專(zhuān)利名稱(chēng)：應(yīng)用差示文庫(kù)制備腫瘤疫苗及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)發(fā)明領(lǐng)域，是針對(duì)癌癥和感染性疾病的細(xì)胞治療。具體涉及利用自體樹(shù)突狀細(xì)胞進(jìn)行呈遞疾病組織(包括腫瘤和感染性疾病)的特異性抗原所構(gòu)成的抗原庫(kù)(此抗原庫(kù)即為本發(fā)明所指的差示文庫(kù))，利用此抗原庫(kù)以誘導(dǎo)機(jī)體或自體T細(xì)胞的針對(duì)這些差異抗原的細(xì)胞免疫反應(yīng)，從而達(dá)到治療疾病的目的，其中包括治療腫瘤類(lèi)疾病的目的，發(fā)明涉及疾病組織(包括腫瘤和感染性疾病)的特異性抗原差示文庫(kù)的構(gòu)建及其治療的實(shí)施過(guò)程和用途。
本發(fā)明的技術(shù)背景本發(fā)明主要涉及利用自體樹(shù)突狀細(xì)胞呈遞疾病組織特異的抗原，誘導(dǎo)機(jī)體或自體T細(xì)胞的針對(duì)這些差異抗原的細(xì)胞免疫反應(yīng)，從而達(dá)到治療疾病的目的。
對(duì)于腫瘤，傳統(tǒng)的化療、放療、手術(shù)等治療方法的療效并不理想。近年來(lái)應(yīng)用轉(zhuǎn)導(dǎo)了抗原的樹(shù)突狀細(xì)胞刺激抗原特異的殺傷T淋巴細(xì)胞(CTL)取得了一定的療效，另外，對(duì)于某些難治性胞內(nèi)病原體的感染，如病毒、胞內(nèi)菌等的感染也可以應(yīng)用這種方法治療。在正常的情況下，機(jī)體的抗原呈遞細(xì)胞可以識(shí)別由于惡變或感染而使表型發(fā)生變化的細(xì)胞，并將其表達(dá)的特異抗原在胞內(nèi)降解為抗原表位，由MHC分子將這些抗原表位呈遞至細(xì)胞表面，從而被能與這種抗原分子結(jié)合的T細(xì)胞受體識(shí)別，識(shí)別后的T細(xì)胞克隆就會(huì)大量擴(kuò)增，成為特異性的殺傷表達(dá)該抗原的細(xì)胞的CTL(cytotoxic lymphocyte)，從而清除病變組織。然而由于腫瘤和病原體經(jīng)常存在某些機(jī)制，從而抑制機(jī)體的這種免疫反應(yīng)，使得病變發(fā)展。隨著體外大量培養(yǎng)樹(shù)突狀細(xì)胞這種專(zhuān)職抗原呈遞細(xì)胞技術(shù)的出現(xiàn)，使得體外致敏抗原呈遞細(xì)胞，激發(fā)并擴(kuò)大針對(duì)特異抗原的免疫反應(yīng)的治療方法成為可能。
目前這種治療方法依其致敏抗原的不同可分為兩類(lèi)其一、克隆腫瘤特異抗原，體外將其轉(zhuǎn)導(dǎo)自體樹(shù)突狀細(xì)胞，樹(shù)突狀細(xì)胞作為一種抗原呈遞細(xì)胞可以將這種腫瘤特異抗原呈遞給T淋巴細(xì)胞，誘導(dǎo)腫瘤特異的T淋巴細(xì)胞的增殖、活化，產(chǎn)生針對(duì)該腫瘤特異抗原的CTL，從而特異性的殺傷腫瘤細(xì)胞，此方法在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和一些臨床試驗(yàn)中取得了一定的療效。但遺憾的是，目前發(fā)現(xiàn)的腫瘤抗原種類(lèi)很少，而且在腫瘤中的陽(yáng)性率也不高，限制了其應(yīng)用范圍。其二、可以將腫瘤細(xì)胞與樹(shù)突狀細(xì)胞在體外融合或?qū)⒛[瘤組織的總mRNA轉(zhuǎn)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞中，也就是說(shuō)通過(guò)樹(shù)突狀細(xì)胞將整個(gè)腫瘤抗原庫(kù)呈遞給T淋巴細(xì)胞，這樣可以免去克隆篩選腫瘤抗原的繁瑣，而且動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)也證實(shí)其確有一定療效。但這種方法卻帶來(lái)了一些新的問(wèn)題首先，在腫瘤總抗原中，絕大多數(shù)是正常組織也具有的，只有極少數(shù)是腫瘤特異的，而樹(shù)突狀細(xì)胞不能識(shí)別，將其一并呈遞給T淋巴細(xì)胞，這樣就大大浪費(fèi)了樹(shù)突狀細(xì)胞的呈遞資源，降低了呈遞效率；其次，雖然理論上講，針對(duì)自身抗原的T淋巴細(xì)胞在出生前后就經(jīng)胸腺的陰性選擇去除了，因此不會(huì)產(chǎn)生針對(duì)自身抗原的自身免疫反應(yīng)，但很難排除這種情況會(huì)在某些敏感個(gè)體發(fā)生，導(dǎo)致自身免疫性疾病。
本發(fā)明的內(nèi)容本發(fā)明的內(nèi)容是將腫瘤組織與正常組織的差示文庫(kù)轉(zhuǎn)導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞，主要是樹(shù)突狀細(xì)胞，誘導(dǎo)針對(duì)多個(gè)腫瘤特異抗原的CTL，從而治療腫瘤的方法，類(lèi)似的方法也可以用于難治性胞內(nèi)病原體感染。應(yīng)用差示文庫(kù)來(lái)致敏抗原呈遞細(xì)胞，雖然操作步驟增加了，但可以有效提高抗原呈遞細(xì)胞的呈遞效率，最大限度避免針對(duì)自身抗原的產(chǎn)生，又幾乎可以應(yīng)用于所有腫瘤患者，而不受有限腫瘤抗原的限制。
文庫(kù)一般是由病變組織和周?chē)＝M織比較得來(lái)，對(duì)于難以獲得病變組織或正常組織的情況下，也可以應(yīng)用有代表性的細(xì)胞株(或感染細(xì)胞株)來(lái)替代，例如惡性膠質(zhì)細(xì)胞瘤的細(xì)胞株。
在本發(fā)明的例子中采用將病變組織與正常組織的cDNA文庫(kù)雜交后，用鏈親和素標(biāo)記的磁珠去除正常組織中含有的基因，從而得到差示文庫(kù)的方法(具體見(jiàn)實(shí)施例1)，也可以應(yīng)用差異顯示PCR法，消減雜交法及它們的改良方法。
差示文庫(kù)可以直接克隆在真核表達(dá)載體內(nèi)，導(dǎo)入抗原呈遞細(xì)胞，導(dǎo)入的方法可以采用脂質(zhì)體、陽(yáng)離子聚合物等非病毒載體，也可將差示文庫(kù)克隆至病毒載體中，如腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體等，在各種載體中均可加入引導(dǎo)分子(如甘露糖等)以增加轉(zhuǎn)染效率。另外，還可以將差示文庫(kù)載體外轉(zhuǎn)錄合成RNA轉(zhuǎn)染樹(shù)突狀細(xì)胞，或翻譯成肽鏈刺激樹(shù)突狀細(xì)胞。
一般而言，用于刺激產(chǎn)生CTL的抗原呈遞細(xì)胞常采用專(zhuān)職抗原呈遞細(xì)胞，如樹(shù)突狀細(xì)胞，此外也可應(yīng)用巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞及人造抗原呈遞細(xì)胞(如導(dǎo)入MHC和共刺激信號(hào)的細(xì)胞)等。
轉(zhuǎn)導(dǎo)差示文庫(kù)的樹(shù)突狀細(xì)胞可直接注入體內(nèi)(包括靜脈和皮下注射等途徑)，也可在體外刺激腫瘤特異的CTL的增殖、活化，再將生成的CTL回輸體內(nèi)來(lái)攻擊腫瘤細(xì)胞，類(lèi)似的方法也可用于治療胞內(nèi)病原體的感染。
本發(fā)明的關(guān)鍵是采用表達(dá)的差示文庫(kù)致敏抗原呈遞細(xì)胞，差示文庫(kù)的來(lái)源是病變組織和正常組織的表達(dá)的mRNA的差異，在不能得到病變組織或正常對(duì)照組織時(shí)，可用表型最為相近的細(xì)胞株來(lái)代替，或用病原體感染的細(xì)胞株來(lái)代替感染組織，提取兩種組織的總RNA或mRNA，體外反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，通過(guò)PCR擴(kuò)增后，在利用雜交等方法去除正常組織的基因，即可得到差示文庫(kù)。產(chǎn)生可表達(dá)的差示文庫(kù)的方法有很多種，經(jīng)典的方法有差異顯示PCR法，消減雜交法及改良后的抑制性消減雜交法。這些構(gòu)建差示文庫(kù)的方法一般用于尋找差異表達(dá)的基因，如腫瘤抗原基因，一般要求這些方法1)敏感性高，對(duì)于一些低豐度的基因也能檢測(cè)到；2)特異性強(qiáng)，避免過(guò)多的假陽(yáng)性；3)文庫(kù)中3’非編碼區(qū)克隆的數(shù)量低；4)操作簡(jiǎn)單，所需mRNA的量少；5)得到的文庫(kù)能夠保持原來(lái)的開(kāi)放讀碼框架(ORF)，最好是全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)。遺憾的是，目前還沒(méi)有一種方法能同時(shí)滿(mǎn)足以上這些要求。所幸應(yīng)用于致敏抗原呈遞細(xì)胞的差示文庫(kù)并不需要達(dá)到很高的質(zhì)量要求，只要能得到數(shù)個(gè)腫瘤特異基因的克隆，而且絕大部分正?；蚰鼙蝗〕簦涂梢詽M(mǎn)足要求，當(dāng)然，文庫(kù)的質(zhì)量越高，治療的效果會(huì)越理想。在下文所介紹的例子中采用的文庫(kù)構(gòu)建方法是，首先采用SMART技術(shù)得到病變組織的全長(zhǎng)cDNA庫(kù)，再與摻入了生物素的對(duì)照組織的cDNA雜交，用帶有鏈親和素的磁珠去除被雜交的cDNA，剩余的就是腫瘤特異的全長(zhǎng)cDNA，(Zhao Z，Huang X，et al.J Biotechnol 73(1)35-41)，將這些全長(zhǎng)cDNA克隆在表達(dá)載體中，獲得腫瘤差異抗原基因表達(dá)文庫(kù)。
在應(yīng)用抗原呈遞細(xì)胞體外致敏治療腫瘤和感染性疾病的過(guò)程中，抗原呈遞細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率低一直是影響這種方法的治療效果的關(guān)鍵因素。蛋白質(zhì)、肽鏈和抗原表位可以直接致敏抗原呈遞細(xì)胞，但由于蛋白成分與抗原呈遞細(xì)胞的結(jié)合時(shí)間很短，縮短了其刺激CTL的時(shí)間，降低治療效果，同時(shí)蛋白質(zhì)和肽鏈不能進(jìn)入細(xì)胞，從而無(wú)法在細(xì)胞內(nèi)分解成為可被T細(xì)胞受體識(shí)別的抗原表位，而使其刺激效果降低。RNA和抗原基因可以由載體攜帶進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)并表達(dá)一段時(shí)間，不斷表達(dá)出的蛋白質(zhì)可以在細(xì)胞內(nèi)降解為抗原表位，被MHC分子呈遞至細(xì)胞表面，而進(jìn)一步被T細(xì)胞受體識(shí)別，這種方法可以延長(zhǎng)抗原呈遞細(xì)胞刺激CTL的時(shí)間，也更符合生理情況。在各種轉(zhuǎn)基因載體中，腺病毒的轉(zhuǎn)染效率最高，可以達(dá)到90％左右(Dietz AB，Blood 91(2)392-8)，其缺點(diǎn)是腺病毒載體的外殼有一定的細(xì)胞毒性，在感染滴度過(guò)高時(shí)會(huì)導(dǎo)致抗原呈遞細(xì)胞的死亡，更重要的是，腺病毒載體的外殼本身具有很強(qiáng)的抗原性，可以被抗原呈遞細(xì)胞呈遞，導(dǎo)致其刺激的CTL中的大部分是針對(duì)腺病毒載體的，而非針對(duì)病變抗原。腺相關(guān)病毒載體的轉(zhuǎn)染效率，在病毒滴度較高，純度較好時(shí)，可達(dá)50～60％，而且，重組腺相關(guān)病毒載體的抗原性很弱，在直接注入體內(nèi)時(shí)也不會(huì)產(chǎn)生針對(duì)其的特異性CTL(Chiriva-Internati M，Liu Y，et al.Eur J Immunol 32(1)30-8)，其主要的缺點(diǎn)是該載體用常規(guī)制備方法制備時(shí)的包裝效率和產(chǎn)量均低，不易得到高滴度和高純度的重組腺相關(guān)病毒載體。鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒對(duì)于分裂并不旺盛的抗原呈遞細(xì)胞的感染效率很低，而慢病毒的感染效率雖有應(yīng)用價(jià)值，但由于其來(lái)源于HIV，安全性方面的顧慮使其難以在近期應(yīng)用于臨床。非病毒載體，如；脂質(zhì)體、聚乙烯亞胺、多聚左旋賴(lài)氨酸、殼聚糖等，可以轉(zhuǎn)染質(zhì)粒和RNA，操作簡(jiǎn)單，效率在10～20％之間，可以誘導(dǎo)明確的抗原特異性CTL，另外如電轉(zhuǎn)法、基因槍等方法的轉(zhuǎn)染效率比前者略高，但需要特殊的設(shè)備，而且轉(zhuǎn)染條件的細(xì)微變化對(duì)轉(zhuǎn)染效率影響很大，使轉(zhuǎn)染效率不穩(wěn)定。在下文的實(shí)施例中采用的方法是將差異cDNA文庫(kù)克隆于重組腺相關(guān)病毒載體的構(gòu)建質(zhì)粒pSNAV-Sfi I中，該質(zhì)粒同時(shí)是一種真核表達(dá)載體質(zhì)粒，這樣既可直接采用非病毒載體導(dǎo)入抗原呈遞細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，也可以在病毒包裝細(xì)胞中包裝成腺相關(guān)病毒載體，轉(zhuǎn)染抗原呈遞細(xì)胞，增加轉(zhuǎn)染效率。
抗原呈遞細(xì)胞有多種，一般采用專(zhuān)職抗原呈遞細(xì)胞----樹(shù)突狀細(xì)胞，它不僅呈遞效率高，而且可以刺激原始T細(xì)胞(naive T cell)的活化、增殖，啟動(dòng)特異性免疫反應(yīng)，應(yīng)用十分廣泛。體外大量培養(yǎng)樹(shù)突狀細(xì)胞的方法主要有二種，其一來(lái)源于外周血單核細(xì)胞(PBMC)，具體是將分離得到的PBMC在體外附壁培養(yǎng)3小時(shí)后，洗去不能附壁的淋巴細(xì)胞，余下的即為樹(shù)突狀細(xì)胞，在有GM-CSF、IL-4等細(xì)胞因子的培養(yǎng)條件下，5～8天逐漸成熟，期間給予抗原致敏，成為成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞。其二來(lái)源于骨髓CD34+細(xì)胞，在GM-CSF、TNF-a、SCF等細(xì)胞因子的培養(yǎng)條件下，誘導(dǎo)分化成成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞。這兩種方法得到的成熟樹(shù)突狀細(xì)胞均可用MHC、CD83等表面分子來(lái)鑒定。另外也可用人工構(gòu)建的方法得到人造抗原呈遞細(xì)胞，例如人工導(dǎo)入MHC分子和共刺激分子等方法。
應(yīng)用上述方法得到的致敏的抗原呈遞細(xì)胞可用于治療和預(yù)防腫瘤和感染性疾病，在疾病發(fā)生前、進(jìn)行中、及好轉(zhuǎn)后均可使用，并不干擾原有的治療方案，可以與傳統(tǒng)的手術(shù)、化療、放療協(xié)同作用，但不建議與明顯的免疫抑制劑合用?？乖蔬f細(xì)胞可來(lái)源于患者自體或配型相符的供體。致敏的抗原呈遞細(xì)胞可以直接注入體內(nèi)(包括，靜脈注射、淋巴管內(nèi)注射、皮下注射等)，引起機(jī)體的CTL反應(yīng)，輸入的劑量依患者的體重、免疫狀態(tài)和病變程度而變化，推薦的劑量為105～108/kg，但并不限于此。另外也可以在體外刺激T淋巴細(xì)胞，然后回輸擴(kuò)增活化的CTL，T淋巴細(xì)胞可來(lái)源于患者自體或配型相符的供者。在刺激CTL的過(guò)程中，可應(yīng)用絲裂原、IL-2、IL-12、OKT3(抗CD3抗體)、抗CD21抗體、GM-CSF、滅活的PBMC、EB病毒感染的纖維細(xì)胞等刺激特異的CTL的增殖，擴(kuò)大回輸體內(nèi)的CTL的數(shù)量，以增加治療效果?；剌?shù)腃TL的劑量依患者的體重、免疫狀態(tài)和病變程度而定，推薦的劑量為109～1010/kg，但并不限于此。
致敏的樹(shù)突狀細(xì)胞的刺激活性可以通過(guò)體外刺激T淋巴細(xì)胞的增殖效率來(lái)測(cè)定，可以使用3H摻入法來(lái)測(cè)算T淋巴細(xì)胞的增殖率。致敏的樹(shù)突狀細(xì)胞刺激的CTL的殺傷效率可以通過(guò)與靶細(xì)胞共孵育的方法來(lái)檢測(cè)其殺傷靶細(xì)胞的效來(lái)確定，靶細(xì)胞的死亡率可以通過(guò)51Cr測(cè)定來(lái)計(jì)算殺傷率。
綜上所述，本發(fā)明的核心是采用表達(dá)的差示文庫(kù)致敏抗原呈遞細(xì)胞，其中，表達(dá)的差示文庫(kù)可以是腫瘤組織的特異性抗原差示文庫(kù)也可以是感染性疾病組織的特異性抗原差示文庫(kù)。被表達(dá)的差示文庫(kù)致敏了的抗原呈遞細(xì)胞是通過(guò)誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)多個(gè)腫瘤特異抗原的CTL，達(dá)到治療腫瘤的目的。當(dāng)然，被表達(dá)的差示文庫(kù)致敏了的抗原呈遞細(xì)胞也可以是通過(guò)誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)多個(gè)胞內(nèi)病原體特異抗原的CTL，達(dá)到治療感染性疾病的目的。即轉(zhuǎn)導(dǎo)差示文庫(kù)的抗原呈遞細(xì)胞可在體外刺激腫瘤特異的CTL的增殖、活化，再將生成的CTL回輸體內(nèi)來(lái)攻擊腫瘤細(xì)胞，也可以轉(zhuǎn)導(dǎo)差示文庫(kù)的抗原呈遞細(xì)胞可在體外刺激胞內(nèi)病原體特異的CTL的增殖、活化，再將生成的CTL回輸體內(nèi)來(lái)治療胞內(nèi)病原體的感染。因此，腫瘤組織的抗原差示文庫(kù)可做為腫瘤疫苗。腫瘤組織的抗原差示文庫(kù)可用于治療腫瘤類(lèi)疾病。感染性疾病組織的抗原差示文庫(kù)可做為感染性疾病疫苗。感染性疾病組織的抗原差示文庫(kù)可用于治療感染性疾病。在表達(dá)的差示文庫(kù)的構(gòu)建過(guò)程中，表達(dá)的差示文庫(kù)的意思是指將疾病組織的特異性抗原差示文庫(kù)插入真核表達(dá)載體質(zhì)粒pSNAV-Sfi-I的Sfi-I克隆位點(diǎn)，成為pSNAV-Sfi-I/cDNA抗原差示文庫(kù)。另外，表達(dá)的差示文庫(kù)可以插入到除pSNAV-Sfi-I以外的其它真核表達(dá)載體質(zhì)粒中。轉(zhuǎn)導(dǎo)差示文庫(kù)的抗原呈遞細(xì)胞可直接注入體內(nèi)，包括靜脈注射途徑和皮下注射等途徑。
實(shí)施例以下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施的過(guò)程、方法和應(yīng)用作了詳細(xì)說(shuō)明，但不意味著限制本發(fā)明的內(nèi)容。
實(shí)施例1腫瘤樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗的制備1.腫瘤組織和癌旁正常組織(對(duì)照組織)的RNA的獲得手術(shù)獲得的腫瘤組織及瘤旁正常組織立即置于液氮中，盡早制備勻漿，按照RNA操作的注意事項(xiàng)和總RNA或polyA mRNA提取試劑盒的說(shuō)明書(shū)提供的方法提取總RNA或polyA mRNA，-70℃保存，避免反復(fù)凍融。
2.獲得腫瘤組織和對(duì)照組織的cDNA。
對(duì)照以O(shè)ligo-dT(15-18)為引物將癌旁正常組織的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA總RNA(1～2ug)與Oligo-dT(10uM)2ul混合后，補(bǔ)水(無(wú)RNase水)至5ul，72℃，2min，冰浴2min，依次加入5×RT Buffer 4ul，dNTP(10mM)2ul，AMV反轉(zhuǎn)錄酶1～2ul，補(bǔ)水(無(wú)RNase水)至20ul，42℃，60min。然后用PCR的方法摻入生物素，反應(yīng)混合物1ul反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，20uM biotin-21-dUTP，200uM dNTP，2ulOligo-dT，定容至50ul，反應(yīng)條件是95℃ 20sec，40℃ 5min，72℃ 3min，40個(gè)循環(huán)。
腫瘤組織采用SMART cDNA合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄得到腫瘤組織的全部全長(zhǎng)cDNA，其中兩條引物的序列分別為下游引物為5’-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)30N-1N-3’上游引物為5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTACGGCCGGG-3’兩條引物的序列中均帶有Sfi I酶切位點(diǎn)，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件與對(duì)照組織的cDNA的獲得相同，體系為10ul。
3.消減雜交和PCR擴(kuò)增取5ul腫瘤組織的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，加入10ul對(duì)照組織的PCR產(chǎn)物中，98℃退火5min，在0.5％SDS和6×SSC雜交液中，65℃雜交12小時(shí)，取20ul雜交產(chǎn)物通過(guò)S-400層析柱，去除鹽和小分子物質(zhì)，將過(guò)濾后的雜交產(chǎn)物加入0.2ml包被有鏈親和素的磁珠(NEB)，室溫孵育2min，65℃孵育5min，12000轉(zhuǎn)離心取上清40ul為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所用引物與上述腫瘤組織反轉(zhuǎn)錄cDNA所用引物相同，擴(kuò)增體系50ul，條件為95℃ 15sec，68℃ 5min，15-25個(gè)循環(huán)。以上所述為兩種組織的cDNA雜交消減、PCR擴(kuò)增的過(guò)程。
再次取上述PCR產(chǎn)物40ul，與10ul對(duì)照PCR產(chǎn)物混合，同上述步驟再次進(jìn)行雜交，消減，PCR，如此反復(fù)3-4次，總PCR循環(huán)數(shù)不超過(guò)60。
4.構(gòu)建可表達(dá)的差示文庫(kù)將得到的最終消減擴(kuò)增產(chǎn)物150ul，純化后，用Sfi I酶50℃酶切2小時(shí)，與同樣經(jīng)Sfi I酶切的真核表達(dá)載體質(zhì)粒pSNAV-Sfi I連接，轉(zhuǎn)化，鋪板后擴(kuò)增，得到腫瘤差異cDNA表達(dá)質(zhì)粒文庫(kù)pSNAV-Sfi I/cDNA。該文庫(kù)的載體為重組腺相關(guān)病毒載體的構(gòu)建質(zhì)粒pSNAV-1經(jīng)在多克隆位點(diǎn)插入Sfi I酶切位點(diǎn)改構(gòu)而成，其圖譜見(jiàn)說(shuō)明書(shū)附圖中圖1所示，在真核表達(dá)框的兩端有腺相關(guān)病毒載體的末端反向重復(fù)序列(ITR)，在真核表達(dá)框的多克隆位點(diǎn)處為填充序列相隔的兩個(gè)Sfi I酶切位點(diǎn)，可以定向插入cDNA。圖1中所示為插入差示文庫(kù)的質(zhì)粒載體pSNAV-Sfi-I的圖譜，其中多克隆位點(diǎn)中含有Sfi I(A)和Sfi I(B)位點(diǎn)，中間為250bp的填充序列。
5.檢測(cè)提取腫瘤差異cDNA表達(dá)文庫(kù)的質(zhì)粒，以260nm和280nm吸光度來(lái)檢測(cè)所提取的文庫(kù)質(zhì)粒的濃度和純度。用于檢測(cè)的文庫(kù)質(zhì)粒的濃度和純度應(yīng)較高。
PCR以GAPDH基因特異序列為引物，以文庫(kù)為模板擴(kuò)增，如為陰性，說(shuō)明絕大多數(shù)正常基因已被去除，文庫(kù)中主要為腫瘤特異的基因克隆。
更為精確的檢測(cè)方法可采用斑點(diǎn)雜交法(適用于差示文庫(kù))體外反轉(zhuǎn)錄腫瘤組織和對(duì)照組織的cDNA探針，同時(shí)摻入生物素，分別與尼龍膜上的不同量的文庫(kù)質(zhì)粒的斑點(diǎn)進(jìn)行雜交，以鏈親和素-HRP與底物反應(yīng)來(lái)顯色，如果對(duì)照探針的結(jié)果為陰性，實(shí)驗(yàn)探針的結(jié)果為陽(yáng)性，則說(shuō)明文庫(kù)中致含有腫瘤特異的基因，而不含有正常組織的基因。
最精確的方法是將文庫(kù)中的基因克隆逐個(gè)或隨機(jī)選取多個(gè)進(jìn)行測(cè)序，并與Genbank中公布的序列比較，對(duì)于不能明確為腫瘤基因的克隆，或新序列，可以通過(guò)Northern的方法來(lái)驗(yàn)證該基因是否為實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤組織的特有基因，而非其臨近正常組織的基因。
6.樹(shù)突狀細(xì)胞的培養(yǎng)和成熟取患者外周血，以肝素或EDTA抗凝后，緩慢加入裝有淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，形成分層(分離液∶血液＝1∶2或2∶3)，2000轉(zhuǎn)離心，20分鐘，棄去上清，吸取中間的白色細(xì)胞層，以5倍體積的PBS或Hank’s液清洗細(xì)胞1000轉(zhuǎn)/10分鐘×3次，棄上清。以含有10％FCS的RPMI1640重懸細(xì)胞，稀釋至2×106個(gè)細(xì)胞/ml，加入六孔板中，每孔3ml，37℃孵育3小時(shí)。
吸取非貼壁細(xì)胞，加入10％DMSO凍存?zhèn)溆?，以培養(yǎng)基洗滌一次貼壁的細(xì)胞，加入含15％FCS的RPMI1640(含青鏈霉素)培養(yǎng)，并在培養(yǎng)基中加入GM-CSF800u/ml，IL-4 500u/ml。培養(yǎng)第4天換液，第7天，樹(shù)突狀細(xì)胞浮起，收集細(xì)胞。
DC免疫表性的檢測(cè)取少量樹(shù)突狀細(xì)胞為樣本進(jìn)行檢測(cè)，以PBS洗滌后，重懸至106個(gè)細(xì)胞/ml，以100ul/管，加入FCM專(zhuān)用管，再分別加入標(biāo)記液(PBS+1％BSA+0.02％疊氮鈉)稀釋的鼠抗人一抗(CD14，40，54，83，86，HLA-DR)，單標(biāo)濃度為5ug/ml，4℃標(biāo)記30min。PBS洗滌一次，一抗不帶有熒光的再加入PE或FITC標(biāo)記的二抗，避光4℃標(biāo)記30min。PBS洗兩次，然后通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，得到各表型的百分比。樹(shù)突狀細(xì)胞表面分子陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量應(yīng)占總細(xì)胞數(shù)的90％左右。成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞可直接致敏，也可凍存，待需要時(shí)復(fù)蘇。
7.脂質(zhì)體介導(dǎo)差示文庫(kù)轉(zhuǎn)染樹(shù)突狀細(xì)胞成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞重懸于Opti-MEM培養(yǎng)液中，濃度為2-5×106個(gè)細(xì)胞/ml。以250～750ul的Opti-MEM培養(yǎng)液分別稀釋文庫(kù)質(zhì)粒(用量為1～5ug/106樹(shù)突狀細(xì)胞)和脂質(zhì)體(用量為5～20ulDOTMADOPE/106樹(shù)突狀細(xì)胞)，將兩者等體積混合后，室溫反應(yīng)20～45min，將此混合物加入樹(shù)突狀細(xì)胞中，37℃孵育2～6小時(shí)，然后加入含15％血清的培養(yǎng)液，37℃孵育，24小時(shí)后，清洗細(xì)胞，作為致敏的抗原呈遞細(xì)胞。此致敏抗原呈遞細(xì)胞可直接用于體外刺激CTL、活性測(cè)定，或體內(nèi)應(yīng)用，也可凍存待用。
8.樹(shù)突狀細(xì)胞刺激CTL的活性及檢測(cè)復(fù)蘇凍存的自體淋巴細(xì)胞，重懸至2×106個(gè)細(xì)胞/ml；致敏的樹(shù)突狀細(xì)胞收集后，重懸至1×105個(gè)細(xì)胞/ml；兩者等體積混合(效應(yīng)細(xì)胞∶刺激細(xì)胞為20∶1)，加入96孔板中，100ul/孔，37℃孵育。3天后換液一次，加入IL-2至終濃度為25u/ml，以誘導(dǎo)抗原特異性CTL的活化和擴(kuò)增。
將靶細(xì)胞(腫瘤組織和對(duì)照組織)5×106個(gè)分別加入到200uCi的Na251CrO4溶液中，37℃標(biāo)記1小時(shí)，然后用10％FCS培養(yǎng)基洗凈，再將上述誘導(dǎo)的CTL和靶細(xì)胞按10∶1，20∶1，40∶1，80∶1的比例混合，加入96孔板，400g離心1分鐘后，37℃培養(yǎng)4～6小時(shí)，吸取上清100ul，以蓋革計(jì)測(cè)定51Cr的量。以下列公式計(jì)算殺傷率殺傷率(％)＝[(測(cè)定值-對(duì)照值)/(最大釋放值-對(duì)照值)]×100％其中，最大釋放值為靶細(xì)胞中加入Triton X-100時(shí)的51Cr釋放量。
實(shí)施例2肺癌腫瘤疫苗體外刺激CTL攻擊自體腫瘤細(xì)胞1.肺癌樹(shù)突狀細(xì)胞腫瘤疫苗的制備手術(shù)切除肺癌及癌旁組織，取部分肺癌細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，凍存后待用。余下部分肺癌組織和癌旁組織分別提取總RNA，如實(shí)施例1中所述制備成該肺癌組織的差異全長(zhǎng)cDNA表達(dá)文庫(kù)。經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染樹(shù)突狀細(xì)胞，成為樹(shù)突狀細(xì)胞瘤苗。
2.肺癌腫瘤疫苗體外刺激CTL攻擊自體腫瘤細(xì)胞將肺癌樹(shù)突狀細(xì)胞瘤苗在體外刺激自體淋巴細(xì)胞(如實(shí)施例1所述)，成為針對(duì)該肺癌組織的CTL。復(fù)蘇凍存的原代肺癌細(xì)胞，將5×106個(gè)細(xì)胞分別加入到200uCi的Na251CrO4溶液中，37℃標(biāo)記1小時(shí)，然后用10％FCS培養(yǎng)基洗凈，再將上述誘導(dǎo)的CTL和肺癌細(xì)胞按10∶1，20∶1，40∶1，80∶1的比例混合，分別加入96孔板，以不加CTL的肺癌細(xì)胞為對(duì)照。400g離心1分鐘后，37℃培養(yǎng)4～6小時(shí)，吸取上清100ul，以蓋革計(jì)測(cè)定51Cr的量。以下列公式計(jì)算殺傷率殺傷率(％)＝[(測(cè)定值-對(duì)照值)/(最大釋放值-對(duì)照值)]×100％其中，最大釋放值為靶細(xì)胞中加入Triton X-100時(shí)的51Cr釋放量。
實(shí)施例3A375(人黑色素瘤)細(xì)胞系的樹(shù)突狀細(xì)胞瘤苗治療裸鼠轉(zhuǎn)移癌動(dòng)物模型1.樹(shù)突狀細(xì)胞腫瘤疫苗的制備體外培養(yǎng)A375細(xì)胞和BHK細(xì)胞，分別提取其總RNA，如實(shí)施例1中所述制備成A375細(xì)胞的差異全長(zhǎng)cDNA表達(dá)文庫(kù)。經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染人樹(shù)突狀細(xì)胞，成為樹(shù)突狀細(xì)胞瘤苗。
2.裸鼠轉(zhuǎn)移癌動(dòng)物模型的制備6周雌性裸鼠，每只經(jīng)鼠尾靜脈注射2×105個(gè)腫瘤細(xì)胞(懸于0.1ml HBSS溶液)。并設(shè)對(duì)照組。
3.樹(shù)突狀細(xì)胞瘤苗體外刺激CTL治療轉(zhuǎn)移癌動(dòng)物模型將A375的樹(shù)突狀細(xì)胞瘤苗在體外刺激自體淋巴細(xì)胞(如實(shí)施例1所述)，成為針對(duì)A375細(xì)胞的CTL。腫瘤接種3天后，每天給予107個(gè)CTL細(xì)胞/只，連續(xù)3天，計(jì)算裸鼠的死亡率，腫瘤接種40天后，處死所有裸鼠，測(cè)量肺總重及肺內(nèi)轉(zhuǎn)移灶的個(gè)數(shù)。


圖1所示為插入差異文庫(kù)的質(zhì)粒載體pSNAV-Sfi-I的圖譜，其中多克隆位點(diǎn)中含有Sfi I(A)和Sfi I(B)位點(diǎn)，中間為250bp的填充序列。
權(quán)利要求
1.采用表達(dá)的差示文庫(kù)致敏抗原呈遞細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1，表達(dá)的差示文庫(kù)是腫瘤組織的特異性抗原差示文庫(kù)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1，表達(dá)的差示文庫(kù)是感染性疾病組織的特異性抗原差示文庫(kù)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1，被表達(dá)的差示文庫(kù)致敏了的抗原呈遞細(xì)胞是通過(guò)誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)多個(gè)腫瘤特異抗原的CTL，達(dá)到治療腫瘤的目的。
5.根據(jù)權(quán)利要求1，抗原呈遞細(xì)胞為樹(shù)突狀細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求1，表達(dá)的差示文庫(kù)是將疾病組織的特異性抗原差示文庫(kù)插入真核表達(dá)載體質(zhì)粒pSNAV-Sfi-I的Sfi-I克隆位點(diǎn)，成為pSNAV-Sfi-I/cDNA抗原差示文庫(kù)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1，表達(dá)的差示文庫(kù)可以插入到除pSNAV-Sfi-I以外的其它真核表達(dá)載體質(zhì)粒中。
8.根據(jù)權(quán)利要求1，轉(zhuǎn)導(dǎo)并表達(dá)了差示文庫(kù)的抗原呈遞細(xì)胞可直接注入體內(nèi)，包括靜脈注射途徑和皮下注射途徑。
9.根據(jù)權(quán)利要求2，轉(zhuǎn)導(dǎo)差示文庫(kù)的抗原呈遞細(xì)胞可在體外刺激腫瘤特異的CTL的增殖、活化，再將生成的CTL回輸體內(nèi)來(lái)攻擊腫瘤細(xì)胞。
10.根據(jù)權(quán)利要求2，腫瘤組織的抗原差示文庫(kù)做為腫瘤疫苗。
全文摘要
本發(fā)明涉及所有利用差異文庫(kù)來(lái)致敏抗原呈遞細(xì)胞制備疫苗的方法，用于(原發(fā)或轉(zhuǎn)移)腫瘤或感染性疾病的治療。發(fā)明中所指的差異文庫(kù)是指利用各種方法得到的病變組織(腫瘤或感染組織)與正常組織的差異cDNA文庫(kù)(全長(zhǎng)或部分)。利用真核基因表達(dá)載體將此文庫(kù)轉(zhuǎn)染抗原呈遞細(xì)胞，或在體外合成RNA、肽鏈來(lái)致敏抗原呈遞細(xì)胞。這種致敏的抗原呈遞細(xì)胞可以直接輸入體內(nèi)，刺激針對(duì)病變的免疫反應(yīng)，或在體外刺激產(chǎn)生CTL，再將此CTL回輸以清除病變。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1572327SQ0212429
公開(kāi)日2005年2月2日 申請(qǐng)日期2002年7月16日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月16日
發(fā)明者康禹, 吳小兵 申請(qǐng)人:本元正陽(yáng)基因技術(shù)股份有限公司