專利名稱：多肽表達盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬生物技術領域，具體涉及一種可有效表達短肽的多肽表達盒及其構建方法，和其在疫苗分子設計中的應用。
抗原表位(epitope)是抗原分子中誘生不同免疫應答最基本的結構及功能單位。以精心篩選的T、B細胞抗原表位構建免疫分子，既可有目的地誘生各類不同的免疫反應，又避免了天然蛋白中抑制性抗原表位引起的免疫抑制現象，是新近預防及治療性疫苗研究的熱點。然而目前所報道的用于基因免疫的真核表達載體均不能表達短肽及抗原表位。其主要原因是缺乏合適的mRNA高效轉錄及轉錄后處理信號，缺乏框內轉譯起始及終止密碼?？乖砦换蚨屉牡幕蚬こ瘫磉_及免疫特性研究一直是近年分子免疫學研究的難點。
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是構建一種可以有效表達抗原表位或短肽的基因工程載體多肽表達盒(peptide expression cassette，pEC)，并通過以表位為基礎的基因免疫驗證這一表達盒的應用意義。
本發(fā)明的技術方案是通過以下步驟實現的1、擴增及合成pEC中真核表達調控元件及翻譯框架分別以PCR及寡核苷酸人工合成技術擴增或合成真核表達所必須的轉錄調控元件如啟動子、增強子、內含子、轉錄終止信號等，及翻譯框架包括翻譯起始碼、抗原表位克隆位點、翻譯終止碼等。
2、構建及鑒定多肽表達盒(pEC)以pUC19載體(市售)為骨架，分別將上述真核表達調控元件及翻譯框架克隆于該骨架中，構建一可高效轉錄及翻譯抗原短肽的多肽表達盒pEC。在該pEC中，在HCMVIE1啟動子上游插入一～480bp的增強子復合體(enhancercomplex)，其中含有多個轉錄因子結合位點，可提高mRNA轉錄水平及保證增強子作用的高效及廣泛性；在HCMV IE1啟動子下游插入一～820bp的內含子A，以提供有效的轉錄后處理信號，避免mRNA不正確的剪切；以BGH基因3’端序列提供轉錄終止信號；內含子A下游插入GCCACCATGGAATTCTAATAG序列，分別提供Kozak真核表達增強序列、框內起始密碼、EcoRI克隆位點及雙終止密碼；在pUC19中去除Lac操縱子，提高了整個質粒在宿主菌中的穩(wěn)定性及其復制水平，為大量制備質粒DNA提供了可能。經PCR、限制性內切酶酶切及DNA序列測定，其序列和組成插入方向均正確。
3、pEC在基因免疫中的應用及驗證3.1 pEC可克隆表達一B細胞抗原表位，基因免疫后可誘導特異性抗體應答人工合成鴨乙肝病毒B細胞抗原表位P127-138編碼基因b1(AATTGGGGGA CGATCCACTC CTGGGAAATC AGTCTCTCCT CG)和b2(AATTCGAGGA GAGACTGATT TCCCAGGAGT GGATCGTCC CCG)，退火后克隆于pEC EcoRI位點，是為pEC-B。經體外轉染C2C12細胞，DOT-EIA檢測發(fā)現在細胞轉染24、48、60、72小時后，其上清中均檢測出該B細胞抗原表位。以pEC-B DNA直接基因免疫C57BL/6和Balb/c小鼠，結果誘生了DHBV特異性抗體應答，表明PECK不僅可有效地表達B細胞表位多肽，同時還可以基因免疫的方式誘生特異性免疫應答。
3.2 pEC可克隆表達一CTL抗原表位，基因免疫后可誘導特異性CTL應答人工合成乙肝病毒CTL抗原表位C17-28編碼基因C1(AAT TTTTGC CTT CTG ACT TCT TTC CTT CTA TTG)和C2(AAT TCA ATA GAA GGAAAG AAG TCA GAA GGC AAA)，退火后克隆于pEC EcoRI位點，是為pEC-C18。經體外轉染C2C12細胞，DOT-EIA檢測發(fā)現在細胞轉染24、48、60、72小時后，其上清中均檢測出該CTL抗原表位。以pEC-18DNA直接基因免疫C57BL/6、C3H和Balb/c小鼠，結果誘生了DHBV特異性抗體應答，表明pEC不僅可有效地表達CTL表位多肽，同時還可以基因免疫的方式誘生特異性細胞免疫應答。本發(fā)明具有如下特點1、本發(fā)明的載體質粒是一種可有效表達抗原多肽的載體質粒(pEC)
2、該質粒中除含有常規(guī)真核轉錄元件如HCMV IE1啟動子、增強子復合體、內含子A及BGH基因外，還含有一特定的序列AGATCTGCCACCATGGAATTCTAGTAAGATCT，其中GCCACC為真核表達增強序列Kozak、ATG為框內起始密碼、GAATTC為EcoRI單一克隆位點、TAGTAA為雙終止密碼。同時該質粒還去除了Lac操縱子3、該質?？煽寺『陀行П磉_如鴨乙肝病毒B細胞表位和乙肝病毒CTL表位等短肽4、克隆于該載體中的各類短肽如B細胞表位和CTL表位，在基因免疫中可誘生相應的特異性免疫應答，表明該質?？捎糜谝员砦粸榛A的基因免疫
權利要求
1.一種多肽表達盒，其特征是含有的載體質粒是可有效表達抗原多肽的載體質粒pEC。
2.按權利要求1所述的多肽表達盒，其特征是所述的載體質粒中除含有常規(guī)真核轉錄元件基因外，還含有特定的序列AGATCTGCCACCATGGAATTCTAGTAAGATCT，其中GCCACC為真核表達增強序列Kozak、ATG為框內起始密碼、GAATTC為EcoRI單一克隆位點、TAGTAA為雙終止密碼，所述的載體質粒去除了Lac操縱子。
3.按權利要求1所述的多肽表達盒，其特征是通過以下步驟實現a)分別以PCR及寡核苷酸人工合成技術擴增或合成真核表達轉錄調控元件啟動子、增強子、內含子、轉錄終止信號等，及翻譯框架翻譯起始碼、抗原表位克隆位點、翻譯終止碼等，b)分別將上述真核表達調控元件及翻譯框架克隆于pUC19載體骨架中，構建可高效轉錄及翻譯抗原短肽的多肽表達盒pEC，其中，在HCMV IE1啟動子上游插入～480bp的增強子復合體；在HCMV IE1啟動子下游插入～820bp的內含子A，以BGH基因3’端序列提供轉錄終止信號；內含子A下游插入GCCACCATGGAATTCTAATAG序列，分別提供Kozak真核表達增強序列、框內起始密碼、EcoRI克隆位點及雙終止密碼；在pUC19中去除Lac操縱子，c)進行PCR、限制性內切酶酶切及DNA序列測定，d)驗證多肽表達盒，pEC克隆表達一B細胞抗原表位，基因免疫后誘導特異性抗體應答，pEC克隆表達一CTL抗原表位，基因免疫后誘導特異性CTL應答。
4.按權利要求1所述的多肽表達盒在疫苗分子設計中的應用。
全文摘要
本發(fā)明屬生物技術領域,具體涉及一種可有效表達短肽的多肽表達盒及其構建方法,和其在疫苗分子設計中的應用。本發(fā)明含有可有效表達抗原多肽的載體質粒,該質?？煽寺『陀行П磉_如鴨乙肝病毒B細胞表位和乙肝病毒CTL表位等短肽,克隆于該載體中的各類短肽,在基因免疫中可誘生相應的特異性免疫應答,可用于以表位為基礎的基因免疫。
文檔編號A61K39/00GK1356391SQ0113223
公開日2002年7月3日 申請日期2001年11月19日 優(yōu)先權日2001年11月19日
發(fā)明者熊思東, 徐薇, 徐煥賓, 儲以微 申請人:復旦大學