專利名稱：圣塔景天的制作方法
圣塔景天是景天科，圣塔屬，種名為綠葉大花圣塔(簡(jiǎn)稱圣塔景天)，(Cotyledonmacrantha De Smet var，vivescens(Sohoent.et.Bak.f.)V.Poelln縮寫為CMSVP)，高60～80cm，莖直徑4～5cm，形似小樹，葉片肥厚，葉寬14cm，長(zhǎng)18cm，鮮葉均重52.5g，樹冠直徑為34cm。
常綠多年生肉質(zhì)半灌木，高約1米，莖肥厚呈園柱略彎曲狀，具向光性，莖部稍木質(zhì)化，多二歧對(duì)稱分枝成一整齊美觀挺拔樹形，枝節(jié)從根部周圍分枝，主干無(wú)分權(quán)，根呈須發(fā)狀，隨樹長(zhǎng)高，莖部大葉慢慢變黃呈黑干狀，向下卷曲枯萎脫落，脫落后的主莖上留有口唇狀疤痕，葉對(duì)生，無(wú)柄，貼莖，尖端初生嫩葉肥厚呈凹狀，下部葉大而肥厚呈凸?fàn)睿孤殉仔?，葉長(zhǎng)18～20cm，寬14～16cm，尖端園闊，靠莖部漸漸變窄呈匙狀，最大葉重約60g，整株葉為12片。
原產(chǎn)南非，世界各地均栽培，為觀賞植物，以其樹姿挺拔、壯麗著稱。生長(zhǎng)較快，扦插與組織培養(yǎng)繁殖極易成活，我國(guó)多喜栽為盆景。
本發(fā)明的圣塔景天的提取液或原粉對(duì)抗腫瘤和增強(qiáng)免疫效應(yīng)，降血糖等作用分別敘述如下1、CMSVP提取液或原粉制造實(shí)施例1.1、實(shí)施例1取洗凈的圣塔景天葉子1kg，粉碎后，用石油醚(30-60)回流脫脂2h，殘?jiān)糜?升無(wú)離子水，煮沸0.5h，過濾，殘?jiān)^續(xù)重復(fù)上述操作3次，合并4次濾液，濃縮至小體積，加氯仿(A、R)至分層，沉淀?xiàng)壍鞍?，上層溶液濃縮至小體積，濃縮，烘烤，得圣塔景天(CMSVP)原粉，產(chǎn)量22.86g，收率2.29％。(見附

圖1-1)。1.2、實(shí)施例2取鮮CMSVP葉子或莖500g溶于2升無(wú)離子水，加熱煮沸5分鐘，過濾，濾液濃縮至小體積，將上述操作重復(fù)3次，合并4次濾液，濃縮至含10g/ml鮮圣塔景天(CMSVP)原粉供抗腫瘤與增強(qiáng)免疫實(shí)驗(yàn)使用。2、圣塔景天(CMSVP)的抗腫瘤作用和對(duì)免疫功能增強(qiáng)效應(yīng)2.1、實(shí)驗(yàn)材料與方法2.1.1藥品與主要試劑
CMSVP提取液和原粉均由北京泰達(dá)士生物化學(xué)研究所提供。刀豆蛋白A購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，3H-TdR購(gòu)自中國(guó)原子能科學(xué)研究院，強(qiáng)度1mCi(3.7×106kbp)。細(xì)菌脂多糖由北京生物制品研究所提供。其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。2.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和瘤株昆明小鼠，8周齡，體重19-21g，雌雄各半；C57BL/6小鼠，8周齡，體重19-21g，雌雄各半；均由北京大學(xué)動(dòng)物學(xué)部提供。小鼠黑色素瘤B16、小鼠Lewis肺癌接種于C57BL/6小鼠；小鼠肉瘤S180和艾氏腹水癌接種于昆明小鼠，以上細(xì)胞株均由中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供。2.2、實(shí)驗(yàn)方法2.2.1體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn)剝離小鼠腋下傳代的黑色素瘤B16和Lewis肺癌的瘤快，取生長(zhǎng)良好的腫瘤組織研磨成腫瘤勻漿，以0.2ml/只接種于C57BL/6小鼠腋下。無(wú)菌取腹腔內(nèi)傳代7d肉瘤S180和艾氏腹水癌細(xì)胞，生理鹽水洗滌3次，以1×106細(xì)胞接種于昆明小鼠腋下。接種后次日起灌胃給予CMSVP提取液，每日1次連續(xù)10d(劑量見表2-1)。以氮烯咪胺(DTIC)作為小鼠黑色素瘤B16的陽(yáng)性對(duì)照組，其余均用環(huán)磷酰胺(CTX)作為陽(yáng)性對(duì)照藥，于第1、3、5、9天腹腔注射給藥。第11天脫頸處死小鼠，稱瘤重，計(jì)算腫瘤生長(zhǎng)抑制率(Inhibition Rate，IR)。2.2.2脾細(xì)胞對(duì)絲裂原ConA反應(yīng)的影響制備脾細(xì)胞懸液，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度5×106個(gè)/ml)。向96孔板中加入脾細(xì)胞懸液0.2μl/孔，ConA 100μl/孔(終濃度為5μl/ml)，同時(shí)設(shè)自身對(duì)照(不含ConA)。培養(yǎng)72h，終止培養(yǎng)前6h加入3H-TdR 20μl/孔(含0.4μCi)。收集細(xì)胞于濾膜上，烤干，在液閃儀上測(cè)定3H-TdR摻入量。結(jié)果刺激指數(shù)(Stimulation Index，SI)表示。2.2.3 NK細(xì)胞活性測(cè)定取生長(zhǎng)良好的L929細(xì)胞(作為靶細(xì)胞)加到96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)2h，使細(xì)胞貼壁成單層細(xì)胞。再加入上述脾細(xì)胞懸液0.1ml/孔，對(duì)照組只加入靶細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)20h后用生理鹽水洗滌3次，每孔加入0.2ml 0.5％中性紅染液，培養(yǎng)30min，棄染液洗滌3次，每孔加細(xì)胞溶解液20μl，輕輕搖均，用酶標(biāo)儀在492nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。結(jié)果以NK細(xì)胞殺傷率表示。2.2.4脾細(xì)胞分泌的TNF活性測(cè)定
24孔培養(yǎng)板中加入脾細(xì)胞懸液1ml(終濃度2.5×106ml-1)，ConA 1ml(終濃度5mg/ml)，培養(yǎng)48h，收上清做為待測(cè)TNF樣品。在96孔培養(yǎng)板中加入TNF樣品100μl和L929細(xì)胞100μl(終濃度2.5×106ml-1)，同時(shí)設(shè)靶細(xì)胞對(duì)照。以下步驟同NK細(xì)胞活性測(cè)定。結(jié)果以細(xì)胞殺傷率表示。2.2.5腹腔巨噬細(xì)胞分泌的TNF活性測(cè)定制備小鼠腹腔巨噬細(xì)胞懸液，并以1ml/孔(濃度為1×106ml-1)，加入24孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)4h，洗耳恭聽去懸浮細(xì)胞，加入10μl LPS繼續(xù)培養(yǎng)20h，取上清作為TNF待測(cè)樣品，活性測(cè)定方法同脾細(xì)胞分泌的TNF活性檢測(cè)。2.2.6腹腔巨噬細(xì)胞細(xì)胞毒活性的檢測(cè)用3H-TdR標(biāo)記L929細(xì)胞(靶細(xì)胞)。將制備好的腹腔巨噬細(xì)胞懸液加入96孔培養(yǎng)板中，100μl/孔(濃度為1×106個(gè)/ml-1)，培養(yǎng)4h，洗去懸浮細(xì)胞，加入10μl/ml LPS繼續(xù)培養(yǎng)8h，加入3H-TdR標(biāo)記的L929細(xì)胞100μl(效靶比為5∶1)，同時(shí)設(shè)靶細(xì)胞對(duì)照孔，培養(yǎng)20h，吸取上清100μl，檢測(cè)放射活性，計(jì)算細(xì)胞殺傷率(cytotoxiciry)。以上培養(yǎng)均為5％CO2、37℃培養(yǎng)，每個(gè)樣品均設(shè)3復(fù)孔。2.3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.3.1 CMSVP的體內(nèi)抑瘤作用對(duì)小鼠黑色素瘤B16、Lewis肺瘤S180和艾氏腹水癌(EAC)均有抑制作用，且有一定的劑量依賴關(guān)系。高劑量CMSVP對(duì)各種腫瘤的抑瘤率均大于30％，對(duì)黑色素瘤B16的抑制作用為最強(qiáng)，抑瘤率達(dá)到50％以上，高于陽(yáng)性藥組(見表2-1)。
表2-1 體內(nèi)抑制腫瘤生長(zhǎng)作用
與陽(yáng)性對(duì)照組比較1)P＜0.052)P＜0.013)P＜0.0014)指CMSVP鮮重提取液配制2.3.2 CMSVP對(duì)小鼠免疫功能的影響CMSVP治療10d后，conA誘導(dǎo)的脾細(xì)胞增殖反應(yīng)對(duì)NK細(xì)胞活性無(wú)顯著影響；小鼠脾細(xì)胞分泌的TNF量明顯升高；腹腔巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒活性明顯增強(qiáng)，分泌的TNF活性也增加(見表2-2)。
表2-2 CMSVP對(duì)荷瘤小鼠免疫功能的影響(n＝8)
2.4、實(shí)驗(yàn)討論本發(fā)明實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明圣塔景天(CMSVP)提取液或原粉具有良好的抗腫瘤作用，0.80g/kg和1.20g/kg的CMSVP對(duì)上述各瘤株的抑瘤率均達(dá)到30％以上，其中的黑色素瘤B16的抑瘤作用最強(qiáng)，1.2g/kgCMSVP的抑瘤達(dá)到50％以上，高于陽(yáng)性對(duì)照組DTIC。CMSVP對(duì)荷瘤小鼠的NK細(xì)胞和ConA誘導(dǎo)的脾細(xì)胞增殖反應(yīng)均無(wú)明顯作用(P＞0.05)，說(shuō)明CMSVP對(duì)機(jī)體的細(xì)胞免疫無(wú)明顯作用。腫瘤壞死因子(TNF)是一種多功能細(xì)胞因子，可以通過直接殺傷腫瘤細(xì)胞、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和介導(dǎo)免疫應(yīng)答等途徑起到抗腫瘤作用。CMSVP可明顯促進(jìn)脾細(xì)胞和腹腔巨噬細(xì)胞分泌TNF，并增加巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒活性，說(shuō)明CMSVP可提高機(jī)體的非特異性免疫功能，通過TNF等細(xì)胞因子發(fā)揮抗腫瘤作用。TNF在體外或體內(nèi)局部用藥時(shí)抑瘤作用較強(qiáng)，用藥物誘導(dǎo)機(jī)體巨噬細(xì)胞，特別是腫瘤細(xì)胞處于一定程度激活狀態(tài)的巨噬細(xì)胞及其它免疫細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)源性TNF是腫瘤藥物治療中值得重視的途徑。CMSVP在這方面顯示了良好的開發(fā)前景。
CMSVP可以誘導(dǎo)人黑色素瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，其抗腫瘤作用有一定的特異性。說(shuō)明除本實(shí)驗(yàn)證實(shí)地增強(qiáng)機(jī)體非特異性免疫功能外，CMSVP還有其它的抗腫瘤機(jī)制，對(duì)此我們將做進(jìn)一步的深入研究。3、CMSVP原粉對(duì)糖尿病(DM)小鼠高血糖的防治作用3.1、實(shí)驗(yàn)材料3.1.1動(dòng)物體重18～24g雄性昆明種小鼠，由北京大學(xué)動(dòng)物學(xué)部提供，提取得CMSVP原粉。實(shí)驗(yàn)時(shí)用生理鹽水配成所需濃度。3.1.2實(shí)驗(yàn)方法3.1.2.1 實(shí)驗(yàn)性四氧嘧啶糖尿病動(dòng)物模型的制備四氧嘧啶溶于生理鹽水，由小鼠尾靜脈注入，劑量為100mg/kg。3.1.2.2 血糖測(cè)定各實(shí)驗(yàn)鼠禁食6～8h后自尾部采血0.04ml，用鄰甲苯胺法測(cè)血漿葡萄糖濃度。3.2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.2.1 預(yù)防性給予CMSVP原粉對(duì)四氧嘧啶糖尿病小鼠血糖的影響小鼠在注射四氧嘧啶前4h，口服CMSVP原粉對(duì)照組給等量生理鹽水。注射四氧嘧啶后72h測(cè)定血糖，結(jié)果見表3-1，預(yù)先4h給予300和800mg/kg組小鼠血糖升高幅度明顯降低，與對(duì)照組比較，有顯著性差異。預(yù)先1h給予300mg/kg藥物，對(duì)小鼠血糖升高幅度降低不明顯。表3-1 CMSVP原粉對(duì)四氧嘧啶引起高血糖作用的影響
1)P＜0.052)P＜0.013.2.2 CMSVP原粉對(duì)正常小鼠血糖的影響測(cè)定正常小鼠空腹血糖，而后灌胃藥物。分別于給藥后不同時(shí)間測(cè)定血糖，結(jié)果見表3-2，300mg/kg劑量對(duì)正常小鼠血糖有降低作用。3.2.3 CMSVP原粉對(duì)糖尿病(DM)小鼠血糖的影響小鼠注入四氧嘧啶后72h，測(cè)定空腹血糖，然后口服藥物。分別于給藥后1，4，7和24h測(cè)定血糖，結(jié)果見表3-2，實(shí)驗(yàn)表明，劑量100和300mg/kg能明顯降低四氧嘧啶糖尿病小鼠血糖水平?？诜﨏MSVP原粉后4～7h，降血糖作用最明顯，血糖降低率最強(qiáng)可達(dá)50％，24h仍有作用。說(shuō)明該藥降血糖作用持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)。表3-2 CMSVP原粉對(duì)正常小鼠和四氧嘧啶糖尿病小鼠血糖的作用
1)P＜0.052)P＜0.013.2.4 CMSVP原粉對(duì)四氧嘧啶糖尿病小鼠飲水量的影響小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組與給藥組。注射四氧嘧啶后48h，給藥組口服CMSVP原粉100mg/kg，每日2次，連續(xù)3d。對(duì)照組給等量生理鹽水。記錄給藥后小鼠不同時(shí)間的飲水量，并比較兩組間差別。結(jié)果見表3-3。由此表明，該CMSVP原粉顯著減少小鼠24～48，48～72h的飲水量，與對(duì)照組比較差異有顯著性。表3-3 CMSVP對(duì)四氧嘧啶糖尿病小鼠飲水量的影響
1)P＜0.052)P＜0.013.2.5 CMSVP原粉對(duì)糖尿病小鼠30天喂養(yǎng)血糖的影響糖尿病模型制作同上，陽(yáng)性對(duì)照組小鼠11只，給藥組小鼠11只，按100mg/kg灌胃給藥(CMSVP)，陽(yáng)性對(duì)照組灌等量的生理鹽水。表3-4 CMSVP原粉對(duì)DM小鼠30天喂養(yǎng)血糖的影響(n＝11) 從表3-4可見陽(yáng)性對(duì)照組給藥僅給等量生理鹽水，給生理鹽水后血糖僅為自然下降，一部分還繼續(xù)上升，而給藥CMSVP原粉30天后血糖基本恢復(fù)至正常值。3.3、附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明圖1-1是從鮮CMSVP葉提取CMSVP的生產(chǎn)工藝圖1-2是從鮮CMSVP葉提取成濃度為10g/ml鮮CMSVP的生產(chǎn)工藝3.4、實(shí)驗(yàn)討論四氧嘧啶能選擇性地破壞胰島β細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)表明CMSVP原粉對(duì)四氧嘧啶引起的糖尿病有明顯預(yù)防作用，這一作用可能是CMSVP原粉減弱四氧嘧啶對(duì)胰島β細(xì)胞損傷所致。CMSVP原粉對(duì)正常及四氧嘧啶誘發(fā)小鼠高血糖都有非常明顯降低作用，用CMSVP對(duì)糖尿病小鼠進(jìn)行30天喂養(yǎng)結(jié)果，表明CMSVP原粉可部分或基本修復(fù)β-細(xì)胞分泌胰島素的功能。本發(fā)明的CMSVP原粉可試用于糖尿病患者的治療，對(duì)糖尿病病人多飲多食癥狀也會(huì)明顯改善。CMSVP原粉能減少糖尿病小鼠飲水量，這一作用對(duì)于緩解病人的癥狀也是相當(dāng)有益的。
權(quán)利要求
1.本發(fā)明的圣塔景天提取物或原粉具有極好的抗腫瘤、增強(qiáng)免疫、降血糖的效果。
2.按權(quán)利要求1所述，提取圣塔景天的溫度為煮沸(即100℃)。
3.按權(quán)利要求1所述，抗腫瘤、增強(qiáng)免疫臨床推薦量為100～400mg/天，預(yù)防腫瘤、糖尿病臨床推薦量為40～100mg/日/人。
4.按權(quán)利要求2所述，圣塔景天用于提取的可以是葉子、莖乃至全株。
全文摘要
本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的圣塔景天提取物或原粉具有極好的抗腫瘤和免疫增強(qiáng)效應(yīng)以及降血糖效果。本發(fā)明涉及保健食品、醫(yī)藥品及新功能型食品,圣塔景天原粉可作保健食品廠、藥廠開發(fā)增強(qiáng)免疫、預(yù)防腫瘤和糖尿病的發(fā)生的最適合的產(chǎn)品之一。
文檔編號(hào)A61P35/00GK1359688SQ00128218
公開日2002年7月24日 申請(qǐng)日期2000年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2000年12月18日
發(fā)明者丁慶 申請(qǐng)人:丁慶