專利名稱：生物降解性微囊型超聲造影劑及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微囊型超聲造影劑。
本發(fā)明還涉及一種上述造影劑的制備方法。
采用超聲造影劑來(lái)增大血流圖像亮度、以更好地區(qū)分生理結(jié)構(gòu)的作用早已在臨床得到了證實(shí)，其中尤以正在突起的非線性超聲診斷方法與造影劑的關(guān)系更為密切。氣泡型造影劑對(duì)超聲信號(hào)的回波中，不僅含有與探頭發(fā)射相同的基頻信號(hào)，而且有其諧波信號(hào)，其中尤以二次諧頻最強(qiáng)。因此當(dāng)采用寬頻帶探頭、且在接收機(jī)中心頻率為發(fā)射頻率兩倍時(shí)，即可獲得二次諧頻的聲像圖。采用諧頻信號(hào)的好處是(1)由于軟組織不產(chǎn)生諧頻信號(hào)，當(dāng)使用造影劑時(shí)就可以增大血流與周圍組織間的對(duì)比度；(2)用造影劑可以削弱由于周圍組織運(yùn)動(dòng)而造成的噪音干擾，從而確保能在能量多普勒和常規(guī)多普勒兩種成像方式中檢出慢速血流。在采用造影劑后，具有超卓靈敏度的能量多普勒成像法，還可以顯現(xiàn)出人體深部器官的微血管血流狀態(tài)。
回波型造影劑是造影劑中最為重要的一種，其主要基本原理是利用造影劑的微泡結(jié)構(gòu)在超聲下產(chǎn)生諧波，從而達(dá)到增強(qiáng)諧波強(qiáng)度的目的。可應(yīng)用于心血管及肝臟系統(tǒng)的超聲診斷，有時(shí)也用于子宮、輸卵管、腮腺等部位的診斷。
理想的回波型超聲造影劑的基本要求是(1)為滿足探查過(guò)程的需要，應(yīng)含有或在進(jìn)入人體后能夠產(chǎn)生有足夠存留時(shí)間和回波強(qiáng)度的微氣泡。
(2)對(duì)人體組織器官不產(chǎn)生異常血流動(dòng)力學(xué)效應(yīng)、血管栓塞或毒副作用。最理想的造影劑是由可被人體吸收且有益于健康的材料制成。
(3)經(jīng)靜脈注射能通過(guò)肺微血管循環(huán)，進(jìn)人全身動(dòng)脈系統(tǒng)，不造成肺栓塞。
目前臨床采用的回波造影劑主要有以下幾類(1)雙氧水即過(guò)氧化氫。在進(jìn)入人體后，可在過(guò)氧化氫酶作用下分解成水與氧氣微泡，使微泡進(jìn)入?yún)^(qū)與不可進(jìn)入?yún)^(qū)的聲像圖呈現(xiàn)鮮明的對(duì)比。已用于肝臟、子宮、輸卵管、直腸、腮腺與口腔部位的超聲診斷。
(2)二氧化碳微泡注入人體后，可使肝實(shí)質(zhì)回聲增強(qiáng)，而腫瘤回聲依舊，用以識(shí)別腫瘤病灶。
(3)Echovist和Levovist德國(guó)Schering公司生產(chǎn)，由半乳糖結(jié)晶粉末和20％半乳糖稀釋劑構(gòu)成，其造影的基礎(chǔ)是半乳糖分子中夾入的微氣泡，直徑在2～8μm之間，小于超聲診斷常用頻段的波長(zhǎng)。在血管造影中，由于泡內(nèi)氣體與周圍血液聲阻抗的巨大差異，使微氣泡成為強(qiáng)散射體，在共振狀態(tài)下其效應(yīng)更強(qiáng)，因而獲得大大增強(qiáng)的多普勒回波信息。
(4)Echo Gen美國(guó)Souns醫(yī)藥公司生產(chǎn)，室溫下為液體，體溫時(shí)為氣體。不僅能增強(qiáng)多普勒?qǐng)D像的顏色，而且能增大多普勒信號(hào)的幅度，因此可以在缺血時(shí)看到血流灌注和缺血區(qū)，并可增強(qiáng)灰階。
(5)Albunex美國(guó)分子生物系統(tǒng)公司(Molecular Biosystems In.)生產(chǎn)，已于1994年被FDA批準(zhǔn)用于臨床，系白蛋白與氣體微泡的結(jié)合物。注入外周靜脈，且進(jìn)入心臟后可增強(qiáng)多普勒信號(hào)。
(6)高分子微泡以聚氰基丙烯酸丁酯、聚丙烯酰胺、天然蛋白、明膠、多糖等為包裹材料的氣體粒子；但是有的因材料太硬、需要在較高的發(fā)射頻率時(shí)才能獲得理想的散射強(qiáng)度。有的可以持續(xù)顯影一定時(shí)間，但粒徑太大，經(jīng)靜脈注射后將會(huì)造成毛細(xì)血管阻塞。有的材料在體內(nèi)難以降解或降解很慢、將會(huì)長(zhǎng)期滯留在體內(nèi)。
以上這些超聲造影劑雖然各具特點(diǎn)，但它們存在的共同缺點(diǎn)是形成氣泡的存留時(shí)間短、諧波增強(qiáng)倍數(shù)小，因此在臨床診斷時(shí)常需多次使用顯影劑并使用較多量的顯影劑，不僅給臨床應(yīng)用造成了麻煩，而且增加了診斷的費(fèi)用。因此至今還沒(méi)有滿意的超聲造影劑可供臨床應(yīng)用，研究新的功效更好、存活期更長(zhǎng)的超聲造影劑成為超聲造影研究的熱點(diǎn)。
本發(fā)明的目的還在于提供上述生物降解性微囊型超聲造影劑的制備方法。
由本發(fā)明所制備的生物降解性微囊型超聲造影劑可通過(guò)注射、靜脈灌注的途徑送入人體被測(cè)定的部位，能借助物理原理改變?cè)摬课坏某晜鞑ヌ匦?，使之產(chǎn)生特征的超聲圖像，從而增大病變組織與正常組織之間、運(yùn)動(dòng)部分與靜止部分之間對(duì)比度，起到超聲造影的效果。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的微囊型超聲造影劑為生物可降解性脂肪族聚內(nèi)酯中空微囊，其粒徑為1～10微米、壁厚為50～6000納米其主要制備步驟為(1)按水/油/水乳液-溶劑蒸發(fā)技術(shù)，將生物降解性脂肪族聚內(nèi)酯類生物降解高分子(分子量為5000～500000，以5000～80000為更佳)溶解于二氯甲烷、三氯甲烷或二氯乙烷等油性有機(jī)溶劑中，制成濃度為5～200毫克/毫升(以20～100毫克/毫升為更佳)的溶液，稱溶液A。
所述的水/油/水乳液-溶劑蒸發(fā)技術(shù)已由中國(guó)發(fā)明專利ZL981005772和ZL98101117.9公開報(bào)道。
所述的生物降解性脂肪族聚內(nèi)酯為聚丙交酯(PLA)、聚己內(nèi)酯(PCL)；或內(nèi)酯間的二元或三元無(wú)規(guī)或嵌段共聚物如聚(丙交酯-乙交酯)共聚物(PLGA)、聚(丙交酯-己內(nèi)酯)共聚物(PLC)、聚(乙交酯-己內(nèi)酯)共聚物(PGC)或聚(乙交酯-丙交酯-己內(nèi)酯)共聚物(PGLC)；或內(nèi)酯與聚醚間的二元或三元無(wú)規(guī)或嵌段共聚物如聚(丙交酯-聚乙二醇醚)共聚物(PLE)、聚(己內(nèi)酯-聚乙二醇醚)共聚物(PCE)、聚(丙交酯-乙交酯-聚乙二醇醚)共聚物(PLGE)、聚(丙交酯-己內(nèi)酯-聚乙二醇醚)共聚物(PCLE)或聚(乙交酯-己內(nèi)酯-聚乙二醇醚)共聚物(PGCE)。
(2)按0.5～10ml水加入1～4滴乳化劑的比例，混合均勻，成溶液B。所述的乳化劑為司班80、司班60、吐溫60或吐溫80等小分子表面活性物質(zhì)。
(3)將溶液B注入溶液A，兩種溶液的體積比為溶液A∶溶液B＝40∶1～2∶1(以20∶1～5∶1為更佳)。然后超聲乳化30～120秒(以45～90秒為更佳)，制得油包水乳液。
(4)將該油包水乳液按體積比為1∶5～1∶50(以1∶10～1∶20為更佳)，加入濃度為0.5～10％(以1～5％為更佳)的穩(wěn)定劑水溶液中攪拌，攪拌速度2000～20000轉(zhuǎn)/分(以10000～15000轉(zhuǎn)/分為更佳)，攪拌時(shí)間0.5～5分鐘(以1～3分鐘為更佳)，制得水包油包水乳液。所述的穩(wěn)定劑為明膠、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮等天然或合成的高分子物質(zhì)。
(5)將水包油包水乳液持續(xù)攪拌2～10小時(shí)(以3～6小時(shí)為更佳)，攪拌速度為500～2000轉(zhuǎn)/分(以1000～1500轉(zhuǎn)/分為更佳)，采用離心分離方法分離出微囊粒子，再用蒸餾水進(jìn)行洗滌，洗滌次數(shù)為1～5次(以2～4次為更佳)。將得到的微粒體進(jìn)行冷凍干燥，得到本發(fā)明的最終目的產(chǎn)物-粉末狀的生物降解性微囊型超聲顯影劑。
(6)本發(fā)明中的所有操作均在0～37℃(以4～20℃為更佳)溫度條件下進(jìn)行。
本發(fā)明所制備的生物降解性微囊型超聲造影劑為中空結(jié)構(gòu)，隨制備條件的變化，粒徑可在1～10微米之間調(diào)節(jié)，微粒體壁厚可在50～6000納米間調(diào)節(jié)。
聚內(nèi)酯類生物降解高分子是一類具有生物可降解性、降解速率可以調(diào)節(jié)，且降解產(chǎn)物對(duì)機(jī)體沒(méi)有副作用、最終可在體內(nèi)被代謝或吸收，已經(jīng)成為一類重要的生物降解性醫(yī)用材料在臨床得到了廣泛的應(yīng)用。鑒于聚內(nèi)酯材料可以通過(guò)(水/油/水)乳液-溶劑蒸發(fā)技術(shù)而制備成微囊，且此微囊為中空結(jié)構(gòu)(Diabetes，Obesity and metabolism，2000，2243-250)，而微囊的大小及其囊壁的厚度又可以通過(guò)調(diào)節(jié)微囊的制備條件予以調(diào)節(jié)和控制，因此聚內(nèi)酯類生物降解高分子微囊作為超聲顯影劑具有很重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。
本發(fā)明具有的特點(diǎn)一是采用生物降解性微囊型超聲造影劑，以克服已有超聲造影劑所存在的存留時(shí)間短、諧波增強(qiáng)倍數(shù)小、粒徑太大造成毛細(xì)血管阻塞，以及在體內(nèi)難以降解或降解太慢等的缺陷，從而提供了一種新型超聲顯影劑。
二是采用具有一定彈性、降解速率可以調(diào)節(jié)控制的生物可降解性脂肪族聚內(nèi)酯為微囊型超聲造影劑材料。三是采用(水/油/水)乳液-溶劑蒸發(fā)技術(shù)制得的微囊型超聲顯影劑其大小和囊壁厚度可以調(diào)節(jié)控制。
四是利用中空的微囊和囊壁材料的彈性產(chǎn)生諧波，達(dá)到增強(qiáng)諧波強(qiáng)度的目的。
五是微囊型超聲造影劑的粒徑大小在2～8μm范圍，可以通過(guò)肺濾而不形成栓塞。
由本發(fā)明所制備的生物降解性微囊型超聲造影劑的超聲造影強(qiáng)度可通過(guò)改變制備微囊的高分子材料種類、高分子的分子量、微囊的粒徑和微囊的囊壁厚度四種途徑來(lái)調(diào)節(jié)。
實(shí)施例115℃下，5mg蒸餾水和200mg分子量為10,000的聚丙交酯(PLA)的二氯甲烷溶液在司班80存在下超聲乳化1分鐘，形成油包水乳液，在15,000轉(zhuǎn)/分?jǐn)嚢杷俣认?，在吐?0存在下注入100ml 1％的明膠溶液，乳化1分鐘。所得水包油包水乳液。在1000轉(zhuǎn)/分?jǐn)嚢?小時(shí)，得到的微囊用離心分離。用蒸餾水清洗四次，最后分散在水中，冷凍干燥，得到粒徑為2～8微米、囊壁厚度為100納米的微囊型聚丙交酯超聲造影劑。
以狗為模擬動(dòng)物、采用靜脈滴注方法進(jìn)行體內(nèi)的超聲顯影效果的測(cè)定，結(jié)果表明PLA微囊比市售的超聲顯影劑NF FC及Levovist有更為明顯的顯影效果，說(shuō)明PLA微囊具有最為優(yōu)良的體內(nèi)超聲顯影效果。
將此PLA微囊配成一定的濃度的懸濁液后經(jīng)大鼠股靜脈注入大鼠體內(nèi)，在進(jìn)行大鼠腸系膜的毛細(xì)血管微循環(huán)后，分別進(jìn)行大鼠的心、腎、肝臟、肺、腦石蠟切片，觀察結(jié)果表明在各組織中，均無(wú)栓塞現(xiàn)象發(fā)生。說(shuō)明PLA微囊可以通過(guò)肺濾、不會(huì)在血液循環(huán)時(shí)產(chǎn)生栓塞的危險(xiǎn)。
實(shí)施例220℃下，5mg蒸餾水和200mg分子量為10,000的聚(丙交酯-乙交酯)共聚物(PLGA)的二氯甲烷溶液在司班60存在下超聲乳化1分鐘，形成油包水乳液。在15,000轉(zhuǎn)/分?jǐn)嚢杷俣认?，在吐?0存在下注入100ml 1％的明膠溶液，乳化1分鐘。加入300ml蒸餾水(二氯甲烷飽和)，攪拌30分鐘，得到的微囊用離心分離。用蒸餾水清洗三次，最后分散在水中，冷凍干燥，得到粒徑為6～12微米、囊壁厚度為100納米的微囊型聚(丙交酯-乙交酯)共聚物超聲造影劑。
微囊型聚(丙交酯-乙交酯)共聚物超聲造影劑的超聲顯影效果與實(shí)施例318℃下，3mg蒸餾水和200mg分子量為150,000的聚(丙交酯-己內(nèi)酯)共聚物(PLC)的二氯甲烷溶液在司班60存在下超聲乳化90秒形成油包水乳液。在5000轉(zhuǎn)/分?jǐn)嚢杷俣认伦⑷?00ml 5％的聚乙烯醇溶液，乳化5分鐘。所得水包油包水乳液在1000轉(zhuǎn)/分?jǐn)嚢?小時(shí)，得到的微包囊用離心分離。用蒸餾水清洗三次，分散在水中，冷凍干燥，得到粒徑為6～12微米、囊壁厚度為100納米的微囊型聚(丙交酯-己內(nèi)酯)共聚物超聲造影劑。
微囊型聚(丙交酯-己內(nèi)酯)共聚物超聲造影劑的超聲顯影效果比實(shí)施例420℃下，10mg蒸餾水和200mg分子量為20,000的聚(乙交酯-丙交酯-己內(nèi)酯)共聚物(PGLC)的二氯甲烷溶液在司班80存在下超聲乳化45秒， 在吐溫60存在下注入100ml 5％的聚乙烯醇溶液，乳化5分鐘。所得水包油包水乳液在1000轉(zhuǎn)/分?jǐn)嚢?小時(shí)，得到的微囊用離心分離。用蒸餾水清洗四次，最后分散在水中，冷凍干燥，得到得到粒徑為6～12微米、囊壁厚度為100納米的聚(乙交酯-丙交酯-己內(nèi)酯)共聚物(PGLC)微囊型超聲造影劑。
微囊型聚(乙交酯-丙交酯-己內(nèi)酯)共聚物(PGLC)超聲造影劑的超聲顯影效果比實(shí)施例1更好。
表1 不同微囊型超聲造影劑的制備

實(shí)施例9按實(shí)施例1～8方法制備的微囊型超聲造影劑的掃描電鏡觀察表明，得到的微囊粒徑分布均勻，其內(nèi)部為中空結(jié)構(gòu)。
對(duì)照例115℃下，5mg蒸餾水和200mg聚丙交酯(PLA)(分子量為10,000)的二氯甲烷溶液在司班80存在下超聲乳化1分鐘形成油包水乳液，在20,000轉(zhuǎn)/分的攪拌速度下，注入5％的聚乙烯醇溶液100ml，乳化1分鐘。所得水包油包水乳液在2000轉(zhuǎn)/分?jǐn)嚢?小時(shí)，得到的微包囊用離心法收集后，再用蒸餾水清洗四次，最后分散在水中，冷凍干燥，得到粒徑為0.1～2微米、囊壁厚度為100納米的微囊。
以狗為模擬動(dòng)物，采用靜脈滴注方法進(jìn)行的體內(nèi)超聲顯影效果測(cè)定表明由此條件制備的微囊在動(dòng)物的左右心室都沒(méi)有顯影效果。
對(duì)照例2同對(duì)照例1條件形成油包水乳液后，在2000轉(zhuǎn)/分的攪拌速度下，注入5％的聚乙烯醇溶液100ml，乳化1分鐘。所得水包油包水乳液在500轉(zhuǎn)/分下攪拌5小時(shí)，得到的微包囊用離心法收集后再用蒸餾水清洗四次，最后分散在水中，冷凍干燥，得到粒徑為20～30微米、囊壁厚度為2000納米的微囊。
以狗為模擬動(dòng)物，采用靜脈滴注方法進(jìn)行體內(nèi)的超聲顯影效果的測(cè)定，結(jié)果表明在由此條件下制備的微囊在動(dòng)物的右心室有顯影效果，而在左心室卻沒(méi)有顯影效果，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，被實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物體出現(xiàn)了呼吸局促，心率失常，心跳明顯加快等現(xiàn)象。表明該條件下制備的微囊無(wú)法通過(guò)肺濾，產(chǎn)生了栓塞現(xiàn)象。
對(duì)照例3同對(duì)照例1方法但采用分子量為60,000的聚丙交酯(PLA)制備微囊得到粒徑為6～10微米、壁厚為3000納米的微囊。
以狗為模擬動(dòng)物，采用靜脈滴注方法進(jìn)行體內(nèi)的超聲顯影測(cè)定結(jié)果表明在由此條件制備的微囊在動(dòng)物的左右心室都沒(méi)有顯影效果。
權(quán)利要求
1.一種生物降解性微囊型超聲造影劑，為生物可降解性脂肪族聚內(nèi)酯中空微囊，其粒徑為1～10微米、壁厚為50～6000納米。
2.一種制備權(quán)利要求1所述的微囊型超聲造影劑的方法，其主要步驟為a)按水/油/水乳液-溶劑蒸發(fā)技術(shù)，將分子量為5000～500000的生物降解性脂肪族聚內(nèi)酯溶解于油性有機(jī)溶劑中，制成濃度為5～200毫克/毫升的溶液A；b)按0.5～10ml水加入1～4滴乳化劑的比例混合均勻成溶液B；c)按體積比為溶液A∶溶液B＝40∶1～2∶1的比例將溶液B注入溶液A，超聲乳化30～120秒，制得油包水乳液；d)將步驟c制得的乳液按體積比為1∶5～1∶50比例加入濃度為0.5～10％的穩(wěn)定劑水溶液中攪拌，攪拌速度2000～20000轉(zhuǎn)/分，攪拌時(shí)間0.5～5分鐘，制得水包油包水乳液；e)將步驟d制得的乳液持續(xù)攪拌2～10小時(shí)，攪拌速度為500～2000轉(zhuǎn)/分，分離出微囊粒子，用蒸餾水洗滌1～5次，將微粒體冷凍干燥，得到粉末狀的生物降解性微囊型超聲顯影劑；上述各步驟均在0～37℃下進(jìn)行；所述的生物降解性脂肪族聚內(nèi)酯為聚丙交酯(PLA)、聚己內(nèi)酯(PCL)、內(nèi)酯間的二元或三元無(wú)規(guī)或嵌段共聚物、內(nèi)酯與聚醚間的二元或三元無(wú)規(guī)或嵌段共聚物；所述的油性有機(jī)溶劑為二氯甲烷、三氯甲烷或二氯乙烷；所述的乳化劑為小分子表面活性物質(zhì)；所述的穩(wěn)定劑為天然或合成的高分子物質(zhì)。
3.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述生物降解性脂肪族聚內(nèi)酯為分子量為5000～80000的聚(丙交酯-乙交酯)共聚物(PLGA)、聚(丙交酯-己內(nèi)酯)共聚物(PLC)、聚(乙交酯-己內(nèi)酯)共聚物(PGC)、聚(乙交酯-丙交酯-己內(nèi)酯)共聚物(PGLC)、聚(丙交酯-聚乙二醇醚)共聚物(PLE)、聚(己內(nèi)酯-聚乙二醇醚)共聚物(PCE)、聚(丙交酯-乙交酯-聚乙二醇醚)共聚物(PLGE)、聚(丙交酯-己內(nèi)酯-聚乙二醇醚)共聚物(PCLE)或聚(乙交酯-己內(nèi)酯-聚乙二醇醚)共聚物(PGCE)。
4.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述乳化劑為司班80、司班60、吐溫60或吐溫80。
5.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述穩(wěn)定劑為明膠、聚乙烯醇或聚乙烯吡咯烷酮。
6.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述步驟a中溶液A的濃度為20～100毫克/毫升。
7.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述步驟c中溶液A∶溶液B的體積比＝20∶1～5∶1；超聲乳化時(shí)間為45～90秒。
8.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述步驟d中將油包水乳液按體積比為1∶10～1∶20，加入濃度為1～5％的穩(wěn)定劑水溶液中攪拌，攪拌速度10000-15000轉(zhuǎn)/分，攪拌1～3分鐘。
9.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述步驟e中將水包油包水乳液持續(xù)攪拌3～6小時(shí)，攪拌速度1000～1500轉(zhuǎn)/分，分離出微囊粒子用蒸餾水洗滌2～4次。
10.如權(quán)利要求2或9所述的制備方法，其特征在于，所述分離微囊粒子采用離心分離方法。
11.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述各步驟均在4～20℃下進(jìn)行。
全文摘要
一種生物降解性微囊型超聲造影劑，為粒徑為1～10微米、微粒體壁厚為50～6000納米的中空微囊。其制備方法為在0～37℃溫度下，1)將生物降解性脂肪族聚內(nèi)酯用油性有機(jī)溶劑溶解，配制成溶液A；2)蒸餾水中加入乳化劑，混合均勻配成溶液B；3)將溶液B注入溶液A，超聲乳化；4)將該乳液加入穩(wěn)定劑水溶液中攪拌；5)持續(xù)攪拌2～10小時(shí)后分離出微囊粒子，蒸餾水洗滌；6)將得到的微粒體進(jìn)行冷凍干燥，得到粉末狀的生物降解性微囊。本發(fā)明可通過(guò)靜脈注射或靜脈滴注的途徑，經(jīng)過(guò)肺循環(huán)進(jìn)入左心腔，再經(jīng)冠狀動(dòng)脈進(jìn)入心肌微循環(huán)，借助物理原理增大病變組織與正常組織之間、運(yùn)動(dòng)部分與靜止部分之間對(duì)比度，起到超聲造影的效果。
文檔編號(hào)A61K49/18GK1398640SQ0213225
公開日2003年2月26日 申請(qǐng)日期2002年9月3日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月3日
發(fā)明者王身國(guó), 智光, 崔文瑾, 徐勇, 貝建中, 趙玉英 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院化學(xué)研究所, 中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院