一種煙葉處理方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及煙草領(lǐng)域，特別是涉及一種煙葉處理方法。本發(fā)明提供一種煙葉處理方法，包括如下步驟：煙葉接種：使用枯草芽孢桿菌對(duì)煙葉進(jìn)行接種；發(fā)酵：將接種后的煙葉進(jìn)行發(fā)酵。本發(fā)明用不同接種濃度的枯草芽孢桿菌處理煙葉，結(jié)果表明：接種枯草芽孢桿菌后，能夠增加煙葉中致香物質(zhì)的含量，且酸類、醇類、酯類致香物質(zhì)的總量增幅較大。
【專利說(shuō)明】一種煙葉處理方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及煙草領(lǐng)域，特別是涉及一種煙葉處理方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 在煙葉表面存在著大量的微生物群落，微生物參與了煙葉生產(chǎn)及加工過(guò)程。國(guó)內(nèi) 外大量研究表明，微生物不僅能夠明顯地縮短煙葉醇化時(shí)間，而且在一定程度上可以提高 煙葉的內(nèi)在質(zhì)量。Ko 11 e最先進(jìn)行了向煙葉中接種微生物以增加香氣和改善吸味的嘗試，在 雪茄煙中接種酵母菌，可大大加快發(fā)酵進(jìn)程，使發(fā)酵更為徹底，但同時(shí)也會(huì)促進(jìn)細(xì)菌和霉菌 的生長(zhǎng)。English研究表明，煙葉中的芽孢桿菌、嗜熱細(xì)菌和小球菌可以有效提升煙葉的香 氣和品質(zhì)。Tamayo等報(bào)道，在煙葉中接種一種小球菌，可改善煙葉的香氣。國(guó)內(nèi)也報(bào)道了利 用微生物增加煙葉香氣的研究，陳福星、朱大恒、羅家基、趙銘欽等研究表明，用微生物處理 煙葉后，明顯改善煙葉香氣質(zhì)量，減輕雜氣和刺激性，使煙氣更加醇和飽滿。
[0003] 枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)是一類好氧型、內(nèi)生抗逆孢子的桿狀細(xì)菌，是 一些重要工業(yè)酶制劑的生產(chǎn)菌。由于其具有非致病性、分泌蛋白能力強(qiáng)的特性和良好的發(fā) 酵基礎(chǔ)，所以應(yīng)用十分廣泛。關(guān)于枯草芽孢桿菌在煙葉上的應(yīng)用，有報(bào)道從枯草芽孢桿菌代 謝物中分離純化蛋白，進(jìn)行對(duì)煙草青枯病菌的抗病作用的研究。
[0004] 本研究以從食品中篩選出的具有產(chǎn)香功能的枯草芽孢桿菌（Bacillus sp，編號(hào) gzuifr-Bps)為對(duì)象，在煙葉上進(jìn)行試驗(yàn)，目的是探討在特定環(huán)境下加入致香微生物對(duì)煙葉 致香物質(zhì)和感官品質(zhì)的影響，從特殊的微生物上獲取致香物質(zhì)，以提升煙葉品質(zhì)，并為煙葉 生產(chǎn)中進(jìn)一步應(yīng)用枯草芽孢桿菌提供理論依據(jù)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 鑒于以上所述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的在于提供一種煙葉處理方法，用于 解決現(xiàn)有技術(shù)中的問(wèn)題。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的及其他相關(guān)目的，本發(fā)明提供一種煙葉處理方法，包括如下步 驟：
[0007] 1)煙葉接種：使用枯草芽孢桿菌對(duì)煙葉進(jìn)行接種；
[0008] 2)發(fā)酵：將接種后的煙葉進(jìn)行發(fā)酵。
[0009] 優(yōu)選的，所述步驟1中，枯草芽孢桿菌的種類為芽孢桿菌Bacillus subtilis,保 藏號(hào)為：CCTCC M2013150。（武漢保藏中心）
[0010] 優(yōu)選的，所述步驟1中，接種方法為噴灑枯草芽孢桿菌溶液。所述枯草芽孢桿菌溶 液即為枯草芽孢桿菌懸液。
[0011] 優(yōu)選的，所述枯草芽孢桿菌溶液使用食品豆豉培養(yǎng)獲得。
[0012] 所述食品豆豉為市售新鮮發(fā)酵的食品豆豉(濕豆豉，豆粒之間具粘絲者佳)。
[0013] 優(yōu)選的，所述枯草芽孢桿菌溶液的制備方法包括如下步驟：將豆豉使用適量蒸餾 水稀釋，將其稀釋液涂布在固體培養(yǎng)基上，置于35-37°C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24小時(shí)以上，將固體 培養(yǎng)基上的菌苔接種到液體培養(yǎng)基中，35-37°C，搖床轉(zhuǎn)數(shù)> 180rpm，培養(yǎng)時(shí)間為32小時(shí)以 上，即得母種；離心、洗滌后直接冷凍干燥或制成懸液備用。
[0014] 優(yōu)選的，稀釋時(shí)，豆豉與蒸餾水的重量比為1 :100,涂布時(shí)，0. 1ml稀釋液對(duì)應(yīng)20g 培養(yǎng)基。
[0015] 所述固體培養(yǎng)基的配方為：牛肉膏0. 5% ;蛋白胨1% ;氯化鈉0. 5% ;瓊脂2% ;余量為 水。
[0016] 所述液體培養(yǎng)基的配方即為所述固體培養(yǎng)基去除瓊脂。
[0017] 更優(yōu)選的，所述步驟1中，所述枯草芽孢桿菌溶液的濃度為2X 108-4. 8X 108個(gè)/ ml，對(duì)煙草的接種量為0. 01ml/g。
[0018] 優(yōu)選的，本發(fā)明所提供的煙葉處理方法所針對(duì)的煙葉為烤煙。
[0019] 優(yōu)選的，所述烤煙為中部上等煙，更優(yōu)選的，所述煙葉為貴州黔南A2C2等級(jí)煙葉。
[0020] 優(yōu)選的，所述步驟2中，煙葉進(jìn)行發(fā)酵的具體方法為：溫度為室溫，濕度為60-80%， 發(fā)酵時(shí)間為15天以上。
[0021] 本發(fā)明第二方面提供所述煙葉處理方法在煙草制備領(lǐng)域的應(yīng)用。
[0022] 如上所述，本發(fā)明的一種煙葉處理方法，具有以下有益效果：本發(fā)明以一株產(chǎn)香的 枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis，保藏號(hào)為：CCTCC M2013150)為對(duì)象，用不同接種濃 度處理煙葉，結(jié)果表明：接種枯草芽孢桿菌后，能夠增加煙葉中致香物質(zhì)的含量，且酸類、醇 類、酯類致香物質(zhì)的總量增幅較大；醇類、酚類、酸類、酮類、酯類、雜環(huán)類致香物質(zhì)的總量均 以2 X 108個(gè)/ml接種濃度的處理較高，醛類和烯類致香物質(zhì)的總量均以4. 8 X 108個(gè)/ml接 種濃度的處理較高；感官品質(zhì)上，能夠提高煙葉香氣質(zhì)，改善吃味，減輕雜氣，降低刺激性， 使煙氣更為細(xì)膩、柔和，且4. 8 X 108個(gè)/ml接種濃度的處理效果較為明顯。

【具體實(shí)施方式】
[0023] 以下通過(guò)特定的具體實(shí)例說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可由本說(shuō)明書(shū) 所揭露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn)與功效。本發(fā)明還可以通過(guò)另外不同的具體 實(shí)施方式加以實(shí)施或應(yīng)用，本說(shuō)明書(shū)中的各項(xiàng)細(xì)節(jié)也可以基于不同觀點(diǎn)與應(yīng)用，在沒(méi)有背 離本發(fā)明的精神下進(jìn)行各種修飾或改變。
[0024]
[0025] 實(shí)施例1
[0026] 1.煙葉接種：
[0027] 用濃度分別為2X 108個(gè)/ml (Wl)、4. 8X 108個(gè)/ml (W2)的兩個(gè)枯草芽孢桿菌處 理對(duì)煙葉進(jìn)行接種，以噴蒸餾水為對(duì)照（CK)。接種處理后將煙葉置于30°C溫度條件下，試 驗(yàn)15天。在試驗(yàn)達(dá)15天時(shí)，對(duì)供試煙葉取樣。將每個(gè)均勻混合后的煙葉處理分為兩份，一 份用于主要致香物質(zhì)的含量測(cè)定，一份用于感官品質(zhì)鑒定。
[0028] 本試驗(yàn)從食品中篩選出具有產(chǎn)香功能的枯草芽孢桿菌（Bacillus sp，保藏號(hào)為： CCTCC M2013150)，培養(yǎng)方法為如下：
[0029] 1)煙葉發(fā)酵用芽孢桿菌所用培養(yǎng)基
[0030] 芽孢桿菌來(lái)源：市售新鮮發(fā)酵食品豆豉(濕豆豉，豆粒之間具粘絲者佳)，
[0031] 分離用培養(yǎng)基：牛肉膏0. 5% ;蛋白胨1% ;氯化鈉0. 5% ;瓊脂2% ;余量為水
[0032] pH7. 0?7. 2,121 °C，20分鐘滅菌后倒平板備用。
[0033] 液體培養(yǎng)基：上述培養(yǎng)基去除瓊脂，裝液量發(fā)酵罐75%，三角瓶25% (體積比)。接 種量8_10%。
[0034] 2)芽孢桿菌分離
[0035] 豆豉處理按1 :100 (重量比)稀釋，將其稀釋液用移液槍吸取0. 1毫升，涂布在20g 固體培養(yǎng)基上，置于35-37°C培養(yǎng)箱內(nèi)，24小時(shí)后即可見(jiàn)到半透明邊緣不整齊菌落，移入試 管中相同溫度培養(yǎng)形成菌株備用。
[0036] 3 )芽孢桿菌液體擴(kuò)大培養(yǎng)
[0037] 將菌株中的菌苔用接種環(huán)挑取一環(huán)接種到滅菌后的液體培養(yǎng)集中，35_37°C，搖床 轉(zhuǎn)數(shù)不低于180rpm。32小時(shí)既可作為母種。發(fā)酵罐通氣比2。
[0038] 4)菌體收集與應(yīng)用
[0039] 3500rpm離心，等滲透壓鹽水洗滌，或直接冷凍干燥或制成懸液備用。
[0040] 2.致香物質(zhì)檢測(cè)方法：
[0041] 儀器設(shè)備：自同時(shí)蒸餾萃取裝置；7890A/5975C氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó) Agilent公司）；HP-5MS毛細(xì)管色譜柱；R114旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士 BUCHI公司）。
[0042] 分析方法：將煙葉原料樣品粉碎過(guò)60目篩子，煙末在恒溫恒濕箱中于溫度22°C， 濕度60%的條件下平衡24h，然后準(zhǔn)確稱取平衡后的樣品25. 0g，放入同時(shí)蒸餾萃取裝置中， 并加入一定量的內(nèi)標(biāo)物（萘），采用二氯甲烷作為溶劑對(duì)樣品進(jìn)行連續(xù)動(dòng)態(tài)萃取2h。所得 提取物經(jīng)干燥后濃縮定容至1. OmL。濃縮液采用氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行分析，所得圖譜 經(jīng)計(jì)算機(jī)譜庫(kù)（NIST05和Wiley275)檢索，并用內(nèi)標(biāo)校正歸一化法計(jì)算各峰的相對(duì)含量。
[0043] 分析條件：毛細(xì)管柱：HP-5MS(30mX0. 25mmX0. 25μπι);進(jìn)樣口溫度：250°C;載氣： He, lmL/min ;程序升溫：初始溫度50°C，保持lmin，以8°C /min升溫到160°C，保持2min， 再以8°C /min升溫到260°C，保持15min，總運(yùn)行時(shí)間為：46. 75min ;進(jìn)樣量：1 μ L，分流比： 20:1 ;傳輸線溫度：280°C ;電離方式：EI，電離能量：70eV ;離子源溫度：230°C ;四級(jí)桿溫度： 150°C ;質(zhì)量范圍 35-455aum。
[0044] 3.感官鑒定方法：
[0045] 參考國(guó)標(biāo)GB5606. 4-2005和煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YC/T138-1998,對(duì)比評(píng)吸鑒定煙葉香氣 質(zhì)、香氣量、吃味、雜氣、刺激性、煙氣細(xì)膩度和柔和度等指標(biāo)。
[0046] 4.結(jié)果與分析
[0047] 4. 1枯草芽孢桿菌對(duì)醇類致香物質(zhì)的影響
[0048] 不同處理醇類致香物質(zhì)含量變化結(jié)果，從試驗(yàn)結(jié)果(表1)看，接種枯草芽孢桿菌后 煙葉中醇類致香物質(zhì)含量有較明顯變化。
[0049] 在2X 108個(gè)/ml接種濃度下，所檢測(cè)的9種醇類化合物含量均表現(xiàn)為含量增加， 增幅最大的為西柏三烯二醇，達(dá)到了 69. 31%，增幅最小的為芳樟醇，為3. 47%，9種醇類致香 物質(zhì)增幅順序?yàn)椋何靼厝┒?> 寸拜醇 > 植醇 > 苯乙醇> 3-氧代-α-紫羅蘭醇> 苯甲 醇> 3-甲基-1- 丁醇>糠醇>芳樟醇。
[0050] 在4. 8Χ 108個(gè)/ml接種濃度下，所檢測(cè)的9種醇類化合物中含量增加的有6種， 以西柏三烯二醇增幅最大，達(dá)到了 46. 56%，含量增加的6種醇類致香物質(zhì)增幅順序?yàn)椋何靼?三烯二醇>寸拜醇> 3-氧代-α -紫羅蘭醇>植醇>糠醇> 3-甲基-1- 丁醇。從含量減 少的醇類物質(zhì)來(lái)看，降幅均在9%以下，降幅順序?yàn)椋罕揭掖?lt;芳樟醇<苯甲醇。
[0051] 煙葉接種枯草芽孢桿菌后，醇類致香物質(zhì)總量?jī)商幚砭鶠樵黾?，增幅較大的為：西 柏三烯二醇、寸拜醇、植醇、3-氧代-α -紫羅蘭醇、3-甲基-1- 丁醇、糠醇。相比之下，2 X 108 個(gè)/ml接種濃度的處理增幅較大，達(dá)到了 28. 14%。
[0052] 表1不同處理醇類致香物質(zhì)含量變化結(jié)果
[0053]

【權(quán)利要求】
1. 一種煙葉處理方法，包括如下步驟： 1) 煙葉接種：使用枯草芽孢桿菌對(duì)煙葉進(jìn)行接種； 2) 發(fā)酵：將接種后的煙葉進(jìn)行發(fā)酵。
2. 如權(quán)利要求1所述的一種煙葉處理方法，其特征在于，所述步驟1中，枯草芽孢桿菌 的種類為芽孢桿菌Bacillus subtilis。
3. 如權(quán)利要求1所述的一種煙葉處理方法，其特征在于，所述步驟1中，接種方法為噴 灑枯草芽孢桿菌溶液。
4. 如權(quán)利要求3所述的一種煙葉處理方法，其特征在于，所述枯草芽孢桿菌溶液使用 食品豆豉培養(yǎng)獲得。
5. 如權(quán)利要求3所述的一種煙葉處理方法，其特征在于，所述步驟1中，所述枯草芽孢 桿菌溶液的濃度為2X 108-4. 8X 108個(gè)/ml，對(duì)煙草的接種量為0. Olml/g。
6. 如權(quán)利要求1所述的一種煙葉處理方法，其特征在于，本發(fā)明所提供的煙葉處理方 法所針對(duì)的煙葉為烤煙。
7. 如權(quán)利要求1所述的一種煙葉處理方法，其特征在于，所述步驟2中，煙葉進(jìn)行發(fā)酵 的具體方法為：溫度為室溫，濕度為50-60%，發(fā)酵時(shí)間為15天以上。
8. 如權(quán)利要求1-7任一權(quán)利要求所述的煙葉處理方法在煙草制備領(lǐng)域的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A24B15/18GK104207324SQ201310207927
【公開(kāi)日】2014年12月17日 申請(qǐng)日期:2013年5月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月30日
【發(fā)明者】吳有祥, 王玉平, 楊佳玫, 鄒曉, 胡大鳴, 歐明毅, 呂紅靈, 許紅慶, 鄧江, 劉孜, 張曉敏, 莫瑩 申請(qǐng)人:貴州中煙工業(yè)有限責(zé)任公司