專利名稱：葉酸－多聚糖復(fù)合物,其制備方法和以該復(fù)合物為活性成分的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及葉酸與多聚糖的復(fù)合物及其制備方法，特別是涉及葉酸與右旋糖酐的復(fù)合物及其制備、以該復(fù)合物為活性成分的藥物組合物，以及該復(fù)合物在腫瘤治療中的應(yīng)用。
自從提出特異性葉酸結(jié)合蛋白(FBP)概念[Johns et alJ Clin Invest1961；401684]以后，Rothenberg等人首先在人體細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)FBP[ProcSoc Expl Biol Med 1970；133428.J Clin Invest 1971；50717]，Lesli等人也從細(xì)胞膜中分離出FBP[Biochem 1972；111696]。而Antony等人通過(guò)對(duì)胎盤細(xì)胞的系統(tǒng)研究，明確提出了這種FBP在細(xì)胞膜上具備葉酸受體(FR)功能[J Biol Chem 1981；256(18)9684]，并陸續(xù)系統(tǒng)地闡明了FR的生物化學(xué)特性[Blood 1992；79(11)2807.Annu Rev Nutr1996；16501]。FR是一種被錨在細(xì)胞膜中甘油磷脂酰肌醇(GPI)上的FBP，其可被GPI特異性磷脂酶C或D從細(xì)胞膜上切除[Lee et alBiochem 1992；313236.Verma et alJ Biol Chem 1992；267(6)4119]。FR較均勻散布于細(xì)胞膜表面，結(jié)合葉酸后，在促發(fā)劑作用下移入被膜小凹(coated pits)或凹穴(coveolae)內(nèi)集束[Mayor et alScience 1994；2641948]，隨之發(fā)生細(xì)胞內(nèi)吞，將葉酸傳輸至胞內(nèi)[Anderson et alScience 1992；255410]。
人的FR主要有三種異構(gòu)形式，即FR-α、FR-β和FR-γ，其中FR-γ是一種表達(dá)在造血細(xì)胞上的分泌蛋白[Shen et alBiochem1995；345660]。動(dòng)物細(xì)胞表面也存在FR-1和FR-2異構(gòu)體，F(xiàn)R-1主要表達(dá)在腫瘤細(xì)胞和腎細(xì)胞上，F(xiàn)R-2表達(dá)在肝細(xì)胞上。葉酸對(duì)細(xì)胞的親和性和密度具有一定調(diào)節(jié)作用，限制葉酸食用量，F(xiàn)R-1對(duì)葉酸親和性降低，但其在腫瘤細(xì)胞中密度增加，而在腎細(xì)胞中減少，F(xiàn)R-2則影響不大[Gates et alClin Cancer Res 1996；21135]。
隨著多數(shù)腫瘤細(xì)胞表面FR表達(dá)數(shù)目或活性顯著高于正常細(xì)胞的事實(shí)逐漸被揭示[Campbell et alCancer Res 1991；515329.Coney etalCancer Res 199l；516125.Weitman et alCancer Res1992；5233961。以葉酸介導(dǎo)靶向腫瘤細(xì)胞的研究得到了迅速發(fā)展。
葉酸作為FR配體與放射性核素直接或間接連接而成的復(fù)合物，在腫瘤影像診斷方面的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，腫瘤部位靶向效果顯著[Low et alWO96/36367 Nov.21，1996；USA 5688488 Nov.18，1997]。葉酸間接與脂質(zhì)體表面結(jié)合生成的葉酸-PEG-脂質(zhì)體細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果表明，其靶向腫瘤細(xì)胞效果明顯好于PEG-脂質(zhì)體或普通脂質(zhì)體[Lee et alJ Biol Chem 1994；269(5)3198.Wang et alProc Natl AcadSci USA 1995；923318.Lee et alBiochim Biophys Acta 1995；1233134.Vogel et alJ Am Chem Soc 1996；118(7)1581.Thompson et alWO97/31624 Sep.4，1997.陸偉躍等上海醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)200O；27(1)4]。
葉酸與高分子復(fù)合物也可通過(guò)FR將高分子完整地傳釋至細(xì)胞內(nèi)的非溶酶體漿質(zhì)中。與葉酸復(fù)合的牛血清白蛋白、牛免疫球膽白、辣根過(guò)氧化酶、核糖核酸酶、豆絲氨酸酶抑制劑和抗DNA寡核苷酸均能明顯導(dǎo)入KB細(xì)胞(人鼻咽癌細(xì)胞)、HeLa細(xì)胞(人宮頸癌細(xì)胞)和XC細(xì)胞(Rous肉瘤病毒轉(zhuǎn)染的成纖維細(xì)胞)發(fā)揮其相應(yīng)效果[Leamon et alProc Natl Acad Sci USA 1991；885572.Low et alWO90／2096 Oct.18，1990]。結(jié)合葉酸的抗T細(xì)胞受體單克隆抗體或抗Fc受體單克隆抗體能將腫瘤細(xì)胞與T細(xì)胞或天然殺傷細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞緊密地撮合在一起，達(dá)到有效溶解腫瘤細(xì)胞目的[David et alWO96/34630 Nov.7，1996]。而具有抑制蛋白合成功能的毒素[木鱉子皂甙(Momordin)-一種只有透過(guò)核糖體到達(dá)細(xì)胞漿才表現(xiàn)出細(xì)胞毒性的蛋白毒素；假單胞菌外毒素片段(LysPE38和CysPE35)]與葉酸復(fù)合后，其抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)能力極大增強(qiáng)[Leamon et alJ Biol Chem1992；267(35)249666.1993；268(33)24847]。
右旋糖酐(又名葡聚糖)是一種由蔗糖通過(guò)腸膜狀明串珠菌發(fā)酵而制成的D-葡萄糖聚合物[Gronwall et alActa Physiol Scand1944；797.1945；91.USA 2437518.USA 2644815]。所用菌種不同，產(chǎn)生的右旋糖酐中葡萄糖基連接方式有所差異，但主要以α-1，6鍵連接為主，其余為α-1，4或α-1，3鍵[Van Cleve et alJ Am Chem Soc1956；784435.許丹楓等藥學(xué)學(xué)報(bào)1986；21(3)，204]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)追蹤結(jié)果均表明，輸注右旋糖酐后，動(dòng)物實(shí)質(zhì)性器官未見(jiàn)異常和組織損傷[Boyd et alLancet 1953；159.Gronwall et alActa PhysiolScand 1945；91]，人體肝、脾、腎、肺等器官未見(jiàn)右旋糖酐蓄積[Wilkinson et alJ Interal chir 1951；11186]。臨床上，右旋糖酐主要作為血容量擴(kuò)脹劑[Gelin et alActa Chir Scand 1961；122309]和血液流動(dòng)性改善劑[GelinSock Pathogenesis and Therapy 1962；P332]，用于失血性休克、燒傷和肝腎綜合征，急性血栓、血栓性閉塞脈管炎，心肌梗塞，全身性硬化癥等。
鑒于右旋糖酐生物特性及其分子結(jié)構(gòu)的多羥基特點(diǎn)，其曾被作為各種藥物的載體，以達(dá)到增強(qiáng)藥物的化學(xué)穩(wěn)定性，或提高藥物生物有效性，或用于淋巴系統(tǒng)疾患診斷的目的。這些右旋糖酐-藥物復(fù)合物包括右旋糖酐銻[Mikhail et alExptl Parasitol 1975；37348]，右旋糖酐鐵[Beresford et alBrit J Pharmacol 1957；12107]，右旋糖酐-胰島素[Armstrong et alBiochim Biophys Res Comm 1972；47354]，右旋糖酐-柔毛霉素[Bernsten et alJ Nalt Cancer Inst 1978；60(2)379]，右旋糖酐-絲裂霉素C[Kojima et alJ Pharmacol 1980；3230]，右旋糖酐-維生素B12，[Scrollini et alEur J Med Chem 1974；9621]，右旋糖酐-甲氨喋呤[Hubert et alEP 0383170A2]，右旋糖酐-α(或β)-淀粉糖化酶(或胰蛋白酶)[Marshall et alArch Biochem Biophys 1975；167777]，右旋糖酐硫酸酯[Kozo Yamada et alJap Circul J 1961；25570，575，579]，放射性锝(99mTc)-右旋糖酐[Henze et alJ Nucl Med 1982；23923.Ercan etalEur J Nucl Med 1985；1180.陸偉躍等上海醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)1991；18(4)246.劉永昌等中華核醫(yī)學(xué)雜志1993；13(3)143]。其中發(fā)明人研制開(kāi)發(fā)的主要用于淋巴系統(tǒng)疾患定位和腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移輔助診斷的99mTc-右旋糖酐105注射液及其注射用亞錫右旋糖酐105已正式生產(chǎn)和臨床使用。
綜上所述，腫瘤細(xì)胞膜表面FR是一條可通過(guò)葉酸將包括放射性核素、脂質(zhì)體和高分子等藥物導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)的有效途徑；右旋糖酐的研究歷史悠久，主要用作血容量擴(kuò)脹劑和作為抗腫瘤藥物、放射性核素等藥物的載體研究，未見(jiàn)其本身具有抗腫瘤作用。迄今為止，葉酸與多聚糖的復(fù)合物，尤其是與右旋糖酐的復(fù)合物及其作為抗腫瘤藥物研究尚未見(jiàn)任何文獻(xiàn)或?qū)＠麍?bào)道。
本發(fā)明目的是提供一類葉酸-多聚糖復(fù)合物，其可循細(xì)胞膜上葉酸受體途徑入胞，殺死體內(nèi)腫瘤細(xì)胞、抑制腫瘤組織生長(zhǎng)，同時(shí)又不損傷正常組織；本發(fā)明也提供葉酸-多聚糖復(fù)合物的制備方法；本發(fā)明還提供一種以該復(fù)合物為活性成分的藥物組合物；本發(fā)明進(jìn)一步提供該復(fù)合物在制備抗腫瘤藥物中的用途。
為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明和達(dá)到上述發(fā)明目的，采用了如下技術(shù)方案。
1.葉酸-多聚糖合成將葉酸或葉酸衍生物或其它可循細(xì)胞膜上葉酸受體途徑進(jìn)入細(xì)胞的物質(zhì)與不同種類、分子量從4，000到2000，000的多聚糖在吡啶類催化劑和碳化二亞胺類脫水劑作用下，縮合成葉酸-多聚糖復(fù)合物。本發(fā)明用下述通式表示X-Y其中X代表葉酸及其衍生物或其它可循細(xì)胞膜上葉酸受體途徑進(jìn)入細(xì)胞的物質(zhì)；Y代表不同種類多聚糖。
本發(fā)明所涉及的葉酸及其衍生物或其它可循細(xì)胞膜上葉酸受體途徑進(jìn)入細(xì)胞的物質(zhì)，其對(duì)動(dòng)物或人體細(xì)胞無(wú)明顯毒副作用，它們包括葉酸、亞葉酸、二氫葉酸、四氫葉酸，四氫蝶呤、蝶酰多谷氨酸、2-去氨基-羥基葉酸、1-去氮葉酸、3-去氮葉酸、8-去氮葉酸等。其中，某位“去氮”是指葉酸中該位氮原子被碳原子取代的意思。
本發(fā)明所涉及的不同種類多聚糖，其對(duì)動(dòng)物或人體腫瘤細(xì)胞或腫瘤組織生長(zhǎng)無(wú)明顯直接抑制活性，本身也不具備受體的配體性質(zhì)，這些多聚糖包括①葡聚糖類，如右旋糖酐，黑曲霉多糖，茁霉多糖，小核菌葡聚糖，香菇多糖，云芝多糖，茯苓多糖，茯苓異多糖，痂囊腔多糖，蟲(chóng)草多糖，豬苓多糖，蘑菇多糖，裂褶多糖，亮菌多糖，喉頭菇多糖，銀耳多糖，粗糙脈孢多糖，鬼傘多糖，地衣多糖，異地衣多糖，昆布多糖，許長(zhǎng)卿多糖，當(dāng)歸多糖，漢防己多糖，黃芪多糖，海帶膠多糖，直鏈淀粉，糊精等；②聚蔗糖類，如聚蔗糖；③果聚糖類，如黃精多糖、石蒜多糖、大麥多糖和海浜海蔥多糖等的菊糖，梯牧草多糖和匍匐冰草多糖等的左旋唐酐；④雜聚多糖類，如枝孢多糖，變異青霉多糖，犁頭霉多糖，粗糙脈孢外多糖，靈芝多糖，紫菜多糖，刺五加多糖，魔芋多糖，人參多糖，箬竹多糖，蔗渣多糖，枸杞多糖，女貞子多糖，竹黃多糖，茶葉多糖等；⑤單或雜聚多糖硫酸酯類，如瓊脂多糖，角叉多糖，銀杏藻多糖，綠藻多糖，巖藻多糖，肝素，硫酸軟骨素等；⑥單或雜聚糖醛酸多糖類，如人參果膠多糖及其它果膠多糖，阿拉伯膠，西黃蓍膠，印度膠，黃芪膠，海藻酸鹽等；⑦其它親水性醇類高聚物，如聚乙二醇，甲氧基聚乙二醇等。
2.葉酸-多聚糖循葉酸受體途徑導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞的論證葉酸-右旋糖酐標(biāo)記上熒光素作為模型藥物，進(jìn)行體外腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)。通過(guò)測(cè)定腫瘤細(xì)胞對(duì)不同培養(yǎng)濃度下的葉酸-右旋糖酐攝取量變化及其與單純右旋糖酐攝取量的區(qū)別、相同培養(yǎng)濃度和不同培養(yǎng)時(shí)間下的葉酸-右旋糖酐攝取量變化，了解腫瘤細(xì)胞對(duì)葉酸-右旋糖酐的攝取是否有明顯的飽和趨勢(shì)及其攝取量明顯高于右旋糖酐程度；通過(guò)測(cè)定腫瘤細(xì)胞對(duì)相同培養(yǎng)濃度和相同培養(yǎng)時(shí)間下的培養(yǎng)液中含不同游離葉酸的葉酸-右旋糖酐攝取量變化，了解游離葉酸是否能明顯競(jìng)爭(zhēng)性抑制葉酸-右旋糖酐的攝?。煌ㄟ^(guò)用不同濃度磷脂酶D對(duì)腫瘤細(xì)胞預(yù)處理后，測(cè)定腫瘤細(xì)胞對(duì)葉酸-右旋糖酐攝取量變化，了解細(xì)胞膜上葉酸受體數(shù)量減少會(huì)否影響腫瘤細(xì)胞對(duì)葉酸-右旋糖酐的攝取。最后，綜合評(píng)估葉酸-多聚糖是否能夠通過(guò)細(xì)胞膜上葉酸受體途徑導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞。
3.體內(nèi)腫瘤細(xì)胞對(duì)葉酸-多聚糖選擇性攝取的觀察通過(guò)在荷瘤裸小鼠瘤旁注射標(biāo)記上熒光素的葉酸-右旋糖酐或右旋糖酐后24小時(shí)處死，觀察瘤組織中腫瘤細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度和分布范圍，了解葉酸-多聚糖被在體腫瘤細(xì)胞選擇性攝取的優(yōu)劣。
4.葉酸-多聚糖在體內(nèi)的抑瘤效果荷瘤裸小鼠設(shè)定空白對(duì)照組、右旋糖酐組和葉酸-右旋糖酐組后，分別在瘤旁不注射、注射葉酸-右旋糖酐或右旋糖酐。觀察小劑量和大劑量給藥后的在體瘤體大小變化、結(jié)束后的瘤體重量、瘤組織內(nèi)的形態(tài)和結(jié)構(gòu)變化及其腫瘤細(xì)胞內(nèi)DNA倍體改變程度，了解葉酸-聚多糖對(duì)荷瘤裸小鼠的抑瘤效果強(qiáng)弱。
5.葉酸-多聚糖的安全性評(píng)價(jià)腫瘤化療藥物最大的缺點(diǎn)就是毒副作用大，葉酸-聚多糖是否同樣存在這樣的問(wèn)題，為此需要進(jìn)行葉酸-聚多糖急性毒性試驗(yàn)加以論證。通過(guò)小鼠靜脈注射最大濃度葉酸-右旋糖酐溶液后，觀察小鼠活動(dòng)程度、體重變化、死亡情況和處死后的主要臟器損傷情況，初步了解葉酸-多聚糖作為抗腫瘤藥物的安全程度。
在上述葉酸-多聚糖的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，本發(fā)明可采用藥劑學(xué)上允許的賦形劑、粘合性、助懸劑、崩解劑、稀釋劑、潤(rùn)滑劑、腸溶包衣材料、生物粘附材料、非水溶性骨架材料等輔料與葉酸-多聚糖配伍，制備成相應(yīng)藥物組合物制劑。本發(fā)明藥物組合物的各種劑型可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)生產(chǎn)方法制備，或用特定的生產(chǎn)方法制備。
本發(fā)明采用前述葡聚糖類、聚蔗糖類、單或雜聚多糖硫酸酯類、單或雜聚糖醛酸多糖類等的分子量為4，000～2000，000的多聚糖與葉酸共價(jià)復(fù)合成葉酸-多聚糖復(fù)合物。選擇分子量為105，000右旋糖酐的葉酸-右旋糖酐復(fù)合物作為模型藥物進(jìn)行如下系統(tǒng)研究。
1.體外腫瘤細(xì)胞培養(yǎng) 葉酸-右旋糖酐的體外HeLa229細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果表明①葉酸-右旋糖酐攝取量隨培養(yǎng)濃度增大而增加，但遞增幅度逐漸減緩(見(jiàn)

圖1)，葉酸-右旋糖酐濃度為4.5m／ml時(shí)的攝取量為右旋糖酐的2.7倍；②葉酸-右旋糖酐攝取量隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而增加，但遞增幅度也逐漸減緩(見(jiàn)圖2)；③葉酸-右旋糖酐攝取量隨培養(yǎng)液中葉酸濃度增大而顯著降低(見(jiàn)圖3)；④葉酸-右旋糖酐攝取量隨HeLa229細(xì)胞預(yù)先所用磷脂酶D處理的濃度升高而明顯降低(見(jiàn)圖4)。由此可見(jiàn)，葉酸-右旋糖酐可循細(xì)胞膜上葉酸受體途徑導(dǎo)入HeLa229細(xì)胞內(nèi)，且導(dǎo)入量顯著高于右旋糖酐。
2.荷瘤裸小鼠體內(nèi)腫瘤細(xì)胞靶向和抑瘤試驗(yàn) 葉酸-右旋糖酐在接種HeLa229細(xì)胞的荷瘤裸小鼠瘤旁向瘤內(nèi)腫瘤細(xì)胞靶向試驗(yàn)結(jié)果表明，葉酸-右旋糖酐擴(kuò)散至瘤組織后導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)的量顯著高于右旋糖酐(見(jiàn)圖5)，對(duì)體內(nèi)腫瘤細(xì)胞靶向明顯。葉酸-右旋糖酐對(duì)接種HeLa229細(xì)胞的荷瘤裸小鼠抑瘤試驗(yàn)結(jié)果表明①小劑量時(shí)，顯著減緩腫瘤生長(zhǎng)；大劑量時(shí)，顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)(見(jiàn)圖6)；②給藥33天后處死，與空白對(duì)照組和右旋糖酐組比較，葉酸-右旋糖酐組的腫瘤瘤體明顯小(見(jiàn)圖7和8)，抑瘤率可達(dá)75％左右；③與空白對(duì)照組和右旋糖酐組比較，葉酸-右旋糖酐對(duì)瘤組織具有十分明顯的破壞作用(見(jiàn)圖9a、9b和9c)；④葉酸-右旋糖酐對(duì)瘤組織中腫瘤細(xì)胞內(nèi)的DNA指數(shù)(即腫瘤細(xì)胞內(nèi)DNA質(zhì)量與正常細(xì)胞內(nèi)DNA質(zhì)量的比值，用DI表示)具有明顯的降低作用，其中空白對(duì)照組DI值為3.5，右旋糖酐組DI值為3.1，葉酸-右旋糖酐組DI值為2.3。
3．急性毒性試驗(yàn)葉酸-右旋糖酐在小鼠體內(nèi)急性毒性試驗(yàn)結(jié)果表明，雌雄小鼠靜脈各注射1.5g/kg葉酸-右旋糖酐(因溶解度較低，只能配制該最大濃度進(jìn)行最大耐受劑量試驗(yàn))后，觀察7天，小鼠活動(dòng)正常、體重增加、無(wú)一死亡，且主要臟器未見(jiàn)明顯異常。
上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)①右旋糖酐本身不具備抗腫瘤效果；②葉酸-右旋糖酐可循葉酸受體途徑導(dǎo)入細(xì)胞，具有顯著抑制腫瘤組織生長(zhǎng)作用，而本身毒副作用小、安全程度高；③葉酸-右旋糖酐抗腫瘤作用與傳統(tǒng)化療藥物不同，故本發(fā)明為腫瘤的藥物治療提供一種新的方略。
組合物制劑包括腫瘤內(nèi)、腫瘤旁或靜脈注射用的葉酸-多聚糖凍干品，含碳酸氫鈉或氫氧化鋁和三硅酸鎂的口服用葉酸-多聚糖干糖漿，口服用葉酸-多聚糖腸溶膠囊。也可制備成口服用葉酸-多聚糖腸溶片、動(dòng)脈栓塞用葉酸-多聚糖微球、口服用結(jié)腸釋藥的葉酸-多聚糖小丸、以及鼻腔、子宮腔和其它腔器噴射給藥用的或腹腔注射用的葉酸-多聚糖生物粘附微球等。
圖2顯示HeLa229細(xì)胞對(duì)不同培養(yǎng)時(shí)間的F-Dx105(37℃，培養(yǎng)濃度4.5mg/ml)攝取。
圖3顯示HeLa229細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)液中不同F(xiàn)濃度時(shí)的F-Dx105(37℃培養(yǎng)4h，培養(yǎng)濃度4.5mg/ml)攝取。
圖4顯示HeLa229細(xì)胞經(jīng)不同濃度磷脂酶D預(yù)處理后，對(duì)F-Dx105(37℃培養(yǎng)4h，培養(yǎng)濃度4.5mg/ml)攝取。
圖5顯示接種HeLa229細(xì)胞的荷瘤裸小鼠瘤旁注射F-Dx105-FITC(左)或Dx105-FITC(右)24h后，腫瘤組織切片的熒光照片(圓形亮點(diǎn)為腫瘤細(xì)胞內(nèi)熒光)。
圖6顯示接種HeLa229細(xì)胞的荷瘤裸小鼠(每組6只)瘤旁分別注射F-Dx105和Dx105(第1～6天56mg/kg，第19天526mg/kg)后的腫瘤體積(V=πab2/6)動(dòng)態(tài)變化。
圖7顯示三組接種HeLa229細(xì)胞的荷瘤裸小鼠瘤旁給藥33天后處死的在體瘤體大小比較(上圖空白組；左下圖Dx105；右下圖F-Dx105)。
圖8顯示三組接種HeLa229細(xì)胞的荷瘤裸小鼠瘤旁給藥33天后處死的離體瘤體大小比較。
圖9a顯示接種HeLa229細(xì)胞的荷瘤裸小鼠空白對(duì)照組飼養(yǎng)33天后瘤體組織切片。
圖9b顯示接種HeLa229細(xì)胞的荷瘤裸小鼠Dx105組給藥33天后瘤體組織切片。
圖9c顯示接種HeLa229細(xì)胞的荷瘤裸小鼠F-Dx105組給藥33天后瘤體組織切片。
以下借助非限制性實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明。實(shí)施例1 葉酸-多聚糖(F-PS)制備1.F-PS制備①葉酸-右旋糖酐(F-Dx)*Dx分子量影響●0.74g二甲氨基吡啶溶于12ml甲酰胺/N，N-二甲基甲酰胺/二氯甲烷(10∶9∶1)混合溶劑，加入0.25g F和1.16g二環(huán)己基碳化二亞胺，然后加入溶于上述混合溶劑的Dx(分子量10，000)溶液(0.1g/ml)6ml，25℃避光反應(yīng)20h，反應(yīng)終止后抽濾，濾液注入丙酮中，產(chǎn)生淡黃色沉淀，抽濾收集沉淀物，真空干燥，得F-Dx粗品。用Sephadex G-15柱純化，重蒸水洗脫，收集第一色譜段洗脫液，冷凍干燥，得F-Dx純品?！馜x(分子量70，000)與F如上反應(yīng)和處理?！馜x(分子量105，000)與F如上反應(yīng)和處理?！馜x(分子量500，000)與F如上反應(yīng)和處理?！馜x(分子量200，000)與F如上反應(yīng)和處理。*F與Dx質(zhì)量比影響●Dx(分子量105，000)與F反應(yīng)質(zhì)量比為2.4∶1(g／g)。如上反應(yīng)和處理?！馜x(分子量105，000)與F反應(yīng)質(zhì)量比為1.71∶1(g／g)。如上反應(yīng)和處理.●Dx(分子量105，000)與F反應(yīng)質(zhì)量比為1.33∶1(g／g)。如上反應(yīng)和處理?！馜x(分子量105，000)與F反應(yīng)質(zhì)量比為1.20∶1(g／g)。如上反應(yīng)和處理。②葉酸-聚蔗糖(F-Ficoll)以0.6g Ficoll(分子量400，000)替代0.6g Dx(分子量10，000)，F(xiàn)icoll與F的反應(yīng)質(zhì)量比為2.4∶1(g／g)，進(jìn)行與F-Dx制備完全相同的反應(yīng)和處理。③葉酸-糊精(F-Dextrin)0.74g二甲氨基吡啶溶于8ml二甲基亞砜，加入0.25g F和1.16g二環(huán)己基碳化二亞胺，然后加入溶于二甲基亞砜的Dextrin (分子量4，500)溶液(0.15g/ml)4ml，后續(xù)制備及純化方法與F-Dx制備及純化方法相同。④葉酸-肝素(F-Heparin)0.37g二甲氨基吡啶、0.125g F和0.58g二環(huán)己基碳化二亞胺，混合溶解于6ml甲酰胺/N，N-二甲基甲酰胺/二氯甲烷(10∶9∶1)混合溶劑中，然后加入溶于上述混合溶劑的肝素鈉(分子量2，000-6，000)溶液(0.03g/ml)10ml，后續(xù)反應(yīng)與F-Dx制備相同，純化方法除用洗脫液為5mM碳酸氫鈉與0.1M氯化鈉混合液外，其余均相同。⑤葉酸-阿拉伯膠(F-Acacia)以0.6g Acacia(分子量240，000-580，000)替代0.6g Dx(分子量10，000)，Acacia與F的反應(yīng)質(zhì)量比為2.4∶1(g/g)，除濾液注入乙醇中沉淀外，進(jìn)行與F-Dx制備的反應(yīng)和純化方法相同。⑥二氫葉酸-右旋糖酐(F2-Dx)0.74g二甲氨基吡啶溶于12ml甲酰胺／N，N-二甲基甲酰胺/二氯甲烷(10∶9∶1)混合溶劑，加入0.25g F2和1.16g二環(huán)己基碳化二亞胺，然后加入溶于上述混合溶劑的Dx(分子量105，000)溶液(0.1g/ml)6ml，后續(xù)反應(yīng)和純化方法與F-Dx制備相同。⑦四氫葉酸-右旋糖酐(F4-Dx)0.74g二甲氨基吡啶溶于12ml甲酰胺/N，N-二甲基甲酰胺/二氯甲烷(10∶9∶1)混合溶劑，加入0.25g F4和1.16g二環(huán)己基碳化二亞胺，然后加入溶于上述混合溶劑的Dx(分子量105，000)溶液(0.1g/ml)6ml，后續(xù)反應(yīng)和純化方法與F-Dx制備相同。2.F-PS檢測(cè)用高效硅膠板作載體，氯仿∶甲醇∶乙酸(5/3/2)為展開(kāi)系統(tǒng)，上行展開(kāi)后晾干，碘蒸氣顯色，未見(jiàn)樣品中游離F點(diǎn)存在。分別將F-PS和F的0.4％氫氧化鈉溶液樣品在同上波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，F(xiàn)-PS樣品在258、285和365nm處均與F有完全相同的特征吸收峰，且A258/A365比值均在2.9～3.1之間。以F為標(biāo)準(zhǔn)品，在365nm處測(cè)得F-PS樣品中F結(jié)合率，結(jié)果如下
不同分子量Dx的F結(jié)合率[Dx/F投料比2.4/1(W/W)]Dx分子量 10，000(Dx10) 70，000(Dx70) 105，000(Dx105) 500，000(Dx500) 2000，000(Dx2000)F結(jié)合率(W／W)8.51％ 63.8％ 8.98％ 8.54％ 8.41％分子比(F/Dx) 2∶1 11∶1 23∶1105∶1 416∶1Dx/F投料比對(duì)F結(jié)合率影響(Dx105)Dx/F(W/W) 2.4∶1 1.71∶1 1.33∶1120∶1F結(jié)合率(W／W) 10±1％ 16±1％ 23±1％25±1％分子比(F/Dx) 26∶1 45∶171∶1 80∶1Ficoll-400(分子量400，000)/F投料比2.4∶1(W/W)F結(jié)合率為12.04％(F/Ficoll分子比109∶1)Dextrin-4.5(分子量4，500)/F投料比2.4∶1(W/W)F結(jié)合率為18.38％(F/Dextrin分子比1.87∶1)Heparin(分子量2，000-6，000)/F投料比2.4∶1(W/W)F結(jié)合率為7.86％(F/Heparin分子比0.39-1.16∶1)Acacia(分子量240，000-580，000)/F投料比2.4∶1(W/W)F結(jié)合率為4.53％(F/Acacia分子比25-62∶1)實(shí)施例2 葉酸-右旋糖酐-異硫氰熒光素(F-Dx105-FITC)制備1.右旋糖酐-異硫氰熒光素(F-Dx105-FITC)制備①乙酰丙酮鐵(FAA)制備1.84g乙酸鈉和2g三氯化鐵溶于6ml蒸餾水，加入12ml乙酰丙酮后，抽濾，真空干燥，得FAA粗品。將該粗品溶于蒸餾水，乙醚萃取三次，合并后減壓蒸去乙醚，用60％甲醇溶液重結(jié)晶，得棕紅色FAA結(jié)晶。m.p.183～184℃。②Dxl05-FITC制備0.2g Dxl05、20mgFITC和20mg FAA溶于2m1二甲亞砜，95℃避光反應(yīng)2h，抽濾，80～90℃真空干燥2h，得Dx105-FITC粗品。用Sephadex G-15柱層析純化，凍干，得Dx105-FITC純品。③ Dx105-FITC檢測(cè)用高效硅膠板作載體，氯仿∶甲醇∶氨水(6/3.5/0.5)為展開(kāi)系統(tǒng)，上行展開(kāi)后晾干，在254nm波長(zhǎng)燈光下觀察，未見(jiàn)樣品中游離FITC點(diǎn)存在。分別將Dx105-FITC和FITC的0.4％氫氧化鈉溶液樣品在230～550nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，Dx105-FITC樣品與FITC在492nm處均有完全相同的特征吸收峰。以FITC為標(biāo)準(zhǔn)品，在492nm處測(cè)得Dx105-FITC樣品中FITC結(jié)合率為3.6‰(W/W)。2.葉酸-右旋糖酐-異硫氰熒光素(F-Dx105-FITC)制備①F-Dx-FITC制備Dx105-FITC與F投料質(zhì)量比為2.4∶1，制備方法與實(shí)例1中F-Dx制備方法相同。粗品用Sephadex G-15柱層析純化，凍干，得F-Dx105-FITC純品。②F-Dx105-FITC檢測(cè)F-Dx105-FITC中游離F的定性檢測(cè)和結(jié)合F的定量測(cè)定方法與實(shí)例1中F-PS檢測(cè)方法相同。F-Dx105-FITC樣品中F結(jié)合率為7.43％(W/W)。實(shí)施例3體外HeLa229細(xì)胞通過(guò)F受體對(duì)F-Dx105選擇性攝取用10％小牛血清(NCS)/RPMI-1640培養(yǎng)液對(duì)HeLa229細(xì)胞(一種人子宮頸癌細(xì)胞，中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所提供)在六孔培養(yǎng)板上貼壁預(yù)先培養(yǎng)(37℃的CO2培養(yǎng)箱)24h。每孔(φ33mm)含2×105HeLa細(xì)胞。臨用前棄去原培養(yǎng)液。1.樣品濃度對(duì)攝取影響分別加1ml RPMI-1640培養(yǎng)液配制的各濃度F-Dx105-FITC溶液(0.612、1.125、2.25、4.50mg/ml)和Dx105-FITC溶液(0.585、1.17、2.34、4.68mg/ml)于含預(yù)先培養(yǎng)HeLa229細(xì)胞的孔內(nèi)，37℃的CO2培養(yǎng)箱各培養(yǎng)4h。每孔用2ml磷酸鹽緩沖液洗滌4次，1.5ml 1％TritonX-100磷酸緩沖液(pH7.4)破細(xì)胞。用熒光分光光度計(jì)在492nm/512nm處測(cè)定細(xì)胞溶解液熒光值(OD)。結(jié)果表明，隨著F-Dx105-FITC濃度增大，HeLa229細(xì)胞攝取量明顯增加，而遞增幅度逐漸減緩，但均顯著高于Dx105-FITC(見(jiàn)圖1)。2.培養(yǎng)時(shí)間對(duì)攝取影響加1ml RPMI-1640培養(yǎng)液配制的4.50mg／ml F-Dx105-FITC溶液于預(yù)先培養(yǎng)HeLa229細(xì)胞的孔內(nèi)，37℃的CO2培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)0.5、1、2和4h。同上處理后測(cè)定熒光值(OD)。結(jié)果表明，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，HeLa229細(xì)胞攝取F-Dx105-FITC量明顯增加，但遞增幅度逐漸減緩(見(jiàn)圖2)。3.游離葉酸對(duì)攝取影響分別加1ml RPMI-1640培養(yǎng)液配制的內(nèi)含游離F 2.3×10-6、33×10-5、1.2×10-5、1.0×10-4、1.0×10-3、1.0×10-2mol／l的4.50mg／mlF-Dx105-FITC溶液于預(yù)先培養(yǎng)HeLa229細(xì)胞的孔內(nèi)，37℃的CO2培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)4h。同上處理后測(cè)定熒光值(OD)。結(jié)果表明，隨著培養(yǎng)液中F加入量增加，HeLa229細(xì)胞攝取F-Dx105-FITC量顯著降低(見(jiàn)圖3)。4.酶處理對(duì)攝取影響分別先用內(nèi)含磷脂酶D(PLD，卷心菜內(nèi)提得)0、0.075、0.15、0.30和0.60mg/ml的RPMI-1640培養(yǎng)液處理15min，棄去后用1mlRPMI-1640培養(yǎng)液洗滌二次。分別加1ml RPMI-1640培養(yǎng)液配制的4.50mg／ml F-Dx105-FITC溶液于處理后的HeLa229細(xì)胞的孔內(nèi)，37℃的CO2培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)4h。同上處理后測(cè)定熒光值(OD)。結(jié)果表明，隨著處理液中PLD濃度提高，HeLa229細(xì)胞攝取F-Dx105-FITC量顯著降低(見(jiàn)圖4)。實(shí)施例4體內(nèi)HeLa229細(xì)胞對(duì)F-Dx105選擇性攝取1.HeLa229荷瘤裸小鼠模型建立BALB／C裸小鼠(18±1g；雌性；上海市腫瘤研究所提供)右前肢近腋下皮下接種0.1ml(1×107)HeLa細(xì)胞(中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所提供)后，飼養(yǎng)于SPF屏障系統(tǒng)內(nèi)，使HeLa細(xì)胞在體內(nèi)連續(xù)傳代生成較大瘤塊后處死，在無(wú)菌條件下，取瘤塊切成直徑約2mm大小，用20號(hào)套管針移植于同規(guī)格裸小鼠的相同部位，飼養(yǎng)10天，待用。2.體內(nèi)HeLa229細(xì)胞攝取F-Dx105HeLa229荷瘤裸小鼠二組(每組3只)，分別于瘤旁皮下注射0.1mlF-Dx105-FITC(5.7mg)和Dx105-FITC(5.7mg)，飼養(yǎng)24h后處死，取瘤塊，組織切片，在相同視野內(nèi)用熒光和相差顯微鏡對(duì)比觀察并與攝片記錄。結(jié)果表明，F(xiàn)-Dx105-FITC擴(kuò)散至腫瘤組織后能明顯進(jìn)入HeLa229細(xì)胞內(nèi)(見(jiàn)圖5)。實(shí)施例5 F-Dx105抑瘤作用HeLa229荷瘤裸小鼠三組(每組6只)，其中二組分別于瘤旁皮下每天每只注射0.1ml F-Dx105(1.12mg)和Dx105(1.12mg)，連續(xù)給藥6天，第20天再分別每只一次性各補(bǔ)注射0.3ml F-Dx105(10.52mg)和Dx105(10.52mg)；空白對(duì)照組不注射任何藥液。三組動(dòng)物均共飼養(yǎng)33天。1.瘤體動(dòng)態(tài)變化三組HeLa229荷瘤裸小鼠于給藥后每隔一定天數(shù)測(cè)定瘤體大小，即用卡尺測(cè)量瘤體長(zhǎng)徑(a)和垂直于長(zhǎng)徑的最大橫徑(b)，按V=πab2/6經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算瘤體大小。結(jié)果表明，F(xiàn)-Dx105組瘤體生長(zhǎng)速率明顯慢于Dx105組和空白對(duì)照組；補(bǔ)加高濃度藥液后，F(xiàn)-Dx105組瘤體生長(zhǎng)顯著受到抑制，且在飼養(yǎng)期內(nèi)未見(jiàn)瘤體反跳(見(jiàn)圖6)。2.抑瘤率三組HeLa229荷瘤裸小鼠于給藥33天后處死(見(jiàn)圖7)，取瘤體(見(jiàn)圖8)稱重，按(1-實(shí)驗(yàn)組瘤重/空白對(duì)照組瘤重)×100％式計(jì)算。結(jié)果表明，F(xiàn)-Dx105抑瘤率可達(dá)70％以上，而Dx105未表現(xiàn)出明顯抑瘤率(見(jiàn)下表)。
組別 動(dòng)物數(shù)(始/末)瘤重(mg)抑瘤率(％)空白對(duì)照 6/6393.6±201.6-Dx105 6/6416.1±286.7-1.03F-Dx105 6/698.4±38.3 74.363.瘤組織形態(tài)觀察三組瘤體組織固定后分別取材，常規(guī)切片和染色后封固在載玻片上，用相差顯微鏡觀察并攝片記錄(見(jiàn)圖9a、9b和9c)。結(jié)果表明，與空白對(duì)照組相比，F(xiàn)-Dx105組的瘤組織中腫瘤細(xì)胞大量死亡或崩解，并出現(xiàn)許多空心囊泡，而Dx105組的瘤組織僅見(jiàn)部分纖維化和少量腫瘤細(xì)胞死亡。4.瘤組織中癌細(xì)胞DNA指數(shù)測(cè)定三組瘤體組織固定后分別取材，梯度酒精脫水、石蠟包埋、切成5μm厚白片置于載玻片上，用改良的Feulgen-天蘭A法染色后封固。用圖象細(xì)胞光度計(jì)(Image Cytometer，CAS-200)測(cè)定每張組織切片中50個(gè)腫瘤細(xì)胞和淋巴細(xì)胞(作為正常對(duì)照細(xì)胞)DNA含量，并按下式計(jì)算瘤組織中腫瘤細(xì)胞DNA指數(shù)(DI；DI值越接近于1，癌細(xì)胞惡性程度越低或療效越好) 結(jié)果表明，F(xiàn)-Dx105組和Dx105組的DI值分別為為空白對(duì)照組DI值的66％和89％(見(jiàn)下表)。
組別 切片(份)DNA主峰質(zhì)量(mg) DI空白對(duì)照 6 25.59±2.95 3.51±0.33Dx105對(duì)照6 22.35±0.58 3．11±0.08F-Dx105 6 16.74±0.83 2．33±0.12實(shí)施例6 F-Dx105對(duì)小鼠毒性試驗(yàn)昆明種小鼠(20～22g)20只，按雌雄分組，每組10只。給藥前禁食3小時(shí)，稱重。小鼠尾靜脈注射F-Dx105(濃度50mg／ml)，給藥劑量為1500mg/kg，注射容量為0.3ml/10g。給藥后，每天觀察小鼠外觀、活動(dòng)、行為和中毒鼠數(shù)，7天后處死，檢查主要臟器。結(jié)果表明，小鼠靜脈注射1500mg/kg的F-Dx105后，未見(jiàn)小鼠異常反應(yīng)，一周內(nèi)活動(dòng)正常，體重增加，無(wú)一小鼠死亡，主要臟器未見(jiàn)異常。實(shí)施例7 F-Dx105組合物制劑1.凍干劑在攪拌條件下，將1.25g F-Dx105溶解于注射用水中，稀釋至25ml，配制成濃度為50mg/ml溶液。每10ml管子瓶分裝2ml溶液，在冷凍干燥機(jī)內(nèi)干燥48小時(shí)，制成有良好形狀的疏松絮狀凍干品，加塞后壓鋁蓋。2.干糖漿劑①33.0g葉酸-右旋糖酐、7.4g氫氧化鋁、3.2g三硅酸鎂，充分混勻后，灌裝于10瓶各150ml容積的瓶?jī)?nèi)。臨用時(shí)，每瓶加100ml溫水，振搖至混懸。②33.0g葉酸-右旋糖酐、5.0g碳酸氫鈉，充分混勻后，灌裝于10瓶各150ml容積的瓶?jī)?nèi)。臨用時(shí)，每瓶加100ml水，振搖至溶解。3.腸溶膠囊劑10.0g葉酸-右旋糖酐、0.2g硬脂酸鎂，充分混勻后，灌裝于1號(hào)腸溶膠囊內(nèi)。每粒含葉酸-右旋糖酐100mg。
權(quán)利要求
1．一種葉酸-多聚糖復(fù)合物，其特征在于具有以下通式組成X-Y其中X為葉酸及其衍生物或其它可循細(xì)胞膜上葉酸受體途徑進(jìn)入細(xì)胞的物質(zhì)；Y為不同種類多聚糖。
2．按權(quán)利要求1所述的葉酸-多聚糖復(fù)合物，其特征在于所述的葉酸及其衍生物或其它可循細(xì)胞膜上葉酸受體途徑進(jìn)入細(xì)胞的物質(zhì)是葉酸、亞葉酸、二氫葉酸、四氫葉酸、四氫蝶呤、喋酰多谷氨酸、2-去氨基-羥基葉酸、1-去氮葉酸、3-去氮葉酸、8-去氮葉酸等。
3．按權(quán)利要求1所述的葉酸-多聚糖復(fù)合物，其特征在于所述的多聚糖是葡聚糖類、聚蔗糖類、果聚糖類、雜聚多糖類、單或雜聚多糖硫酸酯類、單或雜聚糖醛酸多糖類和其它親水性醇類高聚物。
4．按權(quán)利要求3所述的葉酸-多聚糖復(fù)合物，其特征在于所述的多聚糖分子范圍為4，000～2000，000。
5．按權(quán)利要求3所述的葉酸-多聚糖復(fù)合物，其特征在于所述的葡聚糖類多聚糖是右旋糖酐。
6．按權(quán)利要求5所述的葉酸-多聚糖復(fù)合物，其特征在于所述的右旋糖酐分子量范圍為10，000～2000，000。
7．按權(quán)利要求6所述的葉酸-多聚糖復(fù)合物，其特征在于所述的右旋糖酐分子量范圍為10，000～150，000。
8．按權(quán)利要求7所述的葉酸-多聚糖復(fù)合物，其特征在于所述的右旋糖酐分子量為105，000。
9．一種葉酸-多聚糖復(fù)合物制備方法，其特征在于按下述方法制備取葉酸和多聚糖，在吡啶類催化劑和碳化二亞胺類脫水劑作用下，縮合成葉酸-多聚糖復(fù)合物。
10．一種用于抗腫瘤的藥物組合物，其特征在于含有權(quán)利要求1所述的葉酸-多聚糖復(fù)合物和藥用輔料混合制成的葉酸-多聚糖復(fù)合物凍干粉針劑、干糖漿劑和腸溶膠囊劑等藥物制劑。
11．按權(quán)利要求10所述葉酸-多聚糖復(fù)合物的組合物，其特征在于所述藥物輔料可以是藥劑學(xué)上允許的賦形劑、粘合劑、助懸劑、崩解劑、稀釋劑、潤(rùn)滑劑、腸溶包衣材料、生物粘附材料、非水溶性骨架材料等輔料。
12．一種葉酸-多聚糖復(fù)合物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及葉酸與多聚糖的復(fù)合物及其制備方法,特別是涉及葉酸與右旋糖酐的復(fù)合物及其制備、以該復(fù)合物為活性成分的藥物組合物,以及該復(fù)合物在腫瘤治療中的應(yīng)用。本發(fā)明涉及的葉酸—多聚糖復(fù)合物的通式為:X－Y其中:X可以是葉酸及其衍生物或其它可循細(xì)胞膜上葉酸受體途徑進(jìn)入細(xì)胞的物質(zhì);Y可以是各種類型的多聚糖。
文檔編號(hào)A61K31/727GK1287127SQ0011575
公開(kāi)日2001年3月14日 申請(qǐng)日期2000年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2000年4月17日
發(fā)明者陸偉躍, 劉敏, 潘俊 申請(qǐng)人:上海醫(yī)科大學(xué)