專利名稱：一種脊髓、周圍神經(jīng)修復材料的制備工藝的制作方法
一、所屬領域本發(fā)明涉及醫(yī)學領域中可用于人體創(chuàng)傷后的治療或動物實驗研究的一種材料的制備，特別涉及一種用膠原蛋白和氨基聚糖制成的用于橋接周圍神經(jīng)或脊髓節(jié)段性損傷的具有同方向微管型結構特性的脊髓、周圍神經(jīng)修復材料的制備工藝。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術方案是該脊髓、周圍神經(jīng)修復材料可用膠原(I、III、IV型)與氨基聚糖(硫酸軟骨素-6或硫酸軟骨素-4)混合制成，在一定的低溫條件下，調(diào)整注有膠原-氨基聚糖混合物管降入冷淋液中速度和/或冷淋液溫度，以達到制備在內(nèi)部結構上具有微管徑大小不同和微管隙呈軸向均勻且平行的規(guī)律性排列的具有同方向微管型結構特性的修復材料，其制作方法按以下步驟進行1)在制作中稱取一定量的膠原蛋白按27.5mg/ml放入0.05M(醋酸、鹽酸等，以下與此相同)酸性溶液中，在恒溫4℃環(huán)境中，以2000r/min，攪拌90min，制成懸濁液；2)再稱取氨基聚糖按1.33mg/ml加入0.05M酸性溶液中，同樣在恒溫4℃、2000r/min，攪拌90min，制成懸濁液；3)膠原與氨基聚糖混合比按所制材料應用需要，可以在(60-120)∶(1-2)之間調(diào)節(jié)，按比例混合兩種懸濁液，在4℃、2000r/min、繼續(xù)攪拌90min，制成膠原纖維和氨基聚糖懸濁液，將此懸濁液放入長頸燒瓶中，抽真空靜置30min。再將其注入硅膠管中(所制材料直徑可以在3mm-16mm之間調(diào)節(jié))，兩端封堵，順軸向放入冷淋劑中，并控制放入速度；a)調(diào)節(jié)浸入速度，速度分別為1.0×10-4m/s、1.0×10-5m/s……依次遞減至10×10-8m/s；從而得到相應溫度的各種速度下的膠原-氨基聚糖懸濁液冰晶圓柱體；b)調(diào)節(jié)冷淋液溫度在-10℃～-180℃之間任意變化，從而得到相應速度下的各種溫度下的膠原懸濁液冰晶圓柱體；c)注有懸濁液硅膠管每次保留于冷淋劑中30min～60min，將膠原-氨基聚糖懸濁液徹底冷凍結晶；d)將懸濁液-硅膠管冰凍體按應用要求切成短節(jié)段，取中央完整的放在鋁盤中，凍干(-30℃、100mtorr)24h，真空狀態(tài)下升溫至0℃保持24h；e)再繼續(xù)升溫至22℃保持45min-90min，解除真空，取出干燥的膠原基質(zhì)節(jié)段，最后將膠原基質(zhì)節(jié)段包入鋁箔小包中(開放)，放入烤箱，壓力為30mmHg、溫度為105℃、時間24h，然后取出將小包密封保存至干燥箱；f)通過改變冷凍速度和/或冷淋液溫度來控制材料內(nèi)微管的直徑和走行方向。
本發(fā)明的其它特點是，所述膠原-氨基聚糖混合物包括I、III、IV型膠原和硫酸軟骨素-6或硫酸軟骨素-4。
實施例1參見

圖1，按照本發(fā)明的技術方案，以I型膠原蛋白和硫酸軟骨素-6為例，其制作方法按以下步驟進行1)在制作時將I型膠原蛋白按27.5mg/ml溶于0.05M(醋酸、鹽酸等，以下與此相同)酸性溶液中，在恒溫4℃～10℃環(huán)境下，以2000r/min攪拌90min，制成懸濁液；2)將硫酸軟骨素-6按1.33mg/ml加入0.05M酸性溶液中，同樣在恒溫4℃～10℃下，以2000r/min攪拌90min，制成懸濁液；3)按5∶1比例混合兩種懸濁液，在4℃～10℃，以2000r/min、繼續(xù)攪拌90min，制成膠原蛋白和硫酸軟骨素-6混合性懸濁液，將此懸濁液放置于長頸燒瓶中，抽真空靜置30min，消除泡沫；4)將膠原蛋白和硫酸軟骨素-6混合性懸濁液其注入內(nèi)徑為3mm～16mm的管中，兩端封堵后垂直、縱向緩慢地放入冷淋劑(-10℃～-180℃)中，控制放入速度分別為1.0×10-4m/s、1.0×10-5m/s、1.0×10-6m/s、1.0×10-7m/s、1.0×10-8m/s；5)將膠原蛋白和硫酸軟骨素-6混合性懸濁液管保留于冷淋劑中30min～60min，使其混合性懸濁液完全徹底冷凍結晶；可得到各種條件(溫度、浸入速度)下的膠原懸濁液冰晶圓柱體；6)將膠原蛋白和硫酸軟骨素-6混合性懸濁液冰晶圓柱體凍干(-30℃、100mtorr)24h，真空狀態(tài)下升溫至0℃保持24h；7)將膠原蛋白和硫酸軟骨素-6凍干物放入烤箱，壓力為30mmHg、溫度為105℃、時間24h；8)將膠原蛋白和硫酸軟骨素-6凍干物包裝、三層密封，同位素照射滅菌，保存于干燥箱。
為了達到速度快慢變化大、勻速平穩(wěn)性要求高的實驗要求，用可調(diào)速度控制器，它是由可調(diào)控速度的馬達配以直徑在1.5cm～4cm之間的五個由小到大的齒輪等部件構成。冷淋液溫度調(diào)節(jié)則另外研制了冷淋裝置，調(diào)節(jié)冷淋液溫度在-10℃～-180℃之間任意變化。從而得到各種條件下的膠原懸濁液冰晶圓柱體。注有懸濁液硅膠管每次保留于冷淋劑中30min～60min，將膠原凍透。先將鋁盤、刀片放入-30℃恒溫箱中，冷凍備用。將10cm長懸濁液-硅膠管冰凍體切成長2.0cm短節(jié)段，取中央完整的放在鋁盤中，凍干(-30℃、100mtorr)24h，真空狀態(tài)下升溫至0℃保持24h。再繼續(xù)升溫至22℃保持45 min-90min，解除真空，取出干燥的膠原基質(zhì)節(jié)段。最后將膠原基質(zhì)節(jié)段包入鋁箔小包中(開放)，放入烤箱，壓力為30mmhg、溫度為105℃、時間24h，然后取出將小包密封保存至干燥箱。
將各種條件下制出的材料切成橫截面和縱截面，在物鏡下觀察其內(nèi)部孔的規(guī)律性，微管徑大小和微管的走向，通過電鏡觀察膠原基質(zhì)內(nèi)孔和微管的三維結構并將所得照片，采用Leica WinQ.3.2v圖象分析軟件先測量出孔和微管的直徑(見表1)。
表1 在-180℃，速度與孔徑、孔向間的關系
本發(fā)明在制備脊髓、周圍神經(jīng)修復材料著重解決了以下的技術問題1.制備過程中研制了①調(diào)速度調(diào)控儀，使速度控制在10×10-5m/s～1.5×10-7m/s之間；②冷淋溫控儀，使冷淋溫度在-10℃～-180℃之間任意調(diào)控。
2.探明了溫度、速度與神經(jīng)組織修復材料內(nèi)部結構間關系(1)如在-180℃、速度為10×10-5m/s，脊髓、周圍神經(jīng)修復基本材料的孔呈無規(guī)律性排列，孔徑為74.70μm～48.60μm；(2)如在-180℃、速度為1.25×10-6m/s，孔呈軸縱向微管排列，管徑為25.39μm～19.09μm；；(3)如在-180℃、速度在2×10-5m/s時，孔呈軸縱向微管排列，微管直徑最大，為146.97μm～178.47μm；(4)各種溫度、速度電鏡下材料外表面為全封閉結構；(5)各條件下的材料內(nèi)軸向微管均平行且基本均勻。
本發(fā)明所制出的脊髓、周圍神經(jīng)修復材料參見圖2～4，具有以下特點①材料的外表面為全封閉結構，可有效阻止體內(nèi)纖維結締組織的長入。②材料的微管徑大小可控制在30μm～200μm，有利于神經(jīng)再生纖維的生長；③微管的排列走行方向為軸向且相互間平行、均勻，有利于神經(jīng)再生纖維的定向延伸。本發(fā)明制備的脊髓、周圍神經(jīng)修復材料，既可直接植入修復脊髓、周圍神經(jīng)缺損；也可作為各種細胞移植的載體，攜帶不同的神經(jīng)生長因子及嗅鞘細胞、雪旺細胞和神經(jīng)干細胞等，用于修復脊髓、外周神經(jīng)節(jié)段性損傷、缺損。
以下實例2～6.膠原(I、III、IV型)與氨基聚糖(硫酸軟骨素-6或硫酸軟骨素-4)混合比相同。
實施例2采用III型膠原蛋白和硫酸軟骨素-6作為原始材料制備。其實施過程同實施例1。
實施例3采用IV型膠原蛋白和硫酸軟骨素-6作為原始材料制備。其實施過程同實施例1。
實施例4采用I型膠原蛋白和硫酸軟骨素-4作為原始材料制備。其實施過程同實施例1。
實施例5采用III型膠原蛋白和硫酸軟骨素-4作為原始材料制備。其實施過程同實施例1。
實施例6采用IV型膠原蛋白和硫酸軟骨素-4作為原始材料制備。其實施過程同實施例1。
權利要求
1.一種脊髓、周圍神經(jīng)修復材料的制備工藝，該脊髓、周圍神經(jīng)修復材料可膠原(I、III、IV型)與氨基聚糖(硫酸軟骨素-6或硫酸軟骨素-4)混合制成，在一定的低溫條件下，改變注有膠原-氨基聚糖混合物硅膠管降入冷淋液中速度和/或冷淋液溫度可以達到制備在內(nèi)部結構上具有微管徑大小不同和微管呈軸向均勻且平行的規(guī)律性排列的具有同方向微管型結構特性的新型脊髓、周圍神經(jīng)組織工程修復材料，其制作方法按以下步驟進行1)在制作中稱取一定量的膠原蛋白按27.5mg/ml放入0.05M(醋酸、鹽酸等，以下與此相同)酸性溶液中，在恒溫4℃環(huán)境中，以2000r/min，攪拌90min，制成懸濁液；2)再稱取氨基聚糖按1.33mg/ml加入0.05M酸性溶液中，同樣在恒溫4℃、2000r/min，攪拌90min，制成懸濁液；3)膠原與氨基聚糖混合比按所制材料應用需要，可以在(60-120)∶(1-2)之間調(diào)節(jié)，按比例混合兩種懸濁液，在4℃、2000r/min、繼續(xù)攪拌90min，制成膠原纖維和氨基聚糖懸濁液，將此懸濁液放入長頸燒瓶中，抽真空靜置30min。再將其注入硅膠管中(所制材料直徑可以在3mm-16mm之間調(diào)節(jié))，兩端封堵，順軸向放入冷淋劑中，并控制放入速度；a)調(diào)節(jié)浸入速度，速度分別為1.0×10-4m/s、1.0×10-5m/s……依次遞減至10×10-8m/s；從而得到相應溫度的各種速度下的膠原-氨基聚糖懸濁液冰晶圓柱體；b)調(diào)節(jié)冷淋液溫度在-10℃～-180℃之間任意變化，從而得到相應速度下的各種溫度下的膠原懸濁液冰晶圓柱體；c)注有懸濁液硅膠管每次保留于冷淋劑中30min～60min，將膠原-氨基聚糖懸濁液徹底冷凍結晶；d)將懸濁液-硅膠管冰凍體按應用要求切成短節(jié)段，取中央完整的放在鋁盤中，凍干(-30℃、100mtorr)24h，真空狀態(tài)下升溫至0℃保持24h；e)再繼續(xù)升溫至22℃保持45min-90min，解除真空，取出干燥的膠原基質(zhì)節(jié)段，最后將膠原基質(zhì)節(jié)段包入鋁箔小包中(開放)，放入烤箱，壓力為30mmHg、溫度為105℃、時間24h，然后取出將小包密封保存至干燥箱；f)通過改變冷凍速度和/或冷淋液溫度來控制材料內(nèi)微管的直徑和走行方向。
2.根據(jù)權利要求1所述的脊髓、周圍神經(jīng)修復材料的制備工藝，其特征在于，所述膠原—氨基聚糖混合物包括I、III、IV型膠原和硫酸軟骨素-6或硫酸軟骨素-4。
全文摘要
本發(fā)明所制出的新型脊髓、周圍神經(jīng)修復材料具有同方向微管型結構特性。按需制成不同的外型,如圓柱型,長方型等。具有以下特點:①材料的外表面為全封閉結構,可有效阻止體內(nèi)纖維結締組織的長入。②材料的微管徑大小可控制在30μm～200μm,有利于神經(jīng)再生纖維的生長;③微管的排列走行方向為軸向且相互間平行、均勻,有利于神經(jīng)再生纖維的定向延伸。本發(fā)明制備的脊髓、周圍神經(jīng)修復材料,既可直接植入修復脊髓、周圍神經(jīng)缺損;也可作為各種細胞移植的載體,攜帶不同的神經(jīng)生長因子及嗅鞘細胞、雪旺細胞和神經(jīng)干細胞等,用于修復脊髓、外周神經(jīng)節(jié)段性損傷、缺損。
文檔編號A61L29/04GK1380115SQ0211448
公開日2002年11月20日 申請日期2002年3月25日 優(yōu)先權日2002年3月25日
發(fā)明者羅卓荊, 章慶峻 申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學