一種黑莓單一酵素的發(fā)酵方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種發(fā)酵生產(chǎn)活性黑莓酵素的方法，該生產(chǎn)技術(shù)是以強(qiáng)化乳酸菌進(jìn)行初級(jí)產(chǎn)酸發(fā)酵與黑莓表面固有微生物的風(fēng)味產(chǎn)物發(fā)酵為基礎(chǔ)，采用特定的工藝，使黑莓成分得以充分的轉(zhuǎn)化，過程中形成自然發(fā)酵優(yōu)勢菌群，產(chǎn)生高活性的酵素和以果寡糖為特色的多種生理活性物質(zhì)。該技術(shù)發(fā)明是通過將黑莓淋洗，經(jīng)乳酸菌基礎(chǔ)發(fā)酵和自然慢發(fā)酵形成特征優(yōu)勢發(fā)酵微生物，再經(jīng)分離而獲得液體黑莓酵素。
【專利說明】
-種黑章單一酵素的發(fā)酵方法
技術(shù)領(lǐng)域 [0001] 生物技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002] 酵素英文名稱ΕΝΖΥΜΕ，又稱植物綜合活性酶。酵素就是"酶"的俗稱;在日本和中國 臺(tái)灣地區(qū)叫酵素，在中國叫酶(英文ΕΝΖΥΜΕ)。酵素產(chǎn)品起源于日本，始于二十世紀(jì)初，迄今 已有長達(dá)80多年的歷史，風(fēng)靡于中國臺(tái)灣。酵素原料有復(fù)合的多種水果和蔬菜發(fā)酵而成，也 有單一酵素，即單一原料發(fā)酵的酵素---如木瓜酵素、鳳梨酵素，山植酵素都是單一酵素。通 過檢索，酵素的發(fā)酵技術(shù)主要是傳統(tǒng)的自然發(fā)酵，周期長，口味和品質(zhì)不穩(wěn)定。也未與本專 利發(fā)明相關(guān)的技術(shù)。黑替(Blackberry)屬于菩薇科懸鉤子屬，被稱為第Ξ代水果之王。黑替 具有很高的營養(yǎng)價(jià)值，含有豐富的氨基酸、維生素和微量元素等，并且香氣薇郁，顏色艷麗， 深受消費(fèi)者喜愛。果膠是大分子的半乳糖醒酸聚合物，是高等植物細(xì)胞壁的主要組成部分。 果膠分子量多在5萬W上，不易被人體吸收。果膠可被專一性的果膠酵素降解特征性的寡 糖。產(chǎn)生的黑替果膠寡糖具有顯著的清除DPPH自由基、ABTS自由基的作用。在酵素的作用 下，黑替細(xì)胞壁被迅速破壞，花色巧、有機(jī)酸、酪類化合物等營養(yǎng)活性成分得到充分釋放。運(yùn) 不僅大大縮短了生產(chǎn)周期還有效提高了黑替酵素的品質(zhì)。黑替酵素是一種W黑替為原料， 基于微生物發(fā)酵技術(shù)和酶工程技術(shù)的具有多種活性成分的營養(yǎng)補(bǔ)充劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明提供了一種發(fā)酵生產(chǎn)活性黑替酵素的方法，該生產(chǎn)技術(shù)是W強(qiáng)化乳酸菌進(jìn)行基 礎(chǔ)產(chǎn)酸發(fā)酵與黑替表面固有微生物的風(fēng)味產(chǎn)物發(fā)酵為基礎(chǔ)，采用特定的工藝，使黑替成分 得W充分的轉(zhuǎn)化，過程中形成自然發(fā)酵優(yōu)勢菌群，產(chǎn)生高活性的酵素和W果膠寡糖為特色 的多種生理活性物質(zhì)。該技術(shù)發(fā)明是通過將黑替淋洗，經(jīng)乳酸菌基礎(chǔ)發(fā)酵和自然慢發(fā)酵形 成特征優(yōu)勢發(fā)酵微生物，再經(jīng)分離而獲得液體黑替酵素。該發(fā)明的主要內(nèi)容是將原料鮮果 淋水清洗后移入發(fā)酵罐，先進(jìn)行初級(jí)發(fā)酵，再加入薦糖攬拌均勻，溫度保持在25~35Γ備， 進(jìn)行自然發(fā)酵，發(fā)酵終點(diǎn)是W非釀酒酵母Torulaspora de化rueckii (戴爾凱氏有抱圓酵 母）為絕對(duì)優(yōu)勢菌群OlOVml)其它菌群總和<100/ml，非釀酒酵母在自然發(fā)酵中不產(chǎn)生乙 醇，并且與葡萄酒的變質(zhì)無關(guān)。它能形成能形成一些有益酵素質(zhì)量的代謝產(chǎn)物，在S02濃 度在0-50ppm之間產(chǎn)生黑替的特定風(fēng)味化合物包括祗類化合物、醋類、高級(jí)醇、丙Ξ醇、乙 醒、乙酸和班巧酸。酵素經(jīng)過過濾、殺菌、包裝成產(chǎn)品。
【具體實(shí)施方式】
[0004] 黑替酵素的發(fā)酵方法，包括W下步驟： (1)發(fā)酵菌種準(zhǔn)備：將乳酸菌（如ciicacic/ bacieria)菌種接種在液體培養(yǎng)基中（配 方:牛肉膏Ig、蛋白腺Ig、酵母膏Ig、番茄汁20g、葡萄糖Ig、吐溫0.051111、碳酸巧1.7邑、漠甲酪 綠O.Olg、水100ml)28°C發(fā)酵24h后，按10%的接種量接入到二級(jí)種子液中（配方：牛肉膏Ig、 蛋白腺1邑、酵母膏1邑、番茄汁20邑、葡萄糖1邑、吐溫0.051111、碳酸巧1.7邑、漠甲酪綠0.01邑、水 100ml)，發(fā)酵2地后離屯、分離出菌體，得到的菌體經(jīng)冷凍干燥成干粉備用； (2) 原料清洗:將采集的黑替鮮果800kg通過自來水噴淋清洗后轉(zhuǎn)入1000L反應(yīng)蓋中， 保持溫度在22°C; (3) 強(qiáng)化發(fā)酵:將（1)冷凍干燥的乳酸菌菌粉lOg投入上述反應(yīng)蓋，攬拌均勻，密封罐 體，發(fā)酵72小時(shí)進(jìn)行進(jìn)行總酸測定，當(dāng)總酸>3.5%時(shí)進(jìn)行高糖發(fā)酵。 (4) 總酸測定:取20.00血上述發(fā)酵的酵素原液，置于150血燒杯中，加40~60mL水。將 酸度計(jì)電源接通，待指針穩(wěn)定后，用pH 8.0的緩沖溶液(4.2.1)校正酸度計(jì)。將盛有試液的 燒杯放到電磁攬拌器上。再將玻璃電極及甘隸電極浸入試液的適當(dāng)位置。按下pH讀數(shù)開 關(guān)，開動(dòng)攬拌器，迅速用O.lmol/L氨氧化鋼標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液(如樣品酸度太低，可用O.Olmol/L 或0.05mol/L氨氧化鋼標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液)滴定，并隨時(shí)觀察溶液pH的變化。接近終點(diǎn)時(shí)，應(yīng)放 慢滴定速度。一次滴加半滴(最多一滴），直至溶液的pH達(dá)到指揮終點(diǎn)。記錄消耗氨氧化鋼標(biāo) 準(zhǔn)滴定溶液的毫升數(shù)(VI)。每一被測樣品測定兩次?？偹醀每公斤(或每升)樣品中酸的克 數(shù)表示，按式(2)計(jì)算：
式中：X-每公斤(或每升)樣品中酸的克數(shù)，g/kg(或g/L); cl-氨氧化鋼標(biāo)準(zhǔn)滴定溶 液的濃度，mol/L; C2--鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的濃度，mol/L; VI-滴定試液時(shí)消耗氨氧化鋼 標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積，ιΛ; V2--空白試驗(yàn)時(shí)消耗氨氧化鋼標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積，ιΛ; V3-- 反滴定時(shí)消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積，F(xiàn)--試液的稀釋倍數(shù)；m(V0)--試樣的取樣 量，g或mL; K--酸的換算系數(shù)。各種酸的換算系數(shù)同本標(biāo)準(zhǔn)指示劑法第3.7條。計(jì)算結(jié)果精 確到小數(shù)點(diǎn)后第二位。如兩次測定結(jié)果差在允許范圍內(nèi)，取兩次測定結(jié)果的算術(shù)平均值。 上述酵素原液總酸達(dá)到3.85%。 (1) 高糖發(fā)酵:當(dāng)上述總酸測定〉3.5%時(shí)，向發(fā)酵罐中加入400kg薦糖，密封罐體，35 °C發(fā) 酵40天，測定酵母菌數(shù)量，檢測酵母菌數(shù)量M07CRJ進(jìn)行后期處理。 (2) 酵母菌檢測：按著國標(biāo)GB 4789.15-2010方法對(duì)酵母菌TbruJaspora 進(jìn)行檢測，W無菌吸管吸取25 mL酵素樣品至盛有225 mL無菌蒸饋水的錐形瓶(可在瓶內(nèi) 預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠）中，充分混勻，制成1:10的樣品勻液。取1 mL 1:10稀釋液 注入含有9 mL無菌水的試管中，另換一支1 mL無菌吸管反復(fù)吹吸，此液為1:100稀釋 液。上面操作程序，制備10倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次，換用1次1 mL無菌吸 管。選擇6個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液(液體樣品可包括原液），在進(jìn)行10倍遞增稀釋的同 時(shí)，每個(gè)稀釋度分別吸取1 mL樣品勻液于2個(gè)無菌平皿內(nèi)。同時(shí)分別取1 mL樣品稀釋液加 入2個(gè)無菌平皿作空白對(duì)照。及時(shí)將15 mL~20 mL冷卻至46 °C的馬鈴馨-葡萄糖-瓊脂 或孟加拉紅培養(yǎng)基（可放置于46 °C±rC恒溫水浴箱中保溫)傾注平皿，并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使其混 合均勻。放置28°C±rC培養(yǎng)5d。選取菌落數(shù)在10 CFU~150 CFU的平板，根據(jù)菌落形態(tài) 分別計(jì)酵母數(shù)。計(jì)數(shù)結(jié)果為5.7 X 107CFU。 (3) 后期處理:上述檢測酵母菌數(shù)量〉107CFU，停止發(fā)酵，采用分級(jí)過濾的方法實(shí)現(xiàn)黑替 酵素的固液分離。先使用紗網(wǎng)進(jìn)行粗濾，再用板框過濾進(jìn)行精濾。得到的濾液即為黑替酵素 原液，經(jīng)過調(diào)制得到液態(tài)黑替酵素。對(duì)液態(tài)黑替酵素進(jìn)行噴霧干燥，得到黑替酵素沖劑。黑 替酵素噴干后加入各種輔料，經(jīng)過造粒壓片得到酵素含片。 (4)活性成分檢測:該技術(shù)生產(chǎn)的上述酵素原料液含蛋白酵素、淀粉酵素、寡糖、酪類化 合物、有機(jī)酸;采用W下方法檢測:蛋白酶活性測定采用GB/T 23527-2009; W30°C下每分鐘 催化降解產(chǎn)生化g酪氨酸為一個(gè)酶活力單位。測得黑替酵素中的蛋白酵素活力為296.44 U/ mL，此蛋白酵素在較低抑下能夠保持其穩(wěn)定的活性，可W起到促進(jìn)蛋白消化的作用，增強(qiáng)人 體吸收。淀粉酵素活性測定采用GB/T 24401-2009;果膠寡糖含量測定采用巧挫-硫酸法;黑 替酵素中果膠寡糖的含量為1.78mg/mL。酪類化合物含量測定采用GB/T 8313-2008;黑替酵 素中酪類物質(zhì)含量936.0祉g/mL，有機(jī)酸含量采用酸堿滴定法。經(jīng)酸堿滴定W酒石酸計(jì)，酵 素中有機(jī)酸為3.8%。 巧)本發(fā)明的實(shí)施過程中相關(guān)活性產(chǎn)物的測定采用如下標(biāo)準(zhǔn)。 蛋白酵素活性測定采用GB/T 23527-2009; 淀粉酵素活性測定采用GB/T 24401-2009; 果膠寡糖含量測定采用巧挫-硫酸法； 酪類化合物含量測定采用GB/T 8313-2008; 有機(jī)酸含量采用酸堿滴定法； 酵母菌測定采用GB/T 4789.15-2010。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種黑莓單一酵素的發(fā)酵方法，其特征是基礎(chǔ)發(fā)酵投入乳酸菌，再經(jīng)過慢發(fā)酵完成 酵素發(fā)酵過程發(fā)酵結(jié)束產(chǎn)生新的優(yōu)勢菌種為非釀酒酵母TbruiaSjOora c/e辦ruedii。2. -種黑莓單一酵素的發(fā)酵方法，投入乳酸菌發(fā)酵72小時(shí)后，原液總酸達(dá)到>3.5%。3. -種黑莓單一酵素的發(fā)酵方法，原液酵母菌rorWaspora t/eMrt/edii菌落數(shù)>107/ ml 〇
【文檔編號(hào)】A23L33/00GK105919076SQ201610260999
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年4月26日
【發(fā)明人】江曉路, 萬國韶
【申請人】青島金鳳凰莊園果品有限公司