專利名稱：：產(chǎn)生有機(jī)酸和氨基酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及利用微生物(特別是微桿菌屬的微生物物種)產(chǎn)生有機(jī)酸和氨基酸(特別是L-蘋果酸和L-天冬氨酸)的方法。
背景技術(shù)：
：有機(jī)酸和氨基酸在藥學(xué)、衛(wèi)生和食品工業(yè)上有多種用途，尤其優(yōu)選的是L-異構(gòu)體形式的有機(jī)酸和氨基酸。L-蘋果酸作為一種有機(jī)酸，主要作為高氨血的解毒劑和氨基酸輸注成分應(yīng)用在藥學(xué)上。蘋果酸作為與檸檬酸競爭的食品(如蜜餞產(chǎn)品)酸化劑具有市場利潤。L-蘋果酸另外的用途包括作為很多食品(如不含酒精的飲料、蜜餞和罐裝的水果和蔬菜)的調(diào)味劑。L-天冬氨酸作為一種氨基酸，是食品工業(yè)上廣泛使用的調(diào)味劑。通常通過化學(xué)合成方法產(chǎn)生有機(jī)酸和氨基酸的。然而，化學(xué)合成的有機(jī)酸和氨基酸(例如由順丁烯二酸酐和水化學(xué)合成蘋果酸)通常是無旋光活性的混合物(DL-異構(gòu)體)。這種混合物必須經(jīng)分離方法從DL-混合物中分離出天然的L-異構(gòu)體。為解決和這種DL-異構(gòu)體混合物相關(guān)的問題，人們求助于各種微生物合成(產(chǎn)生)有機(jī)酸和氨基酸。微生物的這種利用使酶促反應(yīng)具有生物特異性和選擇性，使底物轉(zhuǎn)化成天然L-形式的有機(jī)酸或氨基酸，這在化學(xué)合成過程中通常是不可能的。這種生物特異性和選擇性在產(chǎn)品總產(chǎn)量和質(zhì)量等方面具有優(yōu)勢，同時(shí)明顯減少廢物處理，進(jìn)而產(chǎn)生出天然L-形式的有機(jī)酸和/或氨基酸。已經(jīng)公開了使用各種微生物把延胡索酸酶促轉(zhuǎn)化成天然L-形式蘋果酸的方法。這些菌株包括短乳桿菌、德氏乳桿菌、大腸桿菌等幾個(gè)物種的一些菌株(美國專利2,972,566)和類產(chǎn)氣副大腸桿菌(美國專利3,980,520)的菌株。并且公開了各種產(chǎn)生延胡索酸酶的微生物用于轉(zhuǎn)化延胡索酸生成蘋果酸的用途，如產(chǎn)氨短桿菌、馬棒狀桿菌、黃黃色桿菌、普通變形菌和粉狀畢赤酵母(美國專利3,922,195)。利用各種微生物將延胡索酸(銨)轉(zhuǎn)化成L-天冬氨酸已見報(bào)道。已公開了用于此目的的大腸桿菌、Brevibacteriummetalcoligenes、沙雷氏菌屬、惡臭假單胞菌的菌株。并且，美國專利4,138,292描述了利用產(chǎn)氨短桿菌把延胡索酸轉(zhuǎn)化成L-天冬氨酸的方法。遺憾的是，盡管利用已公開微生物的酶促反應(yīng)的生物特異性和選擇性，對產(chǎn)生天然L-形式蘋果酸、天冬氨酸和/或其它有機(jī)酸和/或氨基酸具有一定優(yōu)勢，但仍有必要提高這些方法的功效，為此有必要鑒別和使用以前未考慮過的微生物物種。人們已十分了解并描述了微桿菌屬的微生物[見Bergey的細(xì)菌分類學(xué)手冊，第2卷，第15部分，第1320-1322頁(1986)]。盡管微桿菌屬菌株是延胡索酸酶的產(chǎn)生者，但我們沒有意識(shí)到利用微桿菌屬的微生物產(chǎn)生L-蘋果酸和/或L-天冬氨酸。因此，可以看到有必要鑒別和利用其它能以工業(yè)規(guī)模高效(efficientlyandeffectively)地產(chǎn)生有機(jī)酸和/或氨基酸(如L-蘋果酸和/或L-天冬氨酸)的微生物。發(fā)明概述本發(fā)明的一個(gè)主要目的是鑒別和提供高效地轉(zhuǎn)化延胡索酸或其鹽以產(chǎn)生有機(jī)酸和/或氨基酸(尤其是L-蘋果酸和/或L-天冬氨酸)的微生物。本發(fā)明另一個(gè)主要目的是提供高效地產(chǎn)生有機(jī)酸和/或氨基酸(尤其是L-蘋果酸和/或L-天冬氨酸)的方法。本發(fā)明還一個(gè)主要目的是提供利用微生物通過酶促合成(產(chǎn)生)的有機(jī)酸和氨基酸(尤其是L-蘋果酸褐L-天冬氨酸)。按照本發(fā)明的教導(dǎo)(teaching)，本文公開的已經(jīng)鑒別和利用的是微桿菌屬的微生物菌株，這些菌株在通過酶促轉(zhuǎn)化延胡索酸及其鹽產(chǎn)生有機(jī)酸和/或氨基酸上是有用的。另外按照本發(fā)明的教導(dǎo)，本文公開了產(chǎn)生有機(jī)酸和/或氨基酸的方法。這種方法包括培養(yǎng)微桿菌屬的菌株，由此在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生延胡索酸酶。如果需要，然后可以從培養(yǎng)基中回收培養(yǎng)的菌株。培養(yǎng)后使延胡索酸或其鹽和微桿菌屬的菌株反應(yīng)，由此把延胡索酸或其鹽酶促轉(zhuǎn)化成L-有機(jī)酸或L-氨基酸。這一方法還包括回收如此產(chǎn)生的所述L-有機(jī)酸或L-氨基酸。本發(fā)明優(yōu)選的方法還包括在把微生物置入含有延胡索酸或其鹽的轉(zhuǎn)化溶液中之前，將其固定化。然而，值得注意的是本發(fā)明的方法也可以由轉(zhuǎn)化溶液內(nèi)以“自由”形式的微生物完成。另一個(gè)優(yōu)選的方法是在使用固定化微生物酶促轉(zhuǎn)化延胡索酸或其鹽之前，將其進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。在這一點(diǎn)上，本發(fā)明的方法還包括在預(yù)處理溶液中培養(yǎng)固定化微生物，這種溶液包含所要產(chǎn)生的L-有機(jī)酸或L-氨基和緩沖液。另一個(gè)優(yōu)選的方法是對預(yù)培養(yǎng)的培養(yǎng)物進(jìn)行輕輕攪拌。本發(fā)明優(yōu)選的方法包括培養(yǎng)微桿菌屬下列種的任何一個(gè)菌株蛾微桿菌、乳微桿菌、嗜氨微桿菌、樹狀微桿菌和產(chǎn)左聚糖微桿菌。本發(fā)明的最優(yōu)選的方法包括培養(yǎng)下列菌株之一蛾微桿菌ATCC8365、乳微桿菌ATCC8180、嗜氨微桿菌ATCC15354、樹狀微桿菌ATCC4358和產(chǎn)左聚糖微桿菌ATCC15953。本發(fā)明優(yōu)選的方法是用于酶促轉(zhuǎn)化的延胡索酸是其鹽(延胡索酸鹽)形式。優(yōu)選的是使用延胡索酸鈉或銨。在這一點(diǎn)上，預(yù)期本發(fā)明的方法包括用微桿菌屬的菌株酶促轉(zhuǎn)化延胡索酸鈉產(chǎn)生L-蘋果酸，用微桿菌屬的菌株酶促轉(zhuǎn)化延胡索酸銨產(chǎn)生L-天冬氨酸。本發(fā)明的方法產(chǎn)生的有機(jī)酸和氨基酸是其天然的L-異構(gòu)體形式。本發(fā)明優(yōu)選的方法是產(chǎn)生L-蘋果酸和L-天冬氨酸。本文公開的本發(fā)明另一個(gè)相關(guān)方面是用微桿菌屬的菌株天然產(chǎn)生的延胡索酸酶和延胡索酸或其鹽反應(yīng)產(chǎn)生L-有機(jī)酸和L-氨基酸的方法，由此，將延胡索酸或其鹽酶促轉(zhuǎn)化成L-有機(jī)酸或L-氨基酸。這種方法包括培養(yǎng)微桿菌屬菌株的各個(gè)步驟，由此，產(chǎn)生和回收延胡索酸酶。如果需要，無論培養(yǎng)基中是否存在其它組分(包括用于產(chǎn)生的有機(jī)體細(xì)胞(如微桿菌屬或一般的工程宿主)或其部分)，都可以以純化的或以高濃度的形式回收延胡索酸酶。然后使回收的延胡索酸酶和延胡索酸或其鹽反應(yīng)，由此將延胡索酸或其鹽酶促轉(zhuǎn)化成L-有機(jī)酸或L-氨基酸。這一方法還包括回收所產(chǎn)生的L-有機(jī)酸或L-氨基酸。另外按照本發(fā)明的教導(dǎo)，本文公開了包含高度純化的一種L-有機(jī)酸或L-氨基酸和微桿菌屬的一種菌株細(xì)胞的反應(yīng)物溶液(reactantssolution)，這些細(xì)胞是用來將延胡索酸或其鹽轉(zhuǎn)化成所需L-有機(jī)酸或L-氧基酸，而有機(jī)酸和/或氨基酸的其它形式(如DL-形式)則不存在。本發(fā)明的反應(yīng)物溶液中優(yōu)選的微桿菌屬的微生物是蛾微桿菌、乳微桿菌、嗜氨微桿菌、樹狀微桿菌和產(chǎn)左聚糖微桿菌。本發(fā)明的反應(yīng)物溶液中包含蛾微桿菌ATCC8365、乳微桿菌ATCC8180、嗜氨微桿菌ATCC15354、樹狀微桿菌ATCC4358和產(chǎn)左聚糖微桿菌ATCC15953是最優(yōu)選的。本發(fā)明的反應(yīng)物溶液中優(yōu)選的有機(jī)酸和氨基酸是L-蘋果酸和L-天冬氨酸。通過閱讀以下描述及其實(shí)施例，容易清楚看出本發(fā)明的這些目的和其它目的。優(yōu)選的實(shí)施例方案的描述本發(fā)明涉及鑒別和利用微生物將延胡索酸或其鹽酶促轉(zhuǎn)化成L-有機(jī)酸和L-氨基酸，所述微生物使酶促反應(yīng)具有生物特異性和選擇性。按照本發(fā)明的教導(dǎo)，鑒別和利用的通過轉(zhuǎn)化延胡索酸或其鹽產(chǎn)生有機(jī)酸和/或氨基酸的微生物屬于微桿菌屬。特別是鑒別和利用了蛾微桿菌、乳微桿菌、嗜氨微桿菌、樹狀微桿菌和產(chǎn)左聚糖微桿菌等幾個(gè)種的微生物，它們能高效地完成這個(gè)任務(wù)。更具體地說，本文公開的菌株有蛾微桿菌ATCC8365、乳微桿菌ATCC8180、嗜氨微桿菌ATCC15354、樹狀微桿菌ATCC4358和產(chǎn)左聚糖微桿菌ATCC15953。本發(fā)明的方法涉及延胡索酸或其鹽的酶促轉(zhuǎn)化以產(chǎn)生有機(jī)酸和/或氨基酸，特別是它們的L-異構(gòu)體。本發(fā)明的方法(和轉(zhuǎn)化溶液)的主要優(yōu)點(diǎn)是產(chǎn)生的有機(jī)酸和/或氨基酸為L-異構(gòu)體形式而不是D-異構(gòu)體形式。在這一點(diǎn)上，我們注意到本發(fā)明的使用及方法產(chǎn)生出所所需有機(jī)酸和/或氨基酸的L-異構(gòu)體形式而沒有D-并構(gòu)體形式(存在于溶液中)，由此可產(chǎn)生實(shí)質(zhì)上純化的異構(gòu)體(L-有機(jī)酸和/或L-氨基酸)，而不是DL-異構(gòu)體混合物。本發(fā)明的方法包括選擇合適的微桿菌屬的菌株(這些菌株是完成所需酶促轉(zhuǎn)化所需的)。然后把這些菌株在肉湯中培養(yǎng)(培養(yǎng)期間微生物產(chǎn)生延胡索酸酶)。培養(yǎng)完成后，從肉湯培養(yǎng)物中分離出所述菌株。把培養(yǎng)的菌株放置(培養(yǎng))在轉(zhuǎn)化溶液中，這種溶液包含(存在)適合進(jìn)行酶促轉(zhuǎn)化成所需有機(jī)酸或氨基酸的延胡索酸或其鹽(延胡索酸鹽形式)。在轉(zhuǎn)化溶液中，將微桿菌屬菌株產(chǎn)生的延胡索酸酶與延胡索酸或其鹽反應(yīng)，由此把延胡索酸或其鹽酶促轉(zhuǎn)化成需要產(chǎn)生的有機(jī)酸和/或氨基酸(L-異構(gòu)體形式)，同時(shí)形成反應(yīng)物溶液。把以這種方式產(chǎn)生的有機(jī)酸和/或氨基酸從反應(yīng)物溶液中回收(通過分離)，以備隨后的利用。本發(fā)明的方法利用了蛾微桿菌、乳微桿菌、嗜氨微桿菌、樹狀微桿菌和產(chǎn)左聚糖微桿菌等幾個(gè)種的菌株。更具體地說，本發(fā)明的方法中利用了菌株蛾微桿菌ATCC8365、乳微桿菌ATCC8180、嗜氨微桿菌ATCC15354、樹狀微桿菌ATCC4358和產(chǎn)左聚糖微桿菌ATCC15953。允許其本身和延胡索酸酶的產(chǎn)生同步生長的微生物能以任何方式培養(yǎng)，本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易理解這一點(diǎn)。在這一點(diǎn)上，本發(fā)明在需氧條件下完成這種培養(yǎng)，培養(yǎng)基中包含碳源(如葡萄糖，淀粉，甘油和糖蜜)、氮源(如胨，酪蛋白或大豆的水解衍生物，硝酸銨或鈉鹽，硫酸銨鹽或磷酸銨鹽，玉米漿，麥芽汁，等等)和無機(jī)鹽(如果需要)。這種培養(yǎng)依特定的培養(yǎng)菌株可在大約20℃至大約40℃的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行，最適溫度從大約30℃到大約32℃，培養(yǎng)時(shí)間大約18小時(shí)到48小時(shí)。培養(yǎng)時(shí)間分別優(yōu)選為23小時(shí)(菌株是蛾微桿菌)、47小時(shí)(菌株為產(chǎn)左聚糖微桿菌)或36小時(shí)(本發(fā)明所用的微桿菌屬的其它菌株)。培養(yǎng)基的pH值從大約5.5到大約8，最適的pH值為大約6到大約7。然后可在發(fā)酵(培養(yǎng))末期回收細(xì)胞?？赏ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的任何合適的方法完成這種回收。本文公開的回收方法是通過離心肉湯培養(yǎng)物，形成含有細(xì)胞的沉淀，然后傾析上清液，或以其它方式回收。如果需要，回收的細(xì)胞(自由形式的細(xì)菌細(xì)胞)本身可用在隨后的轉(zhuǎn)化(反應(yīng))中。在這個(gè)過程中(insuchanevent)，本發(fā)明按照已知的某種方法破裂細(xì)胞，并將粗提物或其部分純化的提取物用于轉(zhuǎn)化反應(yīng)中。盡管微生物可以以自由形式的細(xì)菌細(xì)胞加以利用，但固定化細(xì)菌細(xì)胞(或細(xì)菌細(xì)胞含有的延胡索酸酶)是有好處的。在這一過程中，可將細(xì)菌細(xì)胞固定在整個(gè)發(fā)酵肉湯中(在將其從發(fā)酵肉湯中分離出和置入含有延胡索酸或其鹽的轉(zhuǎn)化溶液中之前)。固定后，可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的任何方法(如通過簡單的傾析)很容易從中除去發(fā)酵肉湯。按照本發(fā)明的方法，可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的任何適于使細(xì)菌酶促轉(zhuǎn)化延胡索酸(或其鹽)的常規(guī)技術(shù)固定細(xì)菌細(xì)胞，這種方法應(yīng)的酶促轉(zhuǎn)化中發(fā)揮作用。這種方法包括把細(xì)菌細(xì)胞固定到聚丙烯酰胺或角叉藻聚糖凝膠或一個(gè)高分子膜上。美國專利4,760,024描述了其它的固定化方法(和那些在這里優(yōu)選利用的方法)。本發(fā)明的方法中所用的延胡索酸和其鹽可以是適合于酶促轉(zhuǎn)化成所需要有機(jī)酸的延胡索酸任何形式(如延胡索酸鹽)。在這一點(diǎn)上，延胡索酸的鈉鹽，鉀鹽，銨鹽，鈣鹽，鎂鹽和鋇鹽都可作為延胡索酸鹽的形式進(jìn)行酶促轉(zhuǎn)化。延胡索酸鈉和銨是優(yōu)選的鹽形式。本發(fā)明用延胡索酸鈉(和微桿菌屬菌株的酶促轉(zhuǎn)化)產(chǎn)生L-蘋果酸，而用延胡索酸銨(和微桿菌屬菌株的酶促轉(zhuǎn)化)產(chǎn)生L-天冬氨酸。按照本發(fā)明的方法，使延胡索酸或其鹽與溶液(轉(zhuǎn)化溶液)中細(xì)胞產(chǎn)生的延胡索酸酶反應(yīng)。延胡索酸或其鹽的pH值大約4到大約10，由延胡索酸鈉轉(zhuǎn)化產(chǎn)生L-蘋果酸的最適pH值為7.5，由延胡索酸銨轉(zhuǎn)化產(chǎn)生L-天冬氨酸的最適pH值為8.8。反應(yīng)在大約15℃到60℃的溫度(大約40℃為最適溫度)下進(jìn)行大約0.5到48小時(shí)，最適時(shí)間為1小時(shí)。溶液(轉(zhuǎn)化溶液)由需要轉(zhuǎn)化的延胡索酸或其鹽的液體形式組成。延胡索酸或其鹽的最適濃度為1.0M。如果需要，(轉(zhuǎn)化)溶液可以含有水及水溶液，如磷酸或Tris-HCl緩沖液。堿(如氫氧化鈉，氫氧化鉀或氫氧化銨)或無機(jī)酸(如鹽酸或硫酸)也可加到溶液中，這樣溶液的pH值范圍可以從大約4到大約10(最適的pH值為大約7.5到大約8.8)。盡管對(轉(zhuǎn)化)溶液中的延胡索酸或其鹽的濃度沒有特殊的限制，但為了易于轉(zhuǎn)化反應(yīng)的進(jìn)行，通常使用大約0.5％(w/v)到大約30％(w/v)的濃度是合適的，最適濃度為11.6％(w/v)。盡管對(轉(zhuǎn)化)溶液中培養(yǎng)或處理的產(chǎn)品(如微生物)濃度沒有特殊的限制，但通常使用大約0.5％(w/v)到大約10％(w/v)的濃度是合適的，最適濃度為4.0％(w/v)。任何已知吸附和解吸方法，如離子交換樹脂或活性碳都可用來從反應(yīng)產(chǎn)物中分離和精制L-有機(jī)酸或L-氨基酸，以備下一步的應(yīng)用。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化溶液中包含微桿菌屬微生物的菌株(上面已詳細(xì)列舉和討論)和L-有機(jī)酸或L-氨基酸，而沒有它們的D-異構(gòu)體和/或DL-異構(gòu)體形式。在這一點(diǎn)上，轉(zhuǎn)化溶液中沒有有機(jī)酸或氨基酸的D-異構(gòu)體和/或DL-異構(gòu)體混合物。如果需要，本發(fā)明的方法允許通過微桿菌屬菌株天然產(chǎn)生的延胡索酸酶和延胡索酸或其鹽反應(yīng)，產(chǎn)生L-有機(jī)酸和L-氨基酸，由此，把延胡索酸或其鹽酶促轉(zhuǎn)化成L-有機(jī)酸或L-氨基酸?！疤烊划a(chǎn)生”這一術(shù)語用來指延胡索酸酶時(shí)，不但指天然產(chǎn)生延胡索酸酶的微生物(本文已鑒別)本身產(chǎn)生的延胡索酸酶，也指由用編碼延胡索酸酶的基因轉(zhuǎn)化(利用眾所周知的遺傳工程原理和技術(shù))的其它微生物(以這種方式使編碼延胡索酸酶的基因在遺傳工程宿主中表達(dá))產(chǎn)生的同樣的延胡索酸酶。盡管描述了這些應(yīng)用，但本發(fā)明的方法，轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基以及下面所舉的實(shí)施例都只是為了更具體地說明本發(fā)明，而不意味著也不應(yīng)該是對本發(fā)明的限制。實(shí)施例1制備每100ml蒸餾水中含2g水解動(dòng)物膠原，3g乳糖，1.5g細(xì)菌培養(yǎng)用酵母抽提物的發(fā)酵培養(yǎng)基(Ph6.0)。培養(yǎng)基在15PSI壓力和120℃溫度下滅菌30分鐘，然后冷卻。用表1列出的微桿菌屬各種菌株的活性培養(yǎng)物接種無菌發(fā)酵培養(yǎng)基的各個(gè)樣品，所用微桿菌屬的菌株都保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，12301ParklawnDrive，Rockville，馬里蘭20852，美國)。表1列出了它們的保藏號(hào)表1</tables>各樣品按表1所列的各菌種接種后，30-32℃下在350RPM的恒溫回旋振蕩培養(yǎng)器G24(直徑3/4″(19mm)的環(huán)形軌道，水平旋轉(zhuǎn))中分別發(fā)酵23小時(shí)(接種蛾微桿菌的樣品1和2)，47小時(shí)(接種產(chǎn)左聚糖微桿菌的樣品9和10)或36小時(shí)(樣品3-8)。實(shí)施例2L-天冬氨酸的產(chǎn)生過程如下按美國專利4,760,024實(shí)施例20(和表2)所描述的方法，固定樣品1，3，5，7，9中全部發(fā)酵培養(yǎng)物肉湯中的細(xì)菌細(xì)胞，另外在其中加入6N的NaOH調(diào)節(jié)pH值。制備含有(每100ml水中)10％(w/v)L-天冬氨酸(SIGMA)，0.1％(w/v)含兩個(gè)結(jié)晶水的氯化鈣，0.1％TWEEN-80(SIGMA)和56.6％(w/w)氫氧化銨(用來調(diào)節(jié)pH值至7.5)的溶液。然后把10％的固定化細(xì)胞添加到預(yù)處理溶液中。這些樣品在40℃下溫和攪拌培養(yǎng)6小時(shí)。用傾析的方法除去固定化細(xì)胞中的預(yù)處理溶液，40℃下，固定化細(xì)胞在含1.0M延胡索酸銨，pH值為8.8的50ml一份的溶液(進(jìn)而形成轉(zhuǎn)化溶液)中再懸浮1小時(shí)。一小時(shí)后，從反應(yīng)產(chǎn)物(和轉(zhuǎn)化溶液)中用離心的方法(SS-34轉(zhuǎn)頭，15000RPM，離心45分鐘)分離細(xì)胞，用高壓液相色譜分析反應(yīng)產(chǎn)物，層析柱采用HPX-87C(BIO-RAD)，柱溫80℃，流動(dòng)相為0.01M醋酸鈣(pH值5.5)。RI檢測，流速為0.9ml/min。通過和高壓液相色譜標(biāo)準(zhǔn)曲線上得到的標(biāo)準(zhǔn)值比較，計(jì)算、確定L-天冬氨酸的產(chǎn)生和濃度。表2總結(jié)了這種方法的結(jié)果和微桿菌屬各菌株的應(yīng)用情況。表2</tables>上述反應(yīng)產(chǎn)物的高壓液相色譜分析表明，預(yù)處理過的固定化細(xì)胞和pH值為8.8的延胡索酸銨一起培養(yǎng)，產(chǎn)生L-天冬氨酸。實(shí)施例3L-蘋果酸的產(chǎn)生過程如下用離心的方法(SS-34轉(zhuǎn)頭，15000RPM，離心45分鐘)從培養(yǎng)肉湯中收集實(shí)施例1中樣品2、4、6、8、10培養(yǎng)產(chǎn)生的細(xì)菌細(xì)胞。40℃下，把從每個(gè)樣品中收集到的2g濕細(xì)菌在含1.0M延胡索酸鈉，pH值為7.5的50ml分裝溶液(進(jìn)而形成轉(zhuǎn)化溶液)中再懸浮1小時(shí)。一小時(shí)后，從反應(yīng)產(chǎn)物(和轉(zhuǎn)化溶液)中用離心的方法(SS-34轉(zhuǎn)頭，15000RPM，離心45分鐘)分離細(xì)胞，用高壓液相色譜分析反應(yīng)產(chǎn)物，層析柱采用HPX-87H(BIO-RAD)，柱溫60℃，流動(dòng)相為0.01N硫酸。RI檢測，流速為0.7ml/分鐘。通過和高壓液相色譜標(biāo)準(zhǔn)曲線上得到的標(biāo)準(zhǔn)值比較，計(jì)算、確定蘋果酸的產(chǎn)生和濃度。表3總結(jié)了這種方法的結(jié)果和微桿菌屬各菌株的應(yīng)用情況。表3</tables>上述反應(yīng)產(chǎn)物的高壓液相色譜分析表明，細(xì)胞和pH值為7.5的延胡索酸鈉一起培養(yǎng)，產(chǎn)生L-蘋果酸。實(shí)施例4按上面實(shí)施例1中所述的方式獲得和培養(yǎng)樹狀微桿菌ATCC4358的細(xì)菌細(xì)胞，為了產(chǎn)生10升的發(fā)酵肉湯，所用各組分的數(shù)量增加100倍。根據(jù)上面實(shí)施例2中所描述的方法和參數(shù)固化細(xì)菌細(xì)胞(參見美國專利4,760,024的實(shí)施例20和表2)，根據(jù)增加的數(shù)量進(jìn)行必要的調(diào)整。10升發(fā)酵肉湯用去離子蒸餾水稀釋至其電導(dǎo)率(Electricalconductivity)少于6000歐姆。然后稀釋肉湯和100gFW-2(Eagle-Picher)混合，攪拌至溶液均一(約15-30分鐘)。加入630ml5％(w/v)的聚乙烯亞胺水溶液，攪拌至得到pH值為8.0的均一混合物(約15分鐘)。然后，加入2700ml5％(w/v)的脫乙酰殼多糖，攪拌至得到pH值為8.0的均一混合物(約15分鐘)。加入800ml5％(w/v)的戊二醛，用6N氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至9.0。混合物過濾前，輕輕攪拌一小時(shí)(GOODMAN公司布過濾器，商品號(hào)7418-0聚丙烯毛布，18盎司雙面打光毛布)，擠壓成形(模具大小為1mm)，45℃下Glatt干燥器中干燥(Glatt航空技術(shù)公司)。用干燥的固定化的細(xì)胞顆粒轉(zhuǎn)化延胡索酸或其鹽產(chǎn)生L-蘋果酸的過程如下。把干燥的固定化的細(xì)胞顆粒填充到具套的層析柱(Jacketedcolumn2.5cm×50cm)中。然后，在40℃下，于pH值7.5、使?jié)舛葹?M的延胡索酸鈉溶液(轉(zhuǎn)化溶液)，以每小時(shí)1.5倍柱床體積的流速連續(xù)地流過層析柱。用高壓液相色譜法測定流出物中L-蘋果酸含量。延胡索酸轉(zhuǎn)化L-蘋果酸的轉(zhuǎn)化率超過80％。實(shí)施例5按上面實(shí)施例1中所述的方式獲得和培養(yǎng)樹狀微桿菌ATCC4358的細(xì)菌細(xì)胞，為了產(chǎn)生10升的發(fā)酵肉湯，所用各組分的數(shù)量增加100倍。然后根據(jù)上面實(shí)施例2中所描述的方法和參數(shù)固化細(xì)菌細(xì)胞(參見美國專利4,760,024的實(shí)施例20和表2)，根據(jù)增加的數(shù)量有必要進(jìn)行調(diào)整。10升發(fā)酵肉湯用去離子蒸餾水稀釋至其電導(dǎo)率少于6000歐姆。然后稀釋肉湯和100gFW-2(Eagle-Picher)混合，攪拌至溶液均一(約15-30分鐘)。加入630ml5％(w/v)的聚乙烯亞胺水溶液，攪拌至得到pH值為8.0的均一混合物(約15分鐘)。然后，加入2700ml5％(w/v)的脫乙酰殼多糖，攪拌至得到pH值為8.0的均一混合物(約15分鐘)。加入800ml5％(w/v)的戊二醛，用6N氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至9.0?；旌衔镞^濾前，輕輕攪拌一小時(shí)(GOODMAN公司布過濾器，商品號(hào)7418-0聚丙烯毛布，18盎司雙面打光毛布)，擠壓成形(模具大小為1mm)，于45℃下在Glatt干燥器中干燥(Glatt航空技術(shù)公司)。用干燥的固定化的細(xì)胞顆粒轉(zhuǎn)化延胡索酸或其鹽產(chǎn)生L-天冬氨酸的過程如下。然后使干燥的固定化的細(xì)胞顆粒制備物和含有10％(w/v)L-天冬氨酸，0.1％(w/v)含2個(gè)結(jié)晶水的氯化鈣，0.1％(w/v)TWEEN-80(SIGMA)和56.6w/w濃氫氧化銨(用來調(diào)節(jié)pH值)的混合物(pH值8.8)一起培養(yǎng)，45℃下，進(jìn)行溫和地振蕩預(yù)培養(yǎng)5-8小時(shí)。隨后傾析液體，把預(yù)處理過的固定化制劑填充上柱。然后，在37℃下，于pH值8.8使?jié)舛葹?M的延胡索酸銨水溶液(轉(zhuǎn)化溶液)以每小時(shí)1/3倍柱床體積的流速流過層析柱。用濃硫酸調(diào)節(jié)流出物的pH值至2.0-3.0，沉淀L-天冬氨酸。用高壓液相色譜法測定流出物中L-天冬氨酸含量。表4列出了以上所述轉(zhuǎn)化過程的結(jié)果。表4</tables>可以看到應(yīng)用本發(fā)明的方法可以高效地把延胡索酸酶促轉(zhuǎn)化成L-天冬氨酸。很明顯，可以進(jìn)行許多不背離本發(fā)明的基本精神的修改。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員明白本發(fā)明可以在所附的權(quán)利要求的范圍之內(nèi)(而不是本文已具體描述的那些之內(nèi))實(shí)施。權(quán)利要求1.一種產(chǎn)生L-有機(jī)酸或L-氨基酸的方法，該方法包括使延胡索酸或其鹽和微桿菌屬的菌株反應(yīng)，由此使延胡索酸或其鹽酶促轉(zhuǎn)化成L-有機(jī)酸或L-氨基酸，并且回收所說的L-有機(jī)酸或L-氨基酸。2.權(quán)利要求1的方法，其中所說的菌株是蛾微桿菌種的一種菌株。3.權(quán)利要求2的方法，其中所說的菌株是蛾微桿菌ATCC8365。4.權(quán)利要求1的方法，其中所說的菌株是乳微桿菌種的一種菌株。5.權(quán)利要求4的方法，其中所說的菌株是乳微桿菌ATCC8180。6.權(quán)利要求1的方法，其中所說的菌株是嗜氨微桿菌種的一種菌株。7.權(quán)利要求6的方法，其中所說的菌株是嗜氨微桿菌ATCC15354。8.權(quán)利要求1的方法，其中所說的菌株是樹狀微桿菌種的一種菌株。9.權(quán)利要求8的方法，其中所說的菌株是樹狀微桿菌ATCC4358。10.權(quán)利要求1的方法，其中所說的菌株是產(chǎn)左聚糖微桿菌種的一種菌株。11.權(quán)利要求10的方法，其中所說的菌株是產(chǎn)左聚糖微桿菌ATCC15953。12.權(quán)利要求1的方法，其中所說的延胡索酸或其鹽是延胡索酸鈉。13.權(quán)利要求12的方法，其中所說的延胡索酸或其鹽是延胡索酸鈉，其中所說的由此產(chǎn)生的L-有機(jī)酸是L-蘋果酸。14.權(quán)利要求1的方法，其中所說的延胡索酸或其鹽是延胡索酸銨。15.權(quán)利要求14的方法，其中所說的延胡索酸或其鹽是延胡索酸銨，其中所說的由此產(chǎn)生的L-氨基酸是L-天冬氨酸。16.權(quán)利要求1的方法，其中所說的L-有機(jī)酸或L-氨基酸是L-蘋果酸。17.權(quán)利要求1的方法，其中所說的L-有機(jī)酸或L-氨基酸是L-天冬氨酸。18.一種包含微桿菌屬的一種菌株和一種有機(jī)酸或氨基酸的反應(yīng)物溶液，其中所說的有機(jī)酸或氨基酸以L-有機(jī)酸或L-氨基酸的形式存在，沒有其D-異構(gòu)體和/或DL-異構(gòu)體。19.權(quán)利要求18的反應(yīng)物溶液，其中所說的有機(jī)酸或氨基酸是L-蘋果酸。20.權(quán)利要求18的反應(yīng)物溶液，其中所說的有機(jī)酸或氨基酸是L-天冬氨酸。21.權(quán)利要求18的反應(yīng)物溶液，其中所說的菌株是蛾微桿菌種的一種菌株。22.權(quán)利要求18的反應(yīng)物溶液，其中所說的菌株是乳微桿菌種的一種菌株。23.權(quán)利要求18的反應(yīng)物溶液，其中所說的菌株是嗜氨微桿菌種的一種菌株。24.權(quán)利要求18的反應(yīng)物溶液，其中所說的菌株是樹狀微桿菌種的一種菌株。25.權(quán)利要求18的反應(yīng)物溶液，其中所說的菌株是產(chǎn)左聚糖微桿菌種的一種菌株。26.一種產(chǎn)生L-有機(jī)酸或L-氨基酸的方法，該方法包括使延胡索酸或其鹽和由微桿菌屬的一種菌株天然產(chǎn)生的延胡索酸酶反應(yīng)，從而使延胡索酸或其鹽酶促轉(zhuǎn)化成L-有機(jī)酸或L-氨基酸，并且回收所說的L-有機(jī)酸或L-氨基酸。全文摘要本發(fā)明公開了微桿菌屬的菌株在產(chǎn)生有機(jī)酸或氨基酸(其是通過將延胡索酸酶促轉(zhuǎn)化成所需有機(jī)酸或氨基酸)上的用途,以及有關(guān)這種用途的方法和由本發(fā)明的這種用途和方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化溶液。本發(fā)明的用途和方法給出由此產(chǎn)生的所需有機(jī)酸或氨基酸的L－異構(gòu)體形式(無其D－異構(gòu)體形式)。本發(fā)明也公開了包含微桿菌屬菌株和有機(jī)酸或氨基酸L－異構(gòu)體形式的反應(yīng)物溶液。文檔編號(hào)C12P13/00GK1179793SQ95197497公開日1998年4月22日申請日期1995年12月20日優(yōu)先權(quán)日1995年12月20日發(fā)明者J·M·邁爾斯申請人:金克克國際有限公司