1998)Mol.Cell.Biochem.1823-11)。在對(duì)胰島素的應(yīng)答中，一部分在細(xì)胞內(nèi)膜上的GLUT4被重新分布到漿膜，使細(xì)胞表面的GLUT4增加和細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取增加。GLUT4的易位主要是胰島素受體(IR)介導(dǎo)的。
除了葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)，胰島素還與脂肪形成密切有關(guān)，該過(guò)程涉及前脂肪細(xì)胞的增殖和伴隨脂肪在脂肪細(xì)胞中的積聚前脂肪細(xì)胞分化成脂肪細(xì)胞。對(duì)脂肪細(xì)胞系3T3-L1的研究提示胰島素在脂肪形成中的作用主要是在有絲分裂上。在分化前，3T3-L1細(xì)胞是纖維細(xì)胞樣的前脂肪細(xì)胞，包含的IGF-1受體比IR多。在體外，前脂肪細(xì)胞的脂肪形成可以被通常使用的分化誘導(dǎo)劑混合物，MDI誘發(fā)，MDI包含升高cAmp的制劑甲基異丁基黃嘌呤(MIX)；一種糖皮質(zhì)激素，地塞米松(DEX)；以及可與IGF-1受體在前脂肪細(xì)胞上反應(yīng)的胰島素(或IGF-1)(Tong，Q.，Hotamisligil，G.S.(2001)Rev.in Endo.& metabolic Disorders.2349-355；Rosen，E.D.等，(2000)Genes Dev.141293-1307)。當(dāng)使用MDI時(shí)，融合的前脂肪細(xì)胞重新進(jìn)入細(xì)胞循環(huán)和經(jīng)歷大約二輪有絲分裂(Modan-Moses，D.等，(1998)Biochen.J.333825-831；Tong，Q.，Hotamisligil，G.S.(2001)Rev.in Endo.& metabolic Disorders.2349-355；Rosen，E.D.等，(2000)Genes Dev.141293-1307)，該過(guò)程通常稱(chēng)為克隆擴(kuò)增。在克隆擴(kuò)增后，該前脂肪細(xì)胞退出細(xì)胞循環(huán)并通過(guò)表達(dá)脂肪細(xì)胞基因包括C/EBP-α，β，δ和PPAR-γ開(kāi)始分化成脂肪細(xì)胞。
作為脂肪形成效應(yīng)的結(jié)果，胰島素具有促進(jìn)II型糖尿病個(gè)體肥胖的不佳效果。(見(jiàn)Moller，D.E.(2001)Nature414821-827)不幸的是，現(xiàn)在用于刺激2型糖尿病個(gè)體葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的其他抗糖尿病藥物也具有脂肪形成效力。所以當(dāng)現(xiàn)存的藥物治療降低血糖時(shí)，也促進(jìn)肥胖。因此，需要新的治療高血糖癥的組合物和方法。特別需要能刺激葡萄糖攝取同時(shí)產(chǎn)生伴隨的脂肪形成副作用的組合物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了治療高血糖癥個(gè)體的一種部分提純的植物提取物。所述部分提純的植物提取物包含許多分子量在800-1500克/摩爾之間的水溶性化合物。所述部分提純的植物提取物中的一種化合物是已知為五-O-沒(méi)食子酰-D-葡萄糖的可水解的丹寧酸。所述部分提純的植物提取物幾乎不含三萜系化合物，包括corosolic acid和高分子量的鞣花丹寧，即分子量超過(guò)1500克/摩爾的鞣花丹寧。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述部分提純的植物提取物來(lái)自熱帶植物大葉紫薇(LagerstroemiaSpeciasa.L)，該植物也被稱(chēng)為巴拿巴(banaba)。
本發(fā)明還提供了一種降低高血糖癥個(gè)體的血中葡萄糖水平的方法。該方法包括使用所述部分提純的植物提取物治療高血糖癥個(gè)體。雖然可能通過(guò)注射使用所述部分提純的植物提取物，但使用的較佳方法涉及口服使用。該方法治療高血糖癥個(gè)體和糖尿病個(gè)體有效。該方法特別對(duì)治療超重的II型糖尿病個(gè)體有效。
附圖簡(jiǎn)述

圖1巴拿巴的熱水提取物(BE)在3T3-L1脂肪細(xì)胞中對(duì)葡萄糖攝取的影響。置于12孔板內(nèi)的脂肪細(xì)胞與巴拿巴的熱水提取物(BE)，巴拿巴HP-20甲醇洗脫液(BME)和巴拿巴HP-2柱水洗脫液(BWE)一起培養(yǎng)15分鐘，或以脂肪細(xì)胞加胰島素為陽(yáng)性對(duì)照，或以未經(jīng)處理的脂肪細(xì)胞作為陰性對(duì)照，隨后分析2-脫氧-D-[3H]葡萄糖的攝取。數(shù)據(jù)是平均值±SD，n＝8.不同字母的平均值不同，p＜0.01。
圖2巴拿巴的熱水提取物(BE，圖A)或胰島素(圖B)的濃度對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞攝取葡萄糖的影響。在12孔板內(nèi)的已分化的3T3-L1細(xì)胞與不同濃度的BE或胰島素一起培養(yǎng)15分鐘，隨后分析2-脫氧-D-[3H]葡萄糖攝取。數(shù)據(jù)是平均值±SEM，n＝6。
圖3胰島素和巴拿巴的熱水提取物(BE)在3T3-L1脂肪細(xì)胞中對(duì)葡萄糖攝取的聯(lián)合影響。已分化的3T3-L1細(xì)胞與胰島素加或不加0.1g/l BE(A)一起培養(yǎng)15分鐘，或者與BE加或不加1μmol/L胰島素(B)一起培養(yǎng)15分鐘，隨后分析2-脫氧-D-[3H]葡萄糖攝取。數(shù)據(jù)是平均值±SEM，n＝6。
圖4巴拿巴的熱水提取物(BE)在沒(méi)有胰島素的情況下在3T3-L1細(xì)胞中對(duì)脂肪細(xì)胞分化的影響。未分化的3T3-L1前脂肪細(xì)胞與胰島素或BE在加入地塞米松(DEX)和3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)后培養(yǎng)。培養(yǎng)10天后，通過(guò)細(xì)胞攝取葡萄糖的活性來(lái)分析脂肪細(xì)胞分化的程度。數(shù)據(jù)是平均值±SD，n＝6。不同字母的平均值不同，p＜0.01。
圖5BE、BWE、BME在加入胰島素(IS)的情況下在3T3-L1細(xì)胞中對(duì)脂肪細(xì)胞分化的影響。在已有地塞米松(DEX)和3-異丁基-l-甲基黃嘌呤(IBMX)的情況下，通過(guò)胰島素，(BE+IS)、(BME+IS)或(BWE+IS)誘導(dǎo)未分化的3T3-L1前脂肪細(xì)胞。在培養(yǎng)10天后，細(xì)胞在放大倍數(shù)X200下拍照。(A)無(wú)誘導(dǎo)；(B)IS；(C)BE(0.5g/L)和IS；(D)BME(0.5g/L)和IS；(E)BWE(0.5g/L)和IS。圖顯示的是四個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中的一個(gè)。所有四個(gè)實(shí)驗(yàn)顯示近似的結(jié)果。
圖6在有胰島素(IS)的情況下巴拿巴的熱水提取物(BE)的誘導(dǎo)時(shí)間和濃度在3T3-L1細(xì)胞中對(duì)脂肪細(xì)胞分化的影響。3T3-L1前脂肪細(xì)胞在有地塞米松(DEX)和3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)的情況下，在第0天用IS誘導(dǎo)。在初始誘導(dǎo)后不同時(shí)間加入BE(A)或在初始誘導(dǎo)時(shí)加入不同濃度的BE(B)。通過(guò)細(xì)胞攝取葡萄糖活動(dòng)來(lái)分析不同條件下3T3-L1細(xì)胞的分化程度。數(shù)據(jù)是平均值±SD，n＝6。不同字母的平均值不同，p＜0.01。
圖7巴拿巴的甲醇(MeOH)提取物和水(H2O)提取物在3T3-L1脂肪細(xì)胞中對(duì)葡萄糖攝取的影響。
圖8巴拿巴的水提取物在3T3-L1細(xì)胞中對(duì)脂肪細(xì)胞分化的影響。
圖9不同濃度的巴拿巴水提取物在3T3-L1細(xì)胞中對(duì)葡萄糖攝取的影響。
圖10通過(guò)測(cè)量葡萄糖的攝取，了解地塞米松(DEX)和3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)在3T3-L1細(xì)胞中對(duì)脂肪細(xì)胞分化的影響。
圖11通過(guò)測(cè)量葡萄糖的攝取，了解胰島素或巴拿巴的水提取物在3T3-L1細(xì)胞中對(duì)脂肪細(xì)胞分化的影響。
圖12巴拿巴的水提取物在3T3-L1細(xì)胞中對(duì)脂肪形成的抑制。
圖13通過(guò)測(cè)量葡萄糖的攝取，了解不同濃度的巴拿巴的水提取物在3T3-L1細(xì)胞中對(duì)脂肪細(xì)胞分化無(wú)誘導(dǎo)。
圖14通過(guò)測(cè)量葡萄糖的攝取，了解巴拿巴的水提取物在3T3-L1細(xì)胞中對(duì)胰島素刺激的脂肪細(xì)胞分化的抑制是時(shí)間依賴(lài)性的。
圖15巴拿巴的水提取物在3T3-L1細(xì)胞中對(duì)胰島素刺激的脂肪細(xì)胞分化的抑制是濃度依賴(lài)性的。
圖16使用50mg葡萄糖加巴拿巴的熱水提取物(BE)或不加巴拿巴的熱水提取物(BE)喂養(yǎng)的一般小鼠的血液葡萄糖水平的變化。
圖17使用HPLC運(yùn)行方法1分離的巴拿巴的熱水提取物的HPLC圖譜。圖中標(biāo)記的組分1-6被分離出來(lái)，隨后分析它們葡萄糖攝取刺激活性(glucose uptake-stimulatory activities)。
圖18使用HPLC運(yùn)行方法1的組分1-6的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)刺激活性。
圖19使用HPLC運(yùn)行方法2分離的巴拿巴熱水提取物的HPLC圖譜。圖中標(biāo)記的亞組分1-3被分離出來(lái)，隨后分析它們的葡萄糖攝取刺激活性。
圖20使用HPLC運(yùn)行方法2產(chǎn)生的亞組分1-3的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)刺激活動(dòng)。
圖21使用HPLC運(yùn)行方法3分離的巴拿巴熱水提取物的HPLC圖譜。使用HPLC運(yùn)行方法2產(chǎn)生的F2和F3組分進(jìn)一步用HPLC運(yùn)行方法3分離成單峰。為隨后測(cè)定葡萄糖刺激活性，一些單峰被分離(收集)。
圖22使用HPLC運(yùn)行方法3產(chǎn)生的亞-亞組分(sub-subfaction)SSF12、SSF13、SSF14、SSF15、SSF16、SSF18和SSF19的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)刺激活動(dòng)。
發(fā)明詳述定義術(shù)語(yǔ)“糖尿病”指通常由于在葡萄糖的產(chǎn)生和利用上有代謝缺陷而導(dǎo)致無(wú)法保持機(jī)體的合適血糖水平為特征的疾病或情況。這些缺陷導(dǎo)致血液葡萄糖升高，稱(chēng)為“高血糖癥”。糖尿病的兩種主要形式是1型糖尿病和2型糖尿病。如上所述，1型糖尿病通常是調(diào)節(jié)葡萄糖利用的激素-胰島素絕對(duì)不足的結(jié)果。2型糖尿病常發(fā)生在胰島素正常甚至是胰島素水平升高者中，從組織的能力不足到對(duì)胰島素不能適當(dāng)反應(yīng)可以導(dǎo)致2型糖尿病。大多數(shù)2型糖尿病個(gè)體是胰島素抵抗和胰島素相對(duì)不足，因而胰島素的分泌不能補(bǔ)償外周組織對(duì)胰島素的對(duì)抗。而且，許多2型糖尿病個(gè)體是肥胖者。其他類(lèi)型的葡萄糖自身穩(wěn)定的失衡包括葡萄糖耐受受損，該代謝階段是介于正常葡萄糖自身穩(wěn)定和糖尿病中間的階段。2型糖尿病和葡萄糖耐受受損的診斷指導(dǎo)已由美國(guó)糖尿病協(xié)會(huì)(American Diabetes Association)列出。(例如參見(jiàn)“糖尿病診斷和分類(lèi)專(zhuān)家委員會(huì)”(Expert Committee on the Diagnosis andClassification of Diabetes Mellitus)，Diabetes Care，(1999)第2卷(增補(bǔ)本1)S5-19)。
術(shù)語(yǔ)“癥狀”在糖尿病包括，但不限于，本文使用的多尿、煩渴和多食、高胰島素血癥和高血糖癥，包括它們的普通使用。例如，“多尿”指在指定的時(shí)間內(nèi)有大量的尿；“煩渴”指慢性的、過(guò)多的口渴；“多食”指過(guò)多進(jìn)食；高胰島素血癥指血液中胰島素水平升高。糖尿病的其他癥狀，例如，對(duì)某些感染的易感性增加(特別是真菌和葡萄球菌感染)，惡心和酮癥酸中毒(血液中產(chǎn)生的酮體增多)。
本文使用的“可水解的丹寧酸”指三羥苯甲酰葡萄糖化合物，該花合物是帶有一個(gè)或多個(gè)三羥基苯羧酸的葡萄糖酯。
本文使用的“三萜系化合物”指三萜烯或三萜烯衍生物的化合物。三萜系化合物的一個(gè)例子就是在植物中找到的corosolic acid。
本文使用的“幾乎不含三萜系化合物”指部分提純的植物提取物中包含的一種或多種三萜系化合物占提取物重量小于1％。本發(fā)明中部分提純的植物提取物中包含的一種或多種三萜系化合物占提取物重量小于0.5％較佳，部分提純的植物提取物中包含的一種或多種三萜系化合物占提取物重量小于0.1％更佳。
在一方面，本發(fā)明提供了部分提純的植物提取物，在下文中稱(chēng)為“TE”，用來(lái)治療高血糖癥個(gè)體非胰島素依賴(lài)的II型糖尿病個(gè)體或肥胖者。在一個(gè)實(shí)施方案中，TE是熱帶植物大葉紫薇的葉的部分提純的植物提取物，該植物也被稱(chēng)為巴拿巴。TE包括許多水溶的、親水的、熱穩(wěn)定的、非蛋白質(zhì)的、非DNA的、非脂質(zhì)的化合物。TE中的一種化合物是已知為五-O-沒(méi)食子酰-D-葡萄糖的可水解的丹寧酸。TE還包含許多分子量在800-1500克/摩爾之間的一種或多種化合物。按照本發(fā)明，已經(jīng)確定巴拿巴的熱水提取物，在下文中稱(chēng)為“BE”，和TE都能在3T3-L1脂肪細(xì)胞刺激葡萄糖攝取而不誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞分化。BE攝取葡萄糖刺激能力是時(shí)間依賴(lài)的和濃度依賴(lài)的。按照本發(fā)明，還確定BE與葡萄糖同時(shí)喂養(yǎng)小鼠時(shí)，接受葡萄糖喂養(yǎng)的一般小鼠的血液葡萄糖水平會(huì)下降。按照本發(fā)明，還確定三萜系化合物在TE中不出現(xiàn)或在TE中以很小的量出現(xiàn)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，按照以下步驟從巴拿巴植物的葉中分離TE1.在水中煮沸巴拿巴茶制備熱水提取物(HWE)，優(yōu)選煮沸至少30分鐘。
2.熱水提取物(HWE)被濃縮，優(yōu)選通過(guò)加熱蒸發(fā)，過(guò)濾并離心以除去微粒物質(zhì)，優(yōu)選凍干以形成粉末。
3.然后將該粉末被溶解在水中以提供10％(w/v)的提取液并用高效液相色譜(HPLC)在C-18反相柱上分離成各個(gè)組分。HPLC條件如下用于把巴拿巴熱水提取物分離為單個(gè)組分的HPLC法。
HPLC系統(tǒng)是Beckman System Gold，包含一個(gè)125溶劑艙，一個(gè)168PDA檢測(cè)器和一個(gè)508自動(dòng)取樣器。使用Beckman Ultrasphere C-18反相柱(10.0mm×250mm I.D.，5μm)。檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)定為210nm、300nm和370nm。洗脫液A是水和0.1％三氟乙酸的混合物，洗脫液B是乙腈和0.1％三氟乙酸的混合物。使用ISCO的小Foxy的組分收集器在時(shí)間窗內(nèi)收集單個(gè)組分。按照下列線性梯度從A到B在250分鐘內(nèi)以流速2ml/min進(jìn)行分離等度洗脫A25分鐘，30分鐘內(nèi)從100∶0到95∶5，等度洗脫25分鐘，2分鐘內(nèi)從95∶5到91.8∶8.2，等度洗脫18分鐘，35分鐘內(nèi)從91.8∶8.2到90∶10，等度洗脫20分鐘，15分鐘內(nèi)從90∶10到88.5∶11.5，3分鐘內(nèi)從88.5∶11.5到85∶15，等度洗脫27分鐘，15分鐘內(nèi)從85∶15到80∶20，等度洗脫15分鐘，10分鐘內(nèi)從80∶20到50∶50隨后等度洗脫10分鐘。
在每次運(yùn)行，使用自動(dòng)取樣器注入100μl的10％的巴拿巴熱水提取物。組分收集窗在注入40分鐘后開(kāi)始，在250分鐘后結(jié)束。在收集窗內(nèi)按照峰的高度和寬度在波長(zhǎng)300nm收集各個(gè)組分(在波長(zhǎng)300nm，HPLC圖中本窗口的蘭色光譜顯示的峰與210nm(黑色光譜)顯示的一致)。每一個(gè)組分(峰)的保留時(shí)間，顯示葡萄糖攝取測(cè)定的陽(yáng)性結(jié)果，是

窗口以外的組分和窗口內(nèi)未被上述指定的峰就不收集并被棄入廢物處。
在另一方面，本發(fā)明提供了用于治療高血糖癥個(gè)體的方法。這些個(gè)體包括II型糖尿病個(gè)體。該方法包括對(duì)個(gè)體使用含有治療上有效的量的TE的組合物。本發(fā)明的方法對(duì)治療超重的糖尿病個(gè)體特別有效。
劑量用于個(gè)體的TE是在治療有效量。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“治療有效量”指能夠充分顯示有意義的益處的總量，有意義的益處如個(gè)體血液葡萄糖水平的降低?？紤]本文的公開(kāi)內(nèi)容，用本領(lǐng)域中普通技術(shù)的一種使用合適的對(duì)照進(jìn)行常規(guī)的試驗(yàn)可以確定獲得有意義的結(jié)果所需的TE劑量。對(duì)適當(dāng)治療組和對(duì)照的對(duì)比會(huì)指出對(duì)降低個(gè)體血液葡萄糖水平有效的特定劑量。
所需TE的量取決于被治療情況的特性和嚴(yán)重性。也取決于個(gè)體先前接受的治療的特性。最終，該劑量是通過(guò)臨床試驗(yàn)來(lái)確定的。起先，臨床醫(yī)生會(huì)按照源自動(dòng)物研究的劑量使用。一次使用組合物可以獲得有效的量?？蛇x擇的，對(duì)個(gè)體多次使用組合物可以獲得有效的量。在體外，生物學(xué)上有效的量，也就是，足夠誘導(dǎo)葡萄糖攝取的量，是增加兩倍使用的以確定活性的全部范圍?？诜⑵は潞挽o脈內(nèi)使用的功效是在臨床研究中確定的。雖然單次使用TE可能是有利的，但多劑使用被認(rèn)為是較佳的。
輸送TE通過(guò)口服使用較佳。雖然不是較佳，TE也可以注射使用。
適合口服使用的本發(fā)明的劑型可以表現(xiàn)為分離的單位如膠囊、扁形膠囊、片劑、大丸藥或糖錠，每一種都包含實(shí)事先定量的活性化合物；如粉劑或小粒；或是液體形式，如水溶液、懸液、糖漿、酏劑、乳劑、分散劑等等。TE可以用丸劑形式(膠囊中的粉劑或濃縮液)或粉劑形式(干粉但壓制成顆粒，在放入水中可以被消耗(類(lèi)似于喝茶或喝咖啡))使用。
適合胃腸外使用的劑型容易包含消毒準(zhǔn)備，消毒時(shí)活性化合物在，例如，注射用水、鹽、聚乙烯乙二醇溶液等等，這些物質(zhì)與接受者的血液等滲較佳。有用的劑型還包括含有TE的溶液或固體，該溶液或固體在合適的溶劑中稀釋后成為適合胃腸外使用的溶液。
除了所述各種成分，本發(fā)明的劑型還可以包含任選的附加成分，這些成分是在藥學(xué)劑型領(lǐng)域中使用的，即稀釋劑、緩沖劑、調(diào)味劑、著色劑、粘合劑、表面活性劑、增厚劑、潤(rùn)滑劑、懸浮劑、防腐劑(包括抗氧化劑)等等。
對(duì)任何指征情況有效所需的量當(dāng)然會(huì)隨著被治療的哺乳動(dòng)物個(gè)體而有所變化，最終由醫(yī)學(xué)或獸醫(yī)從業(yè)者的判斷力決定。需要考慮的因素包括要治療的情況、使用的途徑、劑型的特性、哺乳動(dòng)物的體重、表面積、年齡和一般情況，以及使用的特殊提取物。每日總劑量可以用單劑給予，多劑給予，如每日二到六次，或在選出的持續(xù)時(shí)間內(nèi)在靜脈內(nèi)注入。在上述引用的范圍之上或之下的劑量是屬于本發(fā)明的范圍，如果是需要和必須可以用于個(gè)體個(gè)體。
所述組合物包含生物學(xué)上有效的量的TE，和，任選的相對(duì)惰性載體。許多這些載體是常規(guī)使用的和可以通過(guò)參考藥學(xué)教科書(shū)確定的。該可接受的載體是生理上可接受的稀釋劑和輔助劑。術(shù)語(yǔ)“生理上可接受的”指不干擾類(lèi)似物效果的非毒性物質(zhì)。載體的特點(diǎn)取決于使用的途徑和特殊化合物或組合物中化合物的組合物。該劑型的制備是在本領(lǐng)域中的技術(shù)水平中的。所述組合物還可包含其他或是增加類(lèi)似物活性或是補(bǔ)充類(lèi)似物活性的制劑。所述組合物還可包含填充劑、穩(wěn)定劑、增溶劑和其他本領(lǐng)域熟知的物質(zhì)。
實(shí)施例下列實(shí)施例僅是為了用于闡明，并不是為了限制所附的權(quán)利要求。本文所有引用的參考文件都被完整的使用于本文。
實(shí)施例1巴拿巴的熱水提取物對(duì)葡萄糖攝取和脂肪形成的影響A.材料和方法材料3T3-L1纖維細(xì)胞是從美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所(ATCC，Rockville，MD)購(gòu)買(mǎi)。巴拿巴葉是Huagen Pharmaceuticals(香港)贈(zèng)送的。Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)和Dulbecco PBS(DPBS)來(lái)自Gibco Life Technologies(Grand Island，NY)。胎牛血清(FBS)來(lái)自Atlanta Biologicals公司(Norcross，GA)。牛胰島素(IS)，3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)和地塞米松(DEX)來(lái)自Sigma Chemical(圣路易斯，MO)。2-脫氧-D-[3H]葡萄糖來(lái)自Amersham Pharmacia Biotech(Piscataway，NJ)。Dianion HP-20樹(shù)脂來(lái)自Mitsubishi Chemical Corporation(日本東京)?？故驡LTU4單克隆抗體來(lái)自Biogenesis(Brentwood，NH)。
巴拿巴提取物的制備巴拿巴提取物的制備是按照以前描述的方法(Kakuda，T.等，(1996)Biosci.Biotechnol.Biochem.60204-208)和一些改進(jìn)。巴拿巴熱水提取物的分離是用50克巴拿巴茶在1升蒸餾水中煮沸30分鐘，通過(guò)熱蒸發(fā)濃縮以降低總體積，隨后在30,000g超離心30分鐘，用0.45μm的濾器過(guò)濾，和凍干。該BE經(jīng)過(guò)Dianion HP-20樹(shù)脂柱進(jìn)一步分離。該BE被置于充滿(mǎn)Dianion HP-20樹(shù)脂的柱上，隨后用蒸餾水(BWE)洗滌，被吸收的組分用甲醇(BME)洗提。從柱中被洗提出來(lái)的兩組分被分別濃縮和凍干。巴拿巴提取物粉劑(BE和BWE)溶解于經(jīng)過(guò)消毒的水中，隨后為脂肪細(xì)胞分化研究進(jìn)一步用0.2μm的濾器消毒。除非另加表明，BE被用于本研究。
細(xì)胞培養(yǎng)和脂肪細(xì)胞分化3T3-L1細(xì)胞在37℃，10％CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，維持在DMEM中，補(bǔ)充10％FBS。前脂肪細(xì)胞3T3-L1細(xì)胞在12孔板上生長(zhǎng)直至融合后2天。分化是按照以前描述的(20)進(jìn)行誘導(dǎo)，加入1mg/L IS，0.5mmol/L IBMX和0.25μmol/L DEX(IS-IBMX-DEX)。誘導(dǎo)后2天，含有IS-IBMX-DEX的培養(yǎng)液被只含有1mg/L IS的培養(yǎng)液所取代。2天后第一次用新鮮培養(yǎng)液(DMEM加10％FBS)取代該培養(yǎng)液并隨后隔天使用。為了確定巴拿巴提取物在脂肪細(xì)胞分化中的作用，BE被加到培養(yǎng)液中或是取代胰島素(BE-IBMX-DEX)，或補(bǔ)充IS-IBMX-DEX(BE-IS-IBMX-DEX)。在誘導(dǎo)開(kāi)始后9-12天，不同誘導(dǎo)的細(xì)胞攝取葡萄糖能力被分析。
葡萄糖攝取能力分析通過(guò)對(duì)2-脫氧-D-[3H]葡萄糖攝取的測(cè)量來(lái)葡萄糖攝取測(cè)定能力，方法如以前所述的(Sakoda，H等，(1999)Diabetes 481365-1371；Garcia de Herreros，A.和Birnbaum，M.J.(1989)J.Biol.Chem.26419994-19999)。簡(jiǎn)言之，生長(zhǎng)在12孔板上的融合的3T3-L1脂肪細(xì)胞被無(wú)血清的DMEM清洗2次并在1ml的相同培養(yǎng)液中在37℃培養(yǎng)2小時(shí)。該細(xì)胞用Krebs-Ringer-Hepes(KRP)緩沖液清洗3次并在0.9mlKRP緩沖液中在37℃培養(yǎng)15分鐘。加入0.1ml KRP緩沖液和3.7×107Bq/L 2-脫氧-D-[3H]葡萄糖和1mmol/L葡萄糖作為最終濃度以啟動(dòng)葡萄糖攝取。10分鐘后，通過(guò)用冷PBS清洗細(xì)胞3次以終止葡萄糖攝取。用0.7ml 1％ Triton X-100在37℃作用20分鐘使細(xì)胞溶解。細(xì)胞溶解產(chǎn)物中保留的放射活性由閃爍計(jì)數(shù)器確定。在100mmo/L的葡萄糖濃度中測(cè)量非特異性葡萄糖攝取。使用配對(duì)斯氏t檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，設(shè)定p＜0.05為明顯差異水平。
脂肪細(xì)胞分化的分析不分化的3T3-L1前脂肪細(xì)胞按照上述方法被誘導(dǎo)分化成脂肪細(xì)胞。通過(guò)顯微觀察脂質(zhì)堆積，又通過(guò)如上所述的在誘導(dǎo)結(jié)束時(shí)顯示攝取葡萄糖能力來(lái)評(píng)估不同制劑誘導(dǎo)細(xì)胞分化的程度?；诜只闹炯?xì)胞可以被胰島素誘導(dǎo)以攝取葡萄糖而前脂肪細(xì)胞不能被胰島素誘導(dǎo)以攝取葡萄糖的觀察，本處選擇和使用葡萄糖攝取分析以確定脂肪細(xì)胞分化的程度。
Northern印跡和Western印跡分析被胰島素、IBMX和DEX，和BE的不同組合物所誘導(dǎo)的T3-L1細(xì)胞的總RNA或總蛋白質(zhì)按照標(biāo)準(zhǔn)步驟分離。為了檢測(cè)PPARγ2mRNA的表達(dá)，與PPARγ2 cDNA編碼區(qū)+29到+336的核苷相對(duì)應(yīng)的308個(gè)堿基對(duì)的片段在32p標(biāo)記后用做探針，和10～tg總RNA(誘導(dǎo)144小時(shí)后分離)被用于每個(gè)樣品。對(duì)于Western印跡分析，使用抗鼠GLTU4單克隆抗體和在每個(gè)道上放入100Etg的總蛋白質(zhì)。
B.結(jié)果和討論就象胰島素，巴拿巴熱水提取物和巴拿巴HP-20甲醇洗提物(分別是BE和BME)都可以在3T3-L1脂肪細(xì)胞刺激葡萄糖攝取，而巴拿巴HP-20水洗提物(BWE)不能夠(P＜0.05，圖1)，提示在巴拿巴提取物中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)誘導(dǎo)活性的有效成分是水溶性的但相對(duì)無(wú)極性。同樣，在提取物制備過(guò)程中經(jīng)過(guò)煮沸和加熱蒸發(fā)，該活性仍維持，提示有效成分是熱穩(wěn)定的，不太可能是蛋白質(zhì)。
BE的濃度對(duì)葡萄糖攝取的影響同胰島素的濃度對(duì)葡萄糖攝取的影響進(jìn)行對(duì)比。BE攝取葡萄糖活性的濃度依賴(lài)曲線(圖2a)與胰島素?cái)z取葡萄糖活性的濃度依賴(lài)曲線(圖2b)很相似。刺激出最高攝取葡萄糖的BE的濃度范圍是約0.1g/L到0.25g/L(圖2a)。兩個(gè)劑量-反應(yīng)曲線的相似和BE刺激葡萄糖攝取活性所需的誘導(dǎo)時(shí)間與胰島素的該時(shí)間很相似，不超過(guò)15分鐘(參考材料和方法中攝取葡萄糖活性分析)，提示BE刺激葡萄糖攝取的機(jī)制與胰島素刺激葡萄糖攝取的機(jī)制相似。(Flores-Riveros，J.R.等，(1993)Proc.Natl.acad.Sci.USA 90512-516；Fong，J.C.等，(1999)Cell.Signal.1153-58；Baldwin，S.A.等，(1995)Biosci.Reports 15419-426)，與其他使用已知的化學(xué)物質(zhì)不同(Flores-Riveros，J.R.等，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90512-516；Baldwin，S.A.等，(1995)Biosci.Reports 15419-426；Szalkowaki，D.等，(1995)Endocrinol.1361474-1481；Murakami，N.，Inoue等，(1997)Life Sci.601821-1831)。
為了檢測(cè)BE是否能進(jìn)一步增加胰島素?cái)z取葡萄糖活性，0.1g/L的BE被加到不同濃度的胰島素中(0到1000nmol/L)。與單獨(dú)使用胰島素相比，未觀察到葡萄糖攝取的增加(圖3a)，提示在BE和胰島素之間沒(méi)有累加或配合效果。相反，觀察到BE加到胰島素中葡萄糖攝取活性降低(P＜0.05)(圖3b)?；贐E攝取葡萄糖誘導(dǎo)活性和BE對(duì)胰島素誘導(dǎo)葡萄糖攝取的抑制活性的觀察，提出BE作用機(jī)理的假設(shè)。BE可能與一種蛋白質(zhì)因子相互作用，該蛋白質(zhì)因子直接涉及胰島素介導(dǎo)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)通路，該通路始于胰島素受體終于GLUT4，因此激活葡萄糖攝取。在另一方面，BE與該蛋白質(zhì)因子相互作用可能在結(jié)構(gòu)上改變了該因子的構(gòu)形，阻止該因子合適地接收由胰島素-胰島素受體結(jié)合而啟動(dòng)攝取葡萄糖信號(hào)。BE刺激葡萄糖攝取的機(jī)理與其他普通抗糖尿病藥物如噻唑烷二酮類(lèi)(TZD)的作用機(jī)理明顯不同(Stevenson，R.W.等，(1996)Diabetes 4560-66，30)。噻唑烷二酮類(lèi)(TZD)刺激胰島素?cái)z取是緩慢和間接的機(jī)理，通過(guò)活化PPARγ，PPARγ依次上調(diào)GLUT4基因表達(dá)。(Stevenson，R.W.等，(1996).Diabetes 4560-66，Park，K.S.等，(1998)J.Clinical Endocrinol.Metab.831636-1643；Kerstein，S.等，(2000)Nature 405421-424)。相反，BE攝取葡萄糖刺激活性看起來(lái)更快，和更直接。BE中的有效化合物可能代表一群新的化學(xué)物質(zhì)，這些化學(xué)物質(zhì)可能作為噻唑烷二酮類(lèi)(TZD)的替換在細(xì)胞和動(dòng)物中誘導(dǎo)葡萄糖攝取。
在加入含有胰島素、IBMX和DEX(20)的混合物后，未分化3T3-L1前脂肪細(xì)胞能被轉(zhuǎn)變?yōu)橹炯?xì)胞。但是，當(dāng)1mg/L到100mg/L的BE代替胰島素并與IBMX和DEX加到前脂肪細(xì)胞，沒(méi)有觀察到3T3-L1細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化，如葡萄糖攝取分析所顯示的(圖4)。這個(gè)結(jié)果提示BE在3T3-L1細(xì)胞中不誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞分化。有趣的是，BE和BME與IS-IBMX-DEX一起培養(yǎng)時(shí)，可以抑制脂肪形成而B(niǎo)WE不能(圖5)。這提示脂肪分化抑制活性和葡萄糖攝取活性都源自BME(圖1)。進(jìn)一步顯示BE對(duì)脂肪細(xì)胞分化的抑制是時(shí)間依賴(lài)的(圖6a)和濃度依賴(lài)的(圖6b)。這些結(jié)果與顯微觀察的脂肪積聚的結(jié)果一致(圖5)。與BE和IS-IBMX-DEX一起培養(yǎng)的3T3-L1前脂肪細(xì)胞的分化被阻滯，當(dāng)IS-IBMX-DEX誘導(dǎo)混合物被重新誘導(dǎo)入細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)3T3-L1前脂肪細(xì)胞保留重新進(jìn)入分化過(guò)程的能力。(數(shù)據(jù)未顯示)。很有趣發(fā)現(xiàn)BE在脂肪細(xì)胞表現(xiàn)出胰島素樣葡萄糖攝取誘導(dǎo)活性但在前脂肪細(xì)胞不表現(xiàn)出胰島素樣分化誘導(dǎo)活性。用來(lái)解釋這種不同的事實(shí)是這兩種活性來(lái)自?xún)煞N不同的信號(hào)通路，在脂肪細(xì)胞中胰島素受體與葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程有關(guān)，而胰島素受體的同族體-胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體，被胰島素在前脂肪細(xì)胞用來(lái)誘導(dǎo)分化。(Cowherd，R.M.等，(1999)Cell Dev.Biol.103-10；Tang，Q-Q和Lane，M.D.(1999).GenesDev.132231-2241；Lane，M.D.等，(1999)Biochem.Biophy.Res.Comm.266677-683)。
為了調(diào)查BE如何抑制由IN-IBMX-DEX誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞分化，兩種重要的分化標(biāo)記，PPARγ2和GLUT4，被用來(lái)監(jiān)控前脂肪細(xì)胞的分化過(guò)程，該過(guò)程或是被IBMX-DEX誘導(dǎo)或是被IS-IBMX-DEX誘導(dǎo)，在有BE或沒(méi)有BE的情況下。Northern印跡分析顯示BE抑制由IBMX-DEX誘導(dǎo)或由IS-IBMX-DEX誘導(dǎo)的PPARγ2的mRNA表達(dá)(圖7a)。而且，Western印跡分析顯示，GLUT4的蛋白質(zhì)生產(chǎn)(約65Kda)在有BE的情況下，IS-IBMX-DEX誘導(dǎo)的細(xì)胞中比沒(méi)有BE的情況下，IS-IBMX-DEX誘導(dǎo)的細(xì)胞有很大的抑制(圖7B)。由于BE攝取葡萄糖誘導(dǎo)活性是在完全分化的脂肪細(xì)胞中檢測(cè)的(圖1-3)，但是BE的GLUT4抑制影響是在未分化細(xì)胞中觀察的(圖7B)，上述結(jié)果與用葡萄糖攝取分析的我們的其他分化抑制結(jié)果相一致(圖4&6)，與其他葡萄糖攝取分析的結(jié)果不一致(圖1-3)。GLUT4表達(dá)在本研究中被用作一個(gè)分化的指標(biāo)，監(jiān)控BE在前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化而不是在脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的能力。所有這些結(jié)果提示由BE施行的分化抑制的特定目標(biāo)是PPARγ2或直接或間接調(diào)控PPARγ2表達(dá)的因子。有必要進(jìn)一步進(jìn)行實(shí)驗(yàn)來(lái)確定抑制的作用部位?，F(xiàn)在43kDa蛋白質(zhì)的特性和功能尚不清楚。Western印跡中出現(xiàn)的該蛋白質(zhì)條帶可能是由于特別的蛋白質(zhì)抗體，和可能用于本研究的細(xì)胞。
抗糖尿病藥物如胰島素或噻唑烷二酮類(lèi)(TZD)都上調(diào)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)和脂肪細(xì)胞的脂質(zhì)生物合成(Stevenson，R.W.等，(1996).Diabetes 4560-66；Park，K.S.等，(1998)J.Clinical Endocrinol.Metab.831636-1643；)。體重增加是胰島素治療II型糖尿病的常見(jiàn)副作用。(Laville，M.和Andreeli，F(xiàn).(2000).DiabetesMetab.26(增補(bǔ)本3)42-5)。因此，更需要有降糖活性而沒(méi)有脂肪生成活性的藥物。BE的有效成分看起來(lái)有這樣的優(yōu)勢(shì)。
實(shí)施例2巴拿巴的甲醇提取物和水提取物的特征巴拿巴葉在37℃用500ml乙烷提取2次，用500ml甲醇提取2次(MeOH提取物)，隨后用500ml水提取2次(H2O提取物)。24孔板中的脂肪細(xì)胞與MeOH提取物或H2O提取物培養(yǎng)15分鐘，或用胰島素和巴拿巴熱水提取物(BE)作為陽(yáng)性對(duì)照，或不用處理作為陰性對(duì)照。處理后，分析細(xì)胞的2-脫氧-D-[3H]葡萄糖攝取。如圖7所示，巴拿巴H2O提取物刺激3T3-L1脂肪細(xì)胞攝取葡萄糖，但MeOH提取物不能刺激3T3-L1脂肪細(xì)胞攝取葡萄糖。
未分化3T3-L1前脂肪細(xì)胞與胰島素，巴拿巴熱水提取物(BE)，或者是不同濃度的巴拿巴H2O提取物及地塞米松(DEX)和3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)一起培養(yǎng)。在10天處理后，通過(guò)細(xì)胞葡萄糖攝取活性來(lái)分析脂肪細(xì)胞分化程度。如圖8所示，巴拿巴H2O提取物抑制由胰島素和IBMX和DEX誘導(dǎo)的3T3-L1細(xì)胞的脂肪細(xì)胞分化。
24孔板上的已分化的3T3-L1細(xì)胞與不同濃度的巴拿巴H2O提取物培養(yǎng)15分鐘，隨后分析2-脫氧-D-[3H]葡萄糖攝取。如圖9所示，巴拿巴H2O提取物葡萄糖攝取活性的濃度依賴(lài)曲線與胰島素和巴拿巴熱水提取物(BE)的十分相似。
這些結(jié)果顯示葡萄糖攝取刺激活性(圖7)和脂肪細(xì)胞分化抑制活性(圖8)都存在于巴拿巴水提取物而不存在于巴拿巴甲醇提取物。三萜系化合物corosolic acid是疏水的，估計(jì)在巴拿巴甲醇提取物中，提示corosolic acid不是巴拿巴水提取物中活性因子中的一種。
鑒別巴拿巴甲醇提取物和巴拿巴H2O提取物中化合物的薄層色譜法在5-10％的MeOH-CHCl3溶劑中的二氧化硅膠上進(jìn)行，通過(guò)噴灑在65％硫酸或FeCl3乙醇溶液中的硫酸鈰飽和溶液進(jìn)行檢測(cè)。純熊果酸被用作三萜系化合物的對(duì)照，商品化的鞣質(zhì)酸混合物被用作鞣質(zhì)酸的對(duì)照。該結(jié)果顯示三萜系化合物在巴拿巴甲醇提取物中，不在巴拿巴水提取物中。該結(jié)果還顯示巴拿巴水提取物中含有鞣質(zhì)酸。
巴拿巴甲醇提取物和巴拿巴水提取物也被Q-TOF電子噴霧質(zhì)譜分析。該結(jié)果確認(rèn)巴拿巴甲醇提取物包含corosolic acid。但是，巴拿巴茶甲醇提取物不顯示葡萄糖攝取活性，說(shuō)明corosolic acid不是有效組分。
巴拿巴茶熱水提取物(BE)也同BSA和明膠反應(yīng)，BSA和明膠是已知的沉淀鞣質(zhì)酸的制劑。在BSA和明膠沉淀BE后所保持的提取物中未觀察到葡萄糖攝取刺激活性。這些結(jié)果共同提示BE中的一種或多種活性成分是鞣質(zhì)酸。
實(shí)施例3用BE處理正常小鼠年齡3個(gè)月的正常小鼠，平均重量24克，被用于評(píng)估BE對(duì)體內(nèi)葡萄糖攝取的影響。在用BE處理前，小鼠用常規(guī)飲食和水喂養(yǎng)。在時(shí)間0，小鼠被喂以葡萄糖溶液或葡萄糖與巴拿巴提取物(BE)的溶液。喂給小鼠的葡萄糖溶液或葡萄糖加BE的溶液的總體積是100μL。處理后不同的時(shí)期，從尾靜脈中收集血液。總共6μL血液被用于血糖測(cè)定。Johnson & Johnson公司的One Touch Basic完全糖尿病監(jiān)測(cè)系統(tǒng)被用來(lái)測(cè)量血液葡萄糖水平。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組是隨機(jī)抽取，4個(gè)小鼠為1組。該實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)用Microsoft Excel程序制作。如圖15所示，正常小鼠喂以50mg葡萄糖和BE的血液葡萄糖水平的峰值比單用葡萄糖不用BE的小鼠的血液葡萄糖水平的峰值低。
實(shí)施例4部分提純的巴拿巴提取物的制備巴拿巴茶葉的熱水提取物的置制備按照上述實(shí)施例1所述的進(jìn)行。所述提取物使用HPLC方法進(jìn)一步純化為活性組分的方法如下。第一次HPLC分離的條件如下HPLC系統(tǒng)是Beckman System Gold，包含一個(gè)125溶劑艙，一個(gè)168PDA檢測(cè)器和一個(gè)508自動(dòng)取樣器。使用Beckman Ultrasphere C-18反相柱(4.6mm×250mmI.D.，5m)。檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)定為210nm、300nm和370nm。洗脫液A是水和0.1％三氟乙酸的混合物，洗脫液B是乙腈和0.1％三氟乙酸的混合物。按照下列線性梯度從A到B在60分鐘和在流速為1ml/min進(jìn)行分離等度洗脫A5分鐘，10分鐘內(nèi)從100∶0到90∶10，等度洗脫10分鐘，10分鐘內(nèi)從90∶10到80∶20，等度洗脫10分鐘，5分鐘內(nèi)從80∶20到50∶50，等度洗脫10分鐘。
通過(guò)HPLC運(yùn)行方法1產(chǎn)生的各組分的圖譜見(jiàn)圖17。HPLC 1-6組分是從提取物中分離并檢測(cè)葡萄糖攝取刺激活性。在12孔中的脂肪細(xì)胞與0.1g/L的1-6組分培養(yǎng)，或用胰島素和巴拿巴熱水提取物(BE)作為陽(yáng)性對(duì)照，或不用處理作為陰性對(duì)照。分析細(xì)胞的2-脫氧-D-[3H]葡萄糖攝取。如圖18所示，HPLC的2和3組分(F2和F3)包含明顯的生物活性。
用于巴拿巴熱水提取物的HPLC運(yùn)行條件從HPLC運(yùn)行方法1轉(zhuǎn)為HPLC運(yùn)行方法2，所以運(yùn)行HPLC運(yùn)行方法1得到的F2和F3組分可以被進(jìn)一步分離成圖19所示的亞組分。F2組分，如圖17所示，可以被進(jìn)一步分離成亞組分(SF)SF1和SF2，而F3組分可以被進(jìn)一步分離成亞組分SF3。
HPLC系統(tǒng)是Beckman System Gold，包含一個(gè)125溶劑艙，一個(gè)168PDA檢測(cè)器和一個(gè)508自動(dòng)取樣器。使用Beckman Ultrasphere C-18反相柱(4.6mm×250mmI.D.，5μm)。檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)定為210nm、300nm和370nm。洗脫液A是水和0.1％三氟乙酸的混合物，洗脫液B是乙腈和0.1％三氟乙酸的混合物。按照下列線性梯度從A到B在115分鐘和在流速為1ml/min進(jìn)行分離等度洗脫A10分鐘，15分鐘內(nèi)從100∶0到95∶5，等度洗脫15分鐘，7分鐘內(nèi)從95∶5到92.5∶7.5，等度洗脫10分鐘，8分鐘內(nèi)從92.5∶7.5到90∶10，等度洗脫10分鐘，10分鐘內(nèi)從90∶10到80∶20，等度洗脫20分鐘，5分鐘內(nèi)從80∶20到50∶50，隨后等度洗脫5分鐘。
使用HPLC運(yùn)行方法2得到的亞組分SF1，SF2和SF3被分離和分析它們攝取葡萄糖刺激活性。在12孔中的脂肪細(xì)胞與1g/L的HPLC SF1，SF2和SF3組分培養(yǎng)15分鐘，或用胰島素和巴拿巴熱水提取物(BE)作為陽(yáng)性對(duì)照，或不用處理作為陰性對(duì)照。隨后分析2-脫氧-D-[3H]葡萄糖攝取。如圖20所示，使用HPLC運(yùn)行方法2得到的所有三個(gè)亞組分是有活性的，亞組分SF2和SF3最有活性。
用于巴拿巴熱水提取物的HPLC運(yùn)行條件轉(zhuǎn)為下文描述的HPLC運(yùn)行方法3，所以亞組分SF1，SF2和SF3可以被分離成亞組分，如圖21所示。
HPLC系統(tǒng)是Beckman System Gold，包含一個(gè)125溶劑艙，一個(gè)168PDA檢測(cè)器和一個(gè)508自動(dòng)取樣器。使用Beckman Ultrasphere C-18反相柱(10.0mm×250mmI.D.，5μm)。檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)定為210nm，300nm和370nm。洗脫液A是水和0.1％三氟乙酸的混合物，洗脫液B是乙腈和0.1％三氟乙酸的混合物。使用ISCO的小Foxy組分收集器在時(shí)間窗內(nèi)收集單個(gè)峰。按照下列線性梯度從A到B在250分鐘和在流速為2ml/min進(jìn)行分離等度洗脫A25分鐘，30分鐘內(nèi)從100∶0到95∶5，等度洗脫25分鐘，2分鐘內(nèi)從95∶5到91.8∶8.2，等度洗脫18分鐘，35分鐘內(nèi)從91.8∶8.2到90∶10，等度洗脫20分鐘，15分鐘內(nèi)從90∶10到88.5∶11.5，3分鐘內(nèi)從88.5∶11.5到85∶15，等度洗脫27分鐘，15分鐘內(nèi)從85∶15到80∶20，等度洗脫15分鐘，10分鐘內(nèi)從80∶20到50∶50隨后等度洗脫10分鐘。
在圖20所示的26個(gè)亞-亞組分中，9個(gè)被收集到足夠的量進(jìn)行生物學(xué)分析。在12孔中的脂肪細(xì)胞與1g/L的分離的HPLC亞-亞組分培養(yǎng)15分鐘，或用胰島素和巴拿巴熱水提取物(BE)作為陽(yáng)性對(duì)照，或不用處理作為陰性對(duì)照。隨后分析2-脫氧-D-[3H]葡萄糖攝取。如圖21所示，所有9個(gè)亞-亞組分(即亞組分8、9、12、13、14、15、16、18和19)是有活性的，亞-亞組分SSF15、SSF16和SSF19比其他亞-亞組分活性更強(qiáng)，亞-亞組分SSF16比其他亞-亞組分的活性明顯更強(qiáng)。因此，使用HPLC運(yùn)行方法3得到的亞-亞組分SSF16是在3T3-L1細(xì)胞中刺激葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)活性最有效的化合物。
使用Q-TOF電子噴霧質(zhì)譜分析經(jīng)過(guò)HPLC運(yùn)行方法3得到的各個(gè)亞-亞組分。該結(jié)果顯示活性最強(qiáng)的亞-亞組分的分子量是939克/摩爾和935克/摩爾。這些分子量與五-O-沒(méi)食子酰-D-葡萄糖的分子量相當(dāng)，五-O-沒(méi)食子酰-D-葡萄糖的計(jì)算分子量是940克/摩爾，與鞣花丹寧casuarictin的分子量相當(dāng)，鞣花丹寧casuarictin計(jì)算分子量是936克/摩爾。
權(quán)利要求
1.一種治療高血糖癥個(gè)體的部分提純的植物提取物；其特征在于，其中所述部分提純的植物提取物包含可水解的丹寧酸；其中所述提取物包含許多分子量在800-1500克/摩爾之間的水溶性化合物；以及其中所述提取物幾乎不含三萜系化合物。
2.如權(quán)利要求1所述的部分提純的植物提取物，其特征在于，所述提取物包含1，2，3，4，6-五-O-沒(méi)食子酰-D-葡萄糖。
3.如權(quán)利要求2所述的部分提純的植物提取物，其特征在于，所述提取物是部分提純的巴拿巴提取物。
4.如權(quán)利要求3所述的部分提純的植物提取物，其特征在于，所述提取物是部分提純的巴拿巴水提取物。
5.如權(quán)利要求3所述的部分提純的植物提取物，其特征在于，所述提取物還包含分子量為936克/摩爾的化合物。
6.一種制備用于治療高血糖癥個(gè)體的部分提純的巴拿巴提取物的方法，其特征在于，所述方法包括制備巴拿巴水提取物；將該水提取物分成許多組分；從所述許多組分中分離一種或多種活性組分以提供所述部分提純的巴拿巴提取物；其中所述一種或多種活性組分包含許多分子量在800-1500克/摩爾之間的化合物；其中所述一種或多種活性組分幾乎不含三萜系化合物；以及其中所述一種或多種活性組分刺激脂肪細(xì)胞攝取葡萄糖。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述水取物是巴拿巴葉的水提取物。
8.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述部分提純的巴拿巴提取物包含1，2，3，4，6-五-O-沒(méi)食子酰-D-葡萄糖。
9.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述巴拿巴水提取物用HPLC分成許多組分。
10.一種治療高血糖癥個(gè)體的部分提純的提取物，其特征在于，所述提取物通過(guò)權(quán)利要求6所述的方法制備。
11.一種用于治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物個(gè)體糖尿病的方法，其特征在于，所述方法包括給予有此需要的個(gè)體治療有效量的如權(quán)利要求1所述的部分提純的植物提取物。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述部分提純的植物提取物是部分提純的巴拿巴的水提取物。
13.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述部分提純的植物提取物包含1，2，3，4，6-五-O-沒(méi)食子酰-D-葡萄糖。
14.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述部分提純的植物提取物通過(guò)口服或注射給予所述個(gè)體。
15.一種降低有此需要的個(gè)體的升高的血液葡萄糖水平的方法，其特征在于，所述方法包括給予個(gè)體權(quán)利要求1所述的部分提純的植物提取物。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述部分提純的植物提取物是部分提純的巴拿巴的水提取物。
17.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述部分提純的植物提取物包含1，2，3，4，6-五-O-沒(méi)食子酰-D-葡萄糖。
18.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述部分提純的植物提取物通過(guò)口服或注射給予個(gè)體。
19.一種治療患有肥胖、II型糖尿病、葡萄糖不耐癥或高血糖癥中一種或多種的個(gè)體的方法，其特征在于，所述方法包括給予個(gè)體權(quán)利要求1所述的部分提純的植物提取物。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述部分提純的植物提取物是巴拿巴的提取物。
21.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述部分提純的植物提取物包含1，2，3，4，6-五-O-沒(méi)食子酰-D-葡萄糖。
22.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述部分提純的植物提取物通過(guò)口服或注射給予個(gè)體。
23.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述部分提純的植物提取物抑制前脂肪細(xì)胞向脂肪細(xì)胞的分化。
全文摘要
本發(fā)明提供了治療高血糖癥個(gè)體的一種部分提純的植物提取物。所述部分提純的植物提取物包含許多分子量在800－1500克/摩爾之間的水溶性化合物。所述部分提純的植物提取物中的一種化合物是已知為五－O－沒(méi)食子酰－D－葡萄糖的可水解的丹寧酸。所述部分提純的植物提取物幾乎不含三萜系化合物，包括corosolicacid和高分子量的鞣花丹寧，即分子量超過(guò)1500克/摩爾的鞣花丹寧。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述部分提純的植物提取物來(lái)自熱帶植物大葉紫薇(Lagerstroemia Speciasa.L)，該植物也被稱(chēng)為巴拿巴。本發(fā)明還涉及使用所述部分提純的植物提取物治療高血糖癥個(gè)體的方法。
文檔編號(hào)A61P3/10GK1578669SQ02821775
公開(kāi)日2005年2月9日 申請(qǐng)日期2002年9月3日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月31日
發(fā)明者X·陳, F·劉, Y·李, J·李 申請(qǐng)人:俄亥俄州立大學(xué)