一種乳酸菌吸附去除丙烯酰胺的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于食品加工、食品化學(xué)及食品微生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種通過(guò)乳酸菌吸 附和/或抑制去除丙烯酰胺的方法，涉及降低丙烯酰胺含量的油炸薯片的生產(chǎn)方法，以及 提高乳酸菌吸附丙烯酰胺能力乳酸菌培養(yǎng)基。
【背景技術(shù)】
[0002] 2002年4月，瑞典國(guó)家食品管理局和斯德哥爾摩大學(xué)研宄員首次向世人公布：含 淀粉量高的許多食品在高溫烹調(diào)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生丙烯酰胺，如薯片、餅干、面包等，這些食品 中丙稀酰胺含量一般在1000yg/kg以上，最高可達(dá)12800yg/kg。這一發(fā)現(xiàn)立刻引起了全 世界食品科學(xué)研宄工作者、食品工業(yè)以及國(guó)際相關(guān)食品衛(wèi)生安全組織的廣泛關(guān)注。因此，有 效抑制食品中丙烯酰胺生成或去除食品中的丙烯酰胺不僅是食品中化學(xué)污染物防治的熱 點(diǎn)問(wèn)題，更是重要的民生問(wèn)題。近年來(lái)，隨著人們對(duì)食品安全的重視和對(duì)化學(xué)防腐劑安全性 的顧慮，生物吸附法以其高效、無(wú)副作用的特點(diǎn)成為食品科學(xué)工作者的研宄熱點(diǎn)。生物吸附 法又稱(chēng)接觸穩(wěn)定法，是利用生物吸附劑的物理吸附作用去除污染物的一種方法。生物吸附 劑對(duì)污染物有天然的親和力，其優(yōu)點(diǎn)是受PH值影響小，無(wú)二次污染，吸附效果顯著等。生物 吸附法將是處理有毒污染物的常用方法。
[0003] 研宄表明乳酸菌可以作為一種生物吸附劑有效吸附去除黃曲霉毒素B1、苯并芘等 食品中的有毒物質(zhì)。但目前國(guó)內(nèi)外尚未發(fā)現(xiàn)利用乳酸菌作為生物吸附劑去除丙烯酰胺的 相關(guān)研宄報(bào)道，可能是由于丙烯酰胺具有很強(qiáng)的生物滲透性，乳酸菌吸附丙烯酰胺時(shí)存在 吸附穩(wěn)定性弱等諸多問(wèn)題，因此，該領(lǐng)域工作者一般不會(huì)想到使用乳酸菌吸附丙烯酰胺，對(duì) 于乳酸菌吸附丙烯酰胺的影響因素以及何種方式下處理乳酸菌對(duì)丙烯酰胺吸附效果更好 的研宄國(guó)內(nèi)外還都處于空白階段。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于丙烯酰胺都處于丙烯酰胺抑制劑研宄 階段，非生物吸附，例如，中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)陳芳等人，研宄了由魚(yú)膠原蛋白肽和大豆多肽、甘氨 酸、氯化鈣和氯化鈉中至少一種物質(zhì)構(gòu)成的丙烯酰胺抑制劑。貴陽(yáng)學(xué)院的劉曉燕等人研宄 出了以藍(lán)莓花色苷、維生素C和檸檬酸為組分的丙烯酰胺抑制劑。浙江大學(xué)張英研宄了以 竹葉抗氧化物為主要組分的丙烯酰胺抑制劑，但這些丙烯酰胺抑制劑只能用于抑制丙烯酰 胺的大量生成，對(duì)于已經(jīng)生成的丙烯酰胺沒(méi)有明顯的去除作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 發(fā)明目的：提供一種通過(guò)乳酸菌吸附和/或抑制去除丙烯酰胺的方法，提供一種 降低丙烯酰胺含量的油炸薯片的生產(chǎn)方法；同時(shí)提供一種提高乳酸菌吸附丙烯酰胺能力乳 酸菌培養(yǎng)基。
[0005] 本發(fā)明解決的技術(shù)問(wèn)題：提供一種通過(guò)乳酸菌吸附去除丙烯酰胺的方法。為后續(xù) 結(jié)合模擬胃腸環(huán)境試驗(yàn)、在人體內(nèi)去除已形成的丙烯酰胺提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)，使人體通 過(guò)攝入富含乳酸菌的酸奶或飲料等食品而實(shí)現(xiàn)體內(nèi)丙烯酰胺去除成為可能。同時(shí)提供一種 能夠有效降低丙烯酰胺含量的油炸薯片的生產(chǎn)方法；還提供一種提高乳酸菌吸附丙烯酰胺 能力乳酸菌專(zhuān)用培養(yǎng)基，為本領(lǐng)域人員進(jìn)一步研宄乳酸菌的吸附特性提供研宄基礎(chǔ)。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)方案：
[0007] -種乳酸菌吸附去除丙烯酰胺的方法，其特征在于按照以下步驟進(jìn)行：
[0008] (1)乳酸菌活化：將乳酸菌以3%的接種量接入25mLMRS或M17肉湯或其它任何適 宜的培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)24h，連續(xù)活化兩次，菌株活力得到充分恢復(fù)；
[0009] (2)菌懸液的制備：將活化后的乳酸菌以2% -3%的接種量接種到IOOmLMRS培養(yǎng) 基或M17肉湯培養(yǎng)基中，在37-42°C下培養(yǎng)24h，將培養(yǎng)液8000r/min離心5min，收集菌體， 用無(wú)菌去離子水離心洗滌兩次，并重懸于無(wú)菌去離子水中，保證菌株濃度不低于IO9Cfu/ mL，該菌懸液于4°C保存待用；
[0010] (3)熱處理：將步驟（2)保存待用的菌懸液在100°C下加熱15min滅活菌體，進(jìn)一 步優(yōu)選121°C下加熱15min滅活菌體，即得到滅活后的菌懸液，并于4°C保存待用；
[0011] (4)吸附：取900yL熱處理后的菌懸液加入100yL濃度為6yg/mL丙烯酰胺工 作液或標(biāo)準(zhǔn)液，調(diào)整體系pH值4-6,體系鈣離子濃度為0. 5-0. 7mol/L，30-45°C條件下共同 反應(yīng)6-10h;然后8000r/min離心5min，得到去除丙稀酰胺的上清液。
[0012] 本發(fā)明步驟⑵所述活化后的乳酸菌特別優(yōu)選植物乳桿菌 (Lactobacillusplantarum)、干酪乳桿菌（Lactobacilluscasei)和嗜熱鏈球菌 (Streptococcusthermophilus)的混合物，以活菌數(shù)計(jì)，按植物乳桿菌：干酪乳桿菌：嗜 熱鏈球菌=3 : 2 : 1的比例混合；進(jìn)一步優(yōu)選先在40-45°C條件下培養(yǎng)24h，再在35-37°C 條件下培養(yǎng)24h。
[0013] 本發(fā)明MRS或M17肉湯培養(yǎng)基由特定培養(yǎng)基替代，所述特定培養(yǎng)基由以下組分及 用量配制而成，86-110g脫脂乳粉、20g乳糖、40-60g葡萄糖糖漿、3-5g胰蛋白胨，3-5g的牛 肉粉或牛肉膏、Img的尿喃啶和黃嗓呤、Img絲氨酸和半胱氨酸，0. 005mg葉酸、Img泛酸媽和 碳酸Hlg番前汁、〇? 5mg的核黃素、0? 005mg磷酸氫二鉀，0? 005mg七水硫酸鎂，0?Olg的甲 酸，加入蒸餾水并定容至1000 mL;其中，尿嘧啶和黃嘌呤的比例為3 :2 ;絲氨酸和半胱氨酸 的比例為1 :2 ;泛酸鈣和碳酸鈣的比例為1 :1。
[0014] 所述的乳酸菌培養(yǎng)基在提高乳酸菌吸附丙烯酰胺能力上予以應(yīng)用。
[0015] 本發(fā)明提供一種降低丙烯酰胺含量的油炸薯片的生產(chǎn)方法，其特征在于按以下步 驟進(jìn)行，
[0016] (1)取新鮮土豆清洗去皮，將土豆進(jìn)行切片，控制厚度為lmm-1. 5mm，清水沖洗去 除表面淀粉；
[0017] (2)將步驟（1)所得沖洗后的土豆片，按照固液比1:3-5放入乳酸菌菌懸液中浸 泡，37-39°C浸泡30-60min，每隔10分鐘攪拌一次；
[0018] (3)油炸：160-180°C，油炸 60-90s;得油炸薯片；
[0019] 其中，所述乳酸菌菌懸液的制備方法如下：將植物乳桿菌、干酪乳桿菌和嗜熱鏈球 菌分別使用MRS培養(yǎng)基連續(xù)活化兩次，使菌株活力得到充分恢復(fù)；然后，以活菌數(shù)計(jì)，按植 物乳桿菌：干酪乳桿菌：嗜熱鏈球菌=3 : 2 : 1的比例將三種菌混合，然后在特定培養(yǎng) 基中進(jìn)行培養(yǎng)，先在42°C條件下培養(yǎng)12h，再在37°C條件下培養(yǎng)12h;之后將培養(yǎng)液8000r/ min離心5min收集菌體，用無(wú)菌去離子水離心洗絳兩次，并重懸于無(wú)菌去離子水中，保證菌 株濃度不低于109cfu/mL;優(yōu)選進(jìn)一步將菌懸液加熱滅活，菌懸液在100°C下加熱15min或 121°C下加熱15min滅活菌體，即得步驟（2)所述的乳酸菌菌懸液；特定培養(yǎng)基由以下組分 及用量配制而成，86-110g脫脂乳粉、20g乳糖、40-60g葡萄糖糖漿、3-5g胰蛋白胨，3-5g的 牛肉粉或牛肉膏、Img的尿喃啶和黃嗓呤、Img絲氨酸和半胱氨酸，0. 005mg葉酸、Img泛酸隹$ 和碳酸Hlg番前汁、〇. 5mg的核黃素、0. 005mg磷酸氫二鉀，0. 005mg七水硫酸鎂，0.Olg的 甲酸，加入蒸餾水并定容至1000 mL;其中，尿嘧啶和黃嘌呤的比例為3 :2 ;絲氨酸和半胱氨 酸的比例為1 :2 ;泛酸鈣和碳酸鈣的比例為1 :1。
[0020] 丙烯酰胺的檢測(cè)方法：HPLC分析檢測(cè)
[0021] 儀器：島津LC-20A
[0022] 色譜柱：Inertsil0DSP-C18 色譜柱（4. 6mmX150mm，5ym)
[0023] 進(jìn)樣量：20yL 流速：lmL/min
[0024] 流動(dòng)相：甲醇：水=5:95
[0025] 進(jìn)樣溫度：30°C 檢測(cè)波長(zhǎng)：205nm
[0026] 丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制
[0027] 丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確秤取丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品0. 100g，用超純水溶解定容 至100mL，得到濃度為lmg/mL的丙烯酰胺儲(chǔ)備液，移取此儲(chǔ)備液ImL至IOmL容量瓶中用 超純水定容，得到濃度為0.lmg/mL的丙烯酰胺中間溶液，置于-20°C冰箱中避光保存。分 別取適量丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)液用超純水配制成濃度為〇、〇. 20yg/mL、0. 40yg/mL、0. 60yg/mL、 0. 80yg/mL、I. 00yg/mL系列丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液。依次將配制的不同濃度標(biāo)準(zhǔn)系列工作液 注入高效液相色譜，測(cè)定相應(yīng)的丙烯酰胺的峰面積。以質(zhì)量濃度（yg/mL)為橫坐標(biāo)，以峰 面積（mAU*s)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。
[0028] 丙烯酰胺吸附率測(cè)定
[0029] 取900yL菌懸液加入100yL濃度為6yg/mL丙烯酰胺工作液，使丙烯酰胺的終 濃度為〇. 6yg/mL，37°C共同反應(yīng)6h;然后離心（8000r/min，5min)，取上清。以不加菌懸液 的丙烯酰胺工作液為空白對(duì)照。吸附率按下式計(jì)算：吸附率（％) = [(空白樣中丙烯酰胺 的濃度-上清液中丙烯酰胺的濃度）/空白樣中丙烯酰胺的濃度]X100%。每個(gè)試驗(yàn)可以 重復(fù)三次，差異顯著性（P〈〇. 05)分析使用SPSS軟件。
[0030] 本發(fā)明可以還可以使用本領(lǐng)域其他任意常規(guī)或不常規(guī)的方法測(cè)定丙烯酰胺。本發(fā) 明的乳酸菌、植物乳桿菌、干酪乳桿菌、嗜熱鏈球菌可以為任意常規(guī)菌，可以市購(gòu)，也可以自 行分離，也可以為基因工程加強(qiáng)菌。
[0031] 本發(fā)明的有益效果：
[0032] (1)本發(fā)明克服本領(lǐng)域中乳酸菌不易用于吸附丙烯酰胺的偏見(jiàn)，提供一種通過(guò)乳 酸菌吸附去除丙烯酰胺的方法。目前國(guó)內(nèi)外尚未發(fā)現(xiàn)利用乳酸菌作為生物吸附劑去除丙烯 酰胺的相關(guān)研宄報(bào)道，對(duì)于乳酸菌吸附丙烯酰胺的影響因素以及何種方式下處理乳酸菌對(duì) 丙烯酰胺吸附效果更好的研宄國(guó)內(nèi)外