專利名稱：用于鑒定與部位偏愛(ài)性癌轉(zhuǎn)移形成有關(guān)的基因的免疫-磁性細(xì)胞分離技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的目的是提供一種新穎的技術(shù)，用于檢測(cè)存在于不同組織的腫瘤細(xì)胞中的具有部位特異性表達(dá)模式的新基因。
眾所周知，很多類型癌表現(xiàn)出典型的擴(kuò)散模式，因此此過(guò)程中，轉(zhuǎn)移通常有序地優(yōu)先出現(xiàn)在某些組織或器官中。例如，乳腺癌的轉(zhuǎn)移通常首先在腋下淋巴結(jié)中形成，而骨髓和骨轉(zhuǎn)移是首先最常見(jiàn)(50％)的遠(yuǎn)隔擴(kuò)散部位。其它組織中，肝，肺和中樞神經(jīng)系統(tǒng)(最高達(dá)20％)也成為乳腺癌轉(zhuǎn)移的宿主。類似地，前列腺癌表現(xiàn)出骨髓轉(zhuǎn)移，結(jié)腸癌擴(kuò)散至淋巴結(jié)和肝臟，骨肉瘤擴(kuò)散至肺，惡性黑素瘤擴(kuò)散至淋巴結(jié)，肝、肺和腦，對(duì)于決定這種組織偏愛(ài)性癌擴(kuò)散的因素所知甚少，但是肯定涉及腫瘤細(xì)胞的神經(jīng)特征，借助于例如，使腫瘤細(xì)胞能寄宿于靶器官，能轉(zhuǎn)移并侵入宿主組織，能應(yīng)答于當(dāng)?shù)氐纳L(zhǎng)因子，能誘導(dǎo)血管形成，或者通過(guò)其它迄今未知的方式起作用。這些特征必定同已知或未知基因表達(dá)的的特定蛋白質(zhì)表達(dá)相關(guān)連。因此，鑒定這樣一些基因，對(duì)于了解轉(zhuǎn)移的機(jī)理，并從而對(duì)診斷和治療提供新的指導(dǎo)或線索具有重要的意義。
有幾種方式正在用于研究在某些細(xì)胞群能高度表達(dá)、而在其它細(xì)胞群不能表達(dá)的基因，包括例如扣除雜交克隆技術(shù)，以及應(yīng)用差示顯示法(differential display)。這些克隆方案的絕大多數(shù)都涉及使用體外細(xì)胞株，或者使用克隆作為起始物。但是，已經(jīng)知道，這些細(xì)胞株可能明顯不同于產(chǎn)生它們的腫瘤細(xì)胞，并且體外培養(yǎng)條件下也可能增量或減量調(diào)節(jié)涉及決定細(xì)胞侵入細(xì)胞外基質(zhì)和基質(zhì)組織的能力，以及它們的總體轉(zhuǎn)移能力的基因的表達(dá)。
用于比較基因轉(zhuǎn)錄物或所需蛋白質(zhì)表達(dá)的細(xì)胞株的另一種合理的選擇是使用來(lái)自病人原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移腫瘤的腫瘤組織樣品。但是，這種方法的確包括幾種錯(cuò)誤的可能性，并且還存在技術(shù)困難，當(dāng)使用來(lái)自不同病人的腫瘤細(xì)胞時(shí)，在對(duì)與本研究有關(guān)的基因表達(dá)模式進(jìn)行比較之前，必須扣除體現(xiàn)每個(gè)病人特征的基因表達(dá)。這就使這種基因克隆增加了極大的復(fù)雜性。因此，能夠?qū)奈挥谕粋€(gè)病人不同部位的腫瘤表現(xiàn)形式得到的癌細(xì)胞比較其表現(xiàn)形式將是有利的。通過(guò)如下方式收集腫瘤組織可達(dá)到此目的從原發(fā)性腫瘤和經(jīng)檢查并作外科手術(shù)切除的明顯轉(zhuǎn)移收集，和/或者通過(guò)對(duì)復(fù)發(fā)病人外科手術(shù)或活組織檢查收集，或者從病人的繼發(fā)性腫瘤收集，這些病人在初次外科手術(shù)之后已接受或未接受其它方式的治療。
在任何一種基因克隆方案中，重要的是使用盡可能純的靶細(xì)胞群，力圖避免來(lái)自非靶細(xì)胞的、混淆待比較表達(dá)模式的無(wú)關(guān)信號(hào)。對(duì)于來(lái)自實(shí)體瘤的樣品這點(diǎn)難以達(dá)到，因?yàn)樵谕饪剖中g(shù)和活檢樣品中，腫瘤細(xì)胞是與正常的包括基質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的纖維組織相混合的，常規(guī)的組織制備法不能滿意地除去這些細(xì)胞。對(duì)于血液癌，其惡性細(xì)胞具有與相應(yīng)的正常細(xì)胞亞群共同的抗原決定簇，這將阻礙對(duì)這二種類型細(xì)胞的分離。
在試圖對(duì)早期腫瘤擴(kuò)散中涉及的基因進(jìn)行鑒定時(shí)，重要的是當(dāng)繼發(fā)性腫瘤的體積很小時(shí)從相關(guān)部位取得腫瘤細(xì)胞，或者如果有可能，甚至應(yīng)該從亞臨床腫瘤病灶或細(xì)胞中取得腫瘤細(xì)胞。一個(gè)實(shí)施例是，在常規(guī)的診斷檢查能發(fā)現(xiàn)實(shí)體轉(zhuǎn)移形式之前，惡性細(xì)胞已存在于血液或骨髓中。另一個(gè)實(shí)施例是在常規(guī)的形態(tài)學(xué)方法能夠檢測(cè)癌細(xì)胞之前，這些細(xì)胞已存在于腦脊液中，尿中，或者胸腔和腹腔滲漏液中。并且，在初次外科手術(shù)時(shí)，或者如果懷疑存在轉(zhuǎn)移性擴(kuò)散，淋巴結(jié)常常被除去，因?yàn)樗鼈円褦U(kuò)大了。但是，當(dāng)可能僅存在有限數(shù)量的腫瘤細(xì)胞時(shí)，形態(tài)學(xué)檢查可能仍然是陰性。在所有這些實(shí)施例中，本發(fā)明描述了一種以基因克隆為目的的檢測(cè)和選擇靶細(xì)胞的方法。
除了使用從病人不同組織或器官得到的癌細(xì)胞之外，本發(fā)明還描述了另一種得到轉(zhuǎn)移性人腫瘤細(xì)胞的途徑，用于研究具有部位特異性表達(dá)的基因。已經(jīng)在體外，或者在免疫缺乏的動(dòng)物體內(nèi)培養(yǎng)了來(lái)自幾種人腫瘤的細(xì)胞，并且，用這些細(xì)胞建立了實(shí)驗(yàn)性轉(zhuǎn)移模型，或者使細(xì)胞能在其中常位生長(zhǎng)，即在臨床相關(guān)的起源組織中生長(zhǎng)的模型，如惡性黑素瘤在皮膚中，骨肉瘤在骨中，結(jié)腸癌在腸壁中，乳腺癌在乳房脂墊中，等等。在實(shí)驗(yàn)性轉(zhuǎn)移模型中，可見(jiàn)到腫瘤擴(kuò)散的不同模式，取決于細(xì)胞株，細(xì)胞注射的途徑，以及所用宿主的種類。通常這種轉(zhuǎn)移模式模擬相應(yīng)種類的腫瘤在臨床條件下的轉(zhuǎn)移模式。通過(guò)使用這種模型，還可能從通常在病人體內(nèi)不易進(jìn)入的轉(zhuǎn)移部位得到腫瘤細(xì)胞，例如脊髓和腦組織。而且，重要的是為了進(jìn)行基因克隆，從動(dòng)物細(xì)胞中選擇人腫瘤細(xì)胞，從而避免了正常宿主細(xì)胞的基因表達(dá)問(wèn)題。
在以前，要對(duì)實(shí)體腫瘤和轉(zhuǎn)移樣品，以及對(duì)血液和骨髓中的惡性細(xì)胞，進(jìn)行以鑒定部位特異性表達(dá)基因?yàn)槟康牡?，有意義的基因克隆實(shí)驗(yàn)是不可能的。這是因?yàn)閷?shí)體腫瘤和轉(zhuǎn)移病灶中相當(dāng)大的部分不是惡性細(xì)胞，而是支撐和生長(zhǎng)在惡性細(xì)胞之間的結(jié)締組織，并且其中也包含有對(duì)腫瘤提供必要的營(yíng)養(yǎng)因子和氧氣供應(yīng)的血管。并且認(rèn)為，不借助于體外細(xì)胞培養(yǎng)的中間步驟，不進(jìn)行除去正常細(xì)胞的操作，就不可能從正常細(xì)胞中適當(dāng)?shù)胤蛛x出腫瘤細(xì)胞。但是，這種體外培養(yǎng)可能導(dǎo)致在完全不同于體內(nèi)狀況的，因而明顯改變基因表達(dá)模式的環(huán)境中，對(duì)腫瘤細(xì)胞的亞群進(jìn)行選擇，從而。因此，為了鑒定與轉(zhuǎn)移過(guò)程有關(guān)的基因，不能采用從實(shí)體轉(zhuǎn)移腫瘤培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的方法。而且熟知基因克隆領(lǐng)域的技術(shù)人員都認(rèn)為，比較未經(jīng)處理的實(shí)體原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性腫瘤中惡性細(xì)胞的基因表達(dá)模式是沒(méi)有意義的。并且，在血液和骨髓樣品中，腫瘤細(xì)胞在任何情況下都僅構(gòu)成具核細(xì)胞總數(shù)中非常少的一部分，而且，血液和骨髓中的惡性細(xì)胞對(duì)進(jìn)行基因克隆是沒(méi)有價(jià)值的。這是因?yàn)椴荒軓恼＜?xì)胞中適當(dāng)?shù)胤蛛x出腫瘤細(xì)胞，更重要的是因?yàn)槭熘蚩寺〖夹g(shù)的人員已經(jīng)預(yù)料到，這些惡性細(xì)胞基因表達(dá)模式與母體腫瘤相比較沒(méi)有顯著的差別。
在試圖鑒定與部位特異性表達(dá)相關(guān)的腫瘤基因的過(guò)程中，還沒(méi)有使用在免疫缺乏動(dòng)物中從轉(zhuǎn)移至不同的臨床相關(guān)靶組織器官的人腫瘤分離出的癌細(xì)胞，這僅僅是因?yàn)檫@種人腫瘤模型非常稀少，但是更重要的是因?yàn)槿狈Λ@得純癌細(xì)胞群的方法。
因此，本發(fā)明的目的是提供一種方法，通過(guò)此方法能夠從細(xì)胞群中分離出靶細(xì)胞，以便用于鑒定來(lái)自特定細(xì)胞群環(huán)境中靶細(xì)胞的基因序列。
通過(guò)本發(fā)明已達(dá)到了這個(gè)目的，在所附的權(quán)利要求中描述了本發(fā)明的特征。
因?yàn)楸景l(fā)明的目的是在腫瘤擴(kuò)散的早期階段鑒定特異性表達(dá)的基因，所以其實(shí)體腫瘤和轉(zhuǎn)移病灶體積都很小，并且血液和骨髓中的惡性細(xì)胞將表現(xiàn)出所謂的微轉(zhuǎn)移性疾病，即存在有限數(shù)量的癌細(xì)胞。如果有可能，即使在如下情形下就應(yīng)該收集這種癌細(xì)胞這種細(xì)胞還不能被常規(guī)的形態(tài)學(xué)檢測(cè)法所發(fā)現(xiàn)，或者用診斷方法如放射技術(shù)和磁共振成象技術(shù)也不能檢測(cè)。顯然，因?yàn)檫@種細(xì)胞還不能被識(shí)別，所以它們對(duì)基因克隆沒(méi)有價(jià)值。應(yīng)用免疫磁性技術(shù)可在即使少量存在的情況下分離出這種惡性細(xì)胞。各種擴(kuò)增DNA和RNA序列的方法，使之有可能對(duì)如此少量的惡性細(xì)胞進(jìn)行基因克隆，只要這種細(xì)胞群具有充分的純度。
應(yīng)用本來(lái)已知的技術(shù)可以獲得正選擇靶腫瘤細(xì)胞，如在專利PCT/NO 93/00136(WO 94/07139)和PCT/NO 95/00052中所描述的，因?yàn)樵谀壳扒闆r下最后靶細(xì)胞群的純度是很重要的，所以免疫磁性選擇處理可以重復(fù)進(jìn)行幾次，或者還可以以正選擇(用識(shí)別靶細(xì)胞的單克隆抗體)和負(fù)選擇(用與干擾細(xì)胞結(jié)合的抗體)結(jié)合的形式進(jìn)行處理。這些技術(shù)已成功地用于從血液，骨髓，惡性滲漏液中分離出靶細(xì)胞，并且還從由原發(fā)性腫瘤和淋巴結(jié)以及其它轉(zhuǎn)移的實(shí)體瘤組織制備的單細(xì)胞懸液中分離出了靶細(xì)胞。同樣地，還已證明可以從動(dòng)物宿主的正常基質(zhì)細(xì)胞或造血細(xì)胞中選擇人惡性細(xì)胞，即使當(dāng)腫瘤細(xì)胞是存在于骨，骨髓，脊髓或腦組織中也能進(jìn)行選擇。因?yàn)槟繕?biāo)之一是搜尋具有涉及轉(zhuǎn)移形成早期階段產(chǎn)物的基因，可能碰巧僅能獲得相當(dāng)少的腫瘤細(xì)胞，所以腫瘤細(xì)胞的純度特別重要。與通過(guò)任何其它已知的技術(shù)相比較借助于這種方法，可能從人和動(dòng)物宿主得到更純的靶細(xì)胞群，為克隆部位特異性表達(dá)基因提供了極好的可能性。
本發(fā)明的下一步涉及使用已知的基因克隆技術(shù)，例如使用由LiangA.和Pardee A.B(Science,Vol 257,967-971,1992)首先描述的差示顯示技術(shù)。在此方法中，是以產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄和隨機(jī)擴(kuò)增存在于靶細(xì)胞中的基因轉(zhuǎn)錄物的酶和引物進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)。然后，在測(cè)序凝膠上對(duì)從待比較的細(xì)胞群產(chǎn)生的cDNA片段進(jìn)行研究，提取出部位特異性片段并進(jìn)行測(cè)序。此后可對(duì)所需的基因片段作進(jìn)一步研究，包括在類似于用于克隆的材料中，測(cè)定它們的表達(dá)模式。再次強(qiáng)調(diào)的是，得到一種純化腫瘤細(xì)胞群，沒(méi)有無(wú)關(guān)的干擾檢測(cè)結(jié)果的非靶細(xì)胞是非常重要的。有可能使用從免疫缺乏動(dòng)物轉(zhuǎn)移模型分離人腫瘤細(xì)胞的優(yōu)越性，還在于該模型為更深入地研究提供了可靠的連續(xù)的靶腫瘤細(xì)胞來(lái)源。另一方面重要的是，從病人或從動(dòng)物模型分離的靶細(xì)胞，經(jīng)處理后可直接地，非常迅速地用于DNA和RNA研究，避免了基因表達(dá)中不希望存在的與鑒定部位特異性表達(dá)基因的目標(biāo)無(wú)關(guān)的改變。
用于克隆新基因的不同方法都具有其內(nèi)在的局限性。基于聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)的差示顯示法也可能遇到與代表性和重復(fù)性有關(guān)的問(wèn)題。對(duì)于我們的方法，我們隨之采取了目的在于使這些問(wèn)題減到最小的步驟。主要是通過(guò)使用磁性免疫微球(immunobead)選擇技術(shù)達(dá)到了這個(gè)目的，該技術(shù)使之有可能對(duì)有代表性的特異性生物細(xì)胞進(jìn)行研究，不僅可用于最初的差示顯示步驟，而且可在測(cè)定待選基因在相關(guān)細(xì)胞和組織中表達(dá)水平的步驟中使用。
實(shí)施例1借助于物理學(xué)和酶學(xué)方法，制備來(lái)自乳腺癌病人原發(fā)性腫瘤和腋下淋巴結(jié)的腫瘤細(xì)胞，獲得單細(xì)胞懸液。抽取骨髓樣品(50ml)，并通過(guò)靜穿到采取外周血液樣品，在淋巴細(xì)胞制備器(Lymphoprep)(NycomedPharma,Oslo,Norway)上分離出兩種樣品的單核細(xì)胞。將此細(xì)胞懸液?jiǎn)为?dú)分別與識(shí)別泛上皮抗原(pan-epithelial antigen，和MUC-1基因產(chǎn)物的MOC-31和BM7單克隆抗體共同溫育。漂洗和溫育之后，加入磁性微球Dynabeads M-450 SAM SD(Dynal,Oslo,Norway)Dynabeads與第一抗體的Fc-區(qū)相結(jié)合。然后可以用強(qiáng)磁體從正常的單核細(xì)胞中分離出帶有結(jié)合的抗體-Dynabeads M-450SAM SD復(fù)合物的腫瘤細(xì)胞。顯微鏡檢證實(shí)了所選擇細(xì)胞的性質(zhì)。從不同的細(xì)胞群中提取出RNA，并使此物質(zhì)進(jìn)行差示顯示克隆(Liang andPardee,1992)，其中對(duì)通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄從mRNA亞群得到的部分cDNA序列進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增。在測(cè)序凝膠上對(duì)來(lái)自各種腫瘤細(xì)胞群的cDNA片段進(jìn)行了比較，提取在從某一部位得到的細(xì)胞中特異性表達(dá)的片段，并進(jìn)行測(cè)序。在以我們的磁性免疫微球技術(shù)從骨髓分離出的腫瘤細(xì)胞中，或者在此免疫磁性技術(shù)從淋巴節(jié)轉(zhuǎn)移病灶分離出的腫瘤細(xì)胞中，從若干具有特異性表達(dá)的所需基因序列中，除了尚未鑒定的基因之外，我們已發(fā)現(xiàn)了一個(gè)細(xì)胞周期相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，即一種致癌基因產(chǎn)物。目前正在對(duì)相關(guān)的生物模型系統(tǒng)和臨床材料中，二個(gè)已鑒定的基因序列的表達(dá)進(jìn)行分析。實(shí)施例2在此實(shí)施例中，使用了來(lái)自人乳腺癌實(shí)驗(yàn)性轉(zhuǎn)移模型的細(xì)胞。對(duì)于無(wú)胸腺裸大鼠，大池(CM)內(nèi)注射MA-11人乳腺癌細(xì)胞，導(dǎo)致惡性細(xì)胞在柔腦脊膜內(nèi)擴(kuò)散，生長(zhǎng)。并且，對(duì)左心室(LV)內(nèi)注射的MA-11細(xì)胞在脊髓內(nèi)形成了轉(zhuǎn)移，在大約35天后，導(dǎo)致動(dòng)物后肢發(fā)生麻痹。通過(guò)絞碎宿主組織，制備單細(xì)胞懸液，獲得了來(lái)自二個(gè)部位的腫瘤細(xì)胞，并借助于實(shí)施例1所述的磁性免疫微球技術(shù)對(duì)惡性細(xì)胞作正選擇。然后，對(duì)來(lái)自二個(gè)部位的細(xì)胞，和體外培養(yǎng)的MA-11細(xì)胞一起進(jìn)行RNA提取，并同樣如上所述，使此RNA經(jīng)受差示顯示克隆程序。此外，還從大鼠相關(guān)的正常組織中提取mRNA作為對(duì)照。應(yīng)該說(shuō)明的是，MA-11細(xì)胞株是從來(lái)源于借助免疫磁性法從Ⅱ期乳腺癌病人的骨髓中得到的微轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞分離物建立的。已檢測(cè)出幾個(gè)特異性候選片段，它們對(duì)在柔腦脊膜中生長(zhǎng)的，或者作為對(duì)脊髓轉(zhuǎn)移病灶的細(xì)胞具有特異性。序列分析表明，這些片段中既有新發(fā)現(xiàn)的基因，以有已知的基因。這些被證實(shí)在選自轉(zhuǎn)移細(xì)胞的MA-11細(xì)胞中差示表達(dá)的片段中，迄今已對(duì)四個(gè)候選基因進(jìn)行了更詳細(xì)的測(cè)定。其中定名為L(zhǎng)V1和LV12的二個(gè)基因片段特別有價(jià)值，LV1顯示在來(lái)自脊髓轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞中，有非常高的表達(dá)偏愛(ài)性，而LV12在柔腦脊膜生長(zhǎng)的細(xì)胞中受到減量調(diào)節(jié)。發(fā)現(xiàn)LV1在若干已知具有在免疫缺乏動(dòng)物中形成實(shí)驗(yàn)性轉(zhuǎn)移高度能力的細(xì)胞株中，受到了增量調(diào)節(jié)。在一組來(lái)自乳腺癌病人的原發(fā)性腫瘤中，LV12的低表達(dá)與相應(yīng)病人的短存活期有關(guān)。綜合這些結(jié)果表明，LV1 mRNA似乎在高度轉(zhuǎn)移性細(xì)胞中受到了增量調(diào)節(jié)，而相反LV12 mRNA的水平與乳腺癌細(xì)胞的進(jìn)行和轉(zhuǎn)移有關(guān)。這個(gè)二基因都是新發(fā)現(xiàn)的。此外，第三個(gè)有希望的候選基因CM13，也是在柔腦脊膜生長(zhǎng)的腫瘤細(xì)胞中受到了增量調(diào)節(jié)的新基因。還將對(duì)其它幾個(gè)候選基因作進(jìn)一步的分析。對(duì)LV1及LV12 cDNA的全長(zhǎng)克隆已經(jīng)開(kāi)始進(jìn)行。實(shí)施例3以類似于在實(shí)施例2中所述的模型，在作CM注射之后使MT1人乳房癌細(xì)胞生長(zhǎng)在柔腦脊膜中，而LV注射的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至骨髓以及脊椎骨和長(zhǎng)骨。將來(lái)自這二個(gè)部位的細(xì)胞以及體外培養(yǎng)的細(xì)胞分離出，并提取出了來(lái)自不同細(xì)胞群的RNA。然后可對(duì)此RNA作類似于實(shí)施例2中所述的克隆處理。實(shí)施例4通過(guò)在實(shí)施例1中所述的技術(shù)分離出的腫瘤細(xì)胞，也已從下列幾種病人樣品中被分離出其它乳腺癌病人；結(jié)腸癌病人，在此腫瘤細(xì)胞是從原發(fā)性和復(fù)發(fā)性腫瘤中從淋巴節(jié)和肝臟轉(zhuǎn)移病灶，血液和骨髓樣品中分離，以及從前列腺癌病人。選自原發(fā)性和復(fù)發(fā)性腫瘤樣品的細(xì)胞，除了從血液和骨髓之外，還從淋巴節(jié)中分離出細(xì)胞。這些被分離出的細(xì)胞都可用于進(jìn)行基因克隆。
除了將實(shí)施例1-4中所述的材料用于基因克隆之外，還可以將它用于測(cè)定有充分希望的所有基因序列的表達(dá)模式。
權(quán)利要求
1．一種用于鑒定當(dāng)特異性靶細(xì)胞存在于不同于或不是其起源的細(xì)胞環(huán)境時(shí)，該靶細(xì)胞具有的位點(diǎn)特異性或部位偏愛(ài)性表達(dá)的基因的方法，其特征在于，為了獲得最高可達(dá)100％特異性的靶細(xì)胞，在對(duì)靶細(xì)胞實(shí)施已知的細(xì)胞克隆程序之前，首先重復(fù)地進(jìn)行免疫-磁性處理對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)和分離。
2．據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，所使用的靶細(xì)胞是從如下樣品獲得的惡性細(xì)胞原發(fā)性或復(fù)發(fā)性實(shí)體腫瘤，和/或這種腫瘤對(duì)淋巴結(jié)，和/或血液，和/或骨髓，和/或骨組織，和/或肝臟，和/或肺，和/或中樞神經(jīng)系統(tǒng)，和/或胸膜惡性滲漏液及腹水，尿，和/或腦脊液，和/或其它器官位點(diǎn)的轉(zhuǎn)移。
3．據(jù)權(quán)利要求1-2的方法，其特征在于，其惡性細(xì)胞是從如下細(xì)胞材料中分離出的由實(shí)體腫瘤制備的單細(xì)胞懸液，和/或從骨髓或血液樣品中獲得的單核細(xì)胞組分，和/或存在于其它體液中的細(xì)胞。
4．據(jù)權(quán)利要求1-2的方法，其特征在于，所用的惡性細(xì)胞是體外培養(yǎng)的人腫瘤細(xì)胞，和/或在免疫缺乏動(dòng)物的特異性組織中生長(zhǎng)的人腫瘤細(xì)胞，和/或在這種動(dòng)物中的實(shí)驗(yàn)性人腫瘤轉(zhuǎn)移。
5．據(jù)權(quán)利要求1-4的方法，其特征在于，從所分離的細(xì)胞中提取RNA和/或DNA。
6．據(jù)權(quán)利要求5的方法，其特征在于，所提取的核酸是被用于基因克隆的目的。
7．據(jù)上述權(quán)利要求的方法，其特征在于，所述的基因克隆方法是差示顯示法或扣除雜交法，或者是能用于鑒定具有差示表達(dá)(differential express)基因的其它方法。
8．據(jù)權(quán)利要求7的方法，其特征在于，在測(cè)序凝膠上對(duì)從選自不同部位的惡性細(xì)胞得到的被擴(kuò)增cDNAs進(jìn)行研究和比較，并在此對(duì)那些感興趣的具有位點(diǎn)特異性或部位偏愛(ài)性表達(dá)模式的cDNA進(jìn)行測(cè)序和鑒定。
9．據(jù)權(quán)利要求8的方法，其特征在于，是在從權(quán)利要求1-4中所述的所有相關(guān)的腫瘤細(xì)胞位點(diǎn)得到的材料上，對(duì)所鑒定基因序列的表達(dá)模式進(jìn)行研究。
10．據(jù)上述權(quán)利要求的方法，其特征在于，在上述權(quán)利要求中所確定的以前尚不知道的基因是用于基因治療的目的，和/或者是作為目的在于使這些基因或其產(chǎn)物發(fā)生改變或失活處理的靶物。
11．權(quán)利要求1方法的用途，用于從存在于不同于或不是其起源的細(xì)胞環(huán)境的靶細(xì)胞中，獲得特異性基因序列和其表達(dá)產(chǎn)物。
全文摘要
一種用于鑒定靶細(xì)胞中具有部位特異性或部位偏愛(ài)性表達(dá)基因的方法,是首先通過(guò)反復(fù)地免疫－磁性處理對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)的分離。然后對(duì)純化的靶細(xì)胞實(shí)施已知的克隆程序,優(yōu)選的靶細(xì)胞是惡性細(xì)胞,例如轉(zhuǎn)移細(xì)胞。基因克隆的方法可包括使用差示顯示法(differential display)或扣除雜交法(substractive hybridization)。
文檔編號(hào)C12N5/10GK1214738SQ97193361
公開(kāi)日1999年4月21日 申請(qǐng)日期1997年3月25日 優(yōu)先權(quán)日1996年3月26日
發(fā)明者奧伊斯坦·福德斯塔德, O·恩格布拉藤, A·H·雷, J·E·霍維格 申請(qǐng)人:奧伊斯坦·福德斯塔德