專利名稱：干細(xì)胞因子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總地涉及刺激包括早期造血祖細(xì)胞在內(nèi)之原始祖細(xì)胞的新因子，以及編碼這些因子的DNA順序。具體地說，本發(fā)明涉及這些新因子、其片段和多肽類似物，以及編碼它們的DNA順序。
人類造血系統(tǒng)由各種白血細(xì)胞(包括中性細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜堿細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜伊紅細(xì)胞、T和B細(xì)胞)、紅血細(xì)胞(紅細(xì)胞)和血塊形成細(xì)胞(巨核細(xì)胞、血小板)組成。
據(jù)信少量的某些造血生長因子可使少量“干細(xì)胞”分化成各種血細(xì)胞的先祖細(xì)胞，并使之大量增殖，最后由這些細(xì)胞系分化成成熟的血細(xì)胞。在正常情況下，造血再生系統(tǒng)可很好地完成其功能。但當(dāng)受到化學(xué)治療、放射線照射或患有先天性骨髓功能失調(diào)的壓力時，病人就會發(fā)生嚴(yán)重的白細(xì)胞減少、貧血或血小板減少等病征。在這一危險期發(fā)展和使用造血生長因子即可加速骨髓再生。
在某些病毒誘發(fā)的紊亂中，如獲得性自發(fā)免疫缺陷癥(AIDS)，T細(xì)胞等血液成分可能受到特異地破壞。對于這些病例，治療的目的在于增加T細(xì)胞的產(chǎn)生。
因?yàn)樵煅L因子只以極小量存在，故須依靠一系列檢測方法來檢測和鑒定這些因子，目前只能在人為條件下根據(jù)對培養(yǎng)之細(xì)胞的刺激作用來區(qū)分不同的因子。
應(yīng)用基因重組技術(shù)已使人們對個別生長因子的生物學(xué)活性有了更清楚的了解。例如，現(xiàn)已弄清了可刺激紅細(xì)胞產(chǎn)生之促紅細(xì)胞生成素(EPO)的氨基酸與DNA順序(參見Lin，U.S.Patent 4，703，008，該專利列為本文參考文獻(xiàn))。也已利用重組方法分離出人粒細(xì)胞集落刺激因子即G-CSF(Souza，U.S.Patent 4，810，643，列為本文參考文獻(xiàn))和人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)[Lee et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，4360-4364(1985);Wong et al.，Science，228，810-814(1985)]、小鼠G和GM-CSF[Yokota et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81，1070(1984);Fung，et al.，Nature，307，233(1984);Gough，et al.，Nature，309，763(1984)]以及人巨噬細(xì)胞集落刺激因子(CSF-1)[Ka-wasaki，et al.，Science，230，291(1985)]的cDNA。
已用高增殖性潛在集落生成細(xì)胞(HPP-CFC)分析系統(tǒng)試驗(yàn)了這些因子對早期造血先祖細(xì)胞的作用[Zont，J.Exp.Med.，159，679-690(1984)]。該文獻(xiàn)中有許多關(guān)于在HPP-CFC試驗(yàn)中有活性之因子的報(bào)告。表1中示出了這些因子的來源。下面討論已明顯定性的因子。
已將一種在人脾細(xì)胞條件培養(yǎng)基中有活性的物質(zhì)定名為協(xié)同因子(SF)。有幾種人組織和人及小鼠細(xì)胞系可產(chǎn)生稱為SF-1的SF，其可與CSF-1協(xié)同作用刺激最早期的HPP-CFC。已報(bào)導(dǎo)了存在于由人脾細(xì)胞、人胎盤細(xì)胞、5637細(xì)胞(一種膀胱癌細(xì)胞系)、EMT-6細(xì)胞(一種小鼠乳腺癌細(xì)胞系)限制的培養(yǎng)基中的SF-1。已經(jīng)確定了SF-1的特性。早期研究證明，白細(xì)胞介素-1與得自細(xì)胞系5637[Zsebo et al.，Blood，71，962-968(1988)的SF-1有交叉活性。但另外的報(bào)告則證明聯(lián)合使用白細(xì)胞介素-1(IL-1)和CSF-1，不能同使用CSF-1加部分純化之5637條件培養(yǎng)基制劑一樣刺激同種細(xì)胞集落的生成[Mc-Niece，Blood，73，919(1989)]。
存在于妊娠小鼠子宮提取物內(nèi)的協(xié)同因子是CSF-1。WEHI-3細(xì)胞(小鼠髓單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系)產(chǎn)生一種似乎與IL-3完全相同的協(xié)同因子。CSF-1和IL-3均刺激比SF-1之靶細(xì)胞更為成熟的造血祖細(xì)胞。
已證明在TC-1細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中存在另一類協(xié)同因子。該細(xì)胞系可產(chǎn)生能刺激早期髓樣和淋巴樣細(xì)胞型的因子。已將其定名為血淋巴組織生成性生長因子1(HLGF-1)。其表觀分子量為120，000[McNiece et al.，Exp.Hematol.，16，383(1988)]。
已根據(jù)其在HPP-CFC試驗(yàn)中具有活性而鑒定了已知之白細(xì)胞介素和CSF中的IL-1、IL-3及CSF-1。尚沒有從結(jié)構(gòu)上鑒定表1中所示協(xié)同活性的其他來源。基于對多肽順序和生物學(xué)活性的分析結(jié)果，可知本發(fā)明所涉及的是一種不同于IL-1、IL-3、CSF-1和SF-1的分子。
表1含有在HPP-CFC試驗(yàn)中有活性之因子的制劑來源1參考文獻(xiàn)人脾CM [Kriegler，Blood，66，503(1982)]小鼠脾CM [Bradley，Exp.Hematol.Today Baum，ed.，285(1980)]
來源1參考文獻(xiàn)大鼠脾CM [Bradley，supra，(1980)]小鼠肺CM [Bradley，supra，(1980)]人胎盤CM [Kriegler，supra，(1982)]妊娠小鼠子宮 [Bradley，supra，(1980)]GTC-C CM [Bradley，supra，(1980)]RH3 CM [Bradley，supra，(1980)]PHA PBL [Bradley，supra，(1980)]WEHI-3B CM [McNiece，Cell Biol.Int.Rep.，6，243(1982)]EMT-6 CM [McNiece，Exp.Hematol.，15，854(1987)]L-Cell CM [Kriegler，Exp.Hematol.，12，844(1984)]5637 CM [Stanley，Cell，45，667(1986)]TC-1 CM [Song，Blood，66，273(1985)]1CM＝條件培養(yǎng)當(dāng)經(jīng)胃腸道外途徑給藥時，蛋白質(zhì)常常由循環(huán)中迅速清除，因此可引發(fā)相對短期的藥理學(xué)活性。這樣就需要多次注射相對大劑量的生物活性蛋白質(zhì)，以維持治療效果。已知與相應(yīng)未修飾的蛋白質(zhì)相比，蛋白質(zhì)與聚乙二醇、聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮或聚脯氨酸等水溶性聚合物共價結(jié)合被修飾后，在血液內(nèi)的半壽期明顯延長[Abuchowski et al.，“Enzymes as Drug”，Holcenberg et al.，eds.Wiley-Inters-cience，New York，NY，367-383(1981);Newmark et al.，J.Appl.Biochem.4∶185-189(1982);Kattre et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，1487-1491(1987)]。這種修飾作用也可增加蛋白質(zhì)在水溶液中的溶解度，消除分子聚集，提高蛋白質(zhì)的物理和化學(xué)穩(wěn)定性，大大降低蛋白質(zhì)的免疫原性和抗原性。從而，與使用未經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)相比，以較少次數(shù)和較低劑量使用這種聚合物-蛋白質(zhì)加合物即可達(dá)到所期望的體內(nèi)生物學(xué)活性。
因?yàn)榫垡叶?PEG)在哺乳動物體內(nèi)毒性很低，所以將PEG與蛋白質(zhì)結(jié)合是特別適宜的[Carpenter et al.，Toxicol.Appl.Pharmacol.，18，35-40(1971)]。例如，在美國已獲準(zhǔn)使用腺嘌呤脫氨酶的PEG加合物治療人的嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷綜合癥。結(jié)合PEG所帶來的第二個優(yōu)點(diǎn)是可以有效地降低異源蛋白質(zhì)的免疫原性和抗原性。例如，可用人蛋白質(zhì)的PEG加合物治療其他種哺乳動物的疾病，而沒有激發(fā)嚴(yán)重免疫反應(yīng)的危險。
PEG等聚合物可以共價連接到蛋白質(zhì)分子中的一個或多個反應(yīng)性氨基酸殘基上，如氨基末端氨基酸的α氨基基團(tuán)，賴氨酸側(cè)鏈的ε-氨基基團(tuán)、半胱氨酸側(cè)鏈的巰基基團(tuán)、天冬氨酰和谷氨酰側(cè)鏈的羧基基團(tuán)、羧基末端氨基酸的α羧基基團(tuán)及酪氨酸側(cè)鏈等，或者連接到與某些天冬酰胺、絲氨酸或蘇氨酸殘基相連之糖基鏈的活化衍生物上。
已描述了適合與蛋白質(zhì)直接反應(yīng)的許多活化形式的PEG。可與蛋白質(zhì)氨基基團(tuán)反應(yīng)的適用PEG試劑包括羧酸的活性酯或碳酸酯衍生物，特別是那些其中離去基團(tuán)為N-羥基琥珀酰亞胺、對位硝基苯酚、咪唑或1-羥基-2-硝基苯-4-磺酸酯的衍生物。含有馬來酰亞胺基或鹵乙酰基團(tuán)的PEG衍生物是適于修飾無巰基基團(tuán)之蛋白質(zhì)的有用試劑。同樣，含有氨基、肼或酰肼基團(tuán)的PEG試劑則適合與蛋白質(zhì)中碳水化合物基團(tuán)經(jīng)高碘酸氧化所產(chǎn)生的醛反應(yīng)。
本發(fā)明的目的在于提供一種引起早期造血祖細(xì)胞生長的因子。
本發(fā)明提供了本文稱為“干細(xì)胞因子”(SCF)的新因子，該因子具有刺激包括早期造血祖細(xì)胞在內(nèi)之原始祖細(xì)胞生長的能力。這些SCF也能夠刺激神經(jīng)干細(xì)胞和原生殖干細(xì)胞等非造血干細(xì)胞。這樣因子包括純化的、天然存在的干細(xì)胞因子。本發(fā)明還涉及具有與天然存在之干細(xì)胞因子完全相同的氨基酸順序的非天然多肽，從而使之具有天然干細(xì)胞因子的造血生物學(xué)活性。
本發(fā)明還提供了適于在原核和真核宿主細(xì)胞中表達(dá)多肽產(chǎn)物的離體DNA順序，該多肽產(chǎn)物完全復(fù)制了天然存在之干細(xì)胞因子的氨基酸順序，從而具有天然干細(xì)胞因子的造血生物學(xué)活性。這樣的DNA順序包括a)

圖14B、14C、15B、15C、42和44中列出的DNA順序或其互補(bǔ)鏈;
b)可與(a)中限定之DNA順序或其片段雜交的DNA順序;以及c)除非有遺傳密碼子的簡并外，可與(a)和(b)中限定的DNA順序雜交的DNA順序。
本發(fā)明還提供了含有這些DNA順序的載體、用這些載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。本發(fā)明也包括以重組技術(shù)生產(chǎn)SCF的方法，以及治療疾病的方法。另外，也提供了包含SCF的醫(yī)藥組合物以及與SCF特異結(jié)合的抗體。
本發(fā)明還涉及由含SCF的材料中有效地回收干細(xì)胞因子的方法，該方法包括離子交換層析和/或反向液相層析分離步驟。
本發(fā)明還提供了可延長體內(nèi)半壽期并提高在哺乳動物體內(nèi)之效力的生物學(xué)活性加合物，其包括共價結(jié)合到聚乙二醇或聚乙二醇與聚丙二醇之共聚物等水溶性聚合物上的SCF，其中所說的聚合物是在一端未被烷基基團(tuán)取代或被取代的。本發(fā)明的另一個方面是涉及制備上述加合物的方法，該方法包括使SCF與至少具有一個反應(yīng)性末端基團(tuán)的水溶性聚合物反應(yīng)、純化所得到的加合物，以產(chǎn)生延長了循環(huán)半壽期并提高了生物學(xué)活性的產(chǎn)物。
圖1是純化哺乳動物SCF的陰離子交換層析圖譜。
圖2是純化哺乳動物SCF的凝膠過濾層析圖譜。
圖3是純化哺乳動物SCF的麥胚凝集素-瓊脂糖層析圖譜。
圖4是純化哺乳動物SCF的陽離子交換層析圖譜。
圖5是純化哺乳動物SCF的C4層析圖譜。
圖6顯示圖5中C4柱洗脫物的十二烷基磺酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)(SDS-PAGE)結(jié)果。
圖7是哺乳動物SCF的分析性C4層析圖譜。
圖8顯示圖7中C4柱洗脫物的SDS-PAGE結(jié)果。
圖9顯示純化的哺乳動物SCF和去糖基化哺乳動物SCF的SDS-PAGE。
圖10是純化之哺乳動物SCF的分析性C4層析圖。
圖11顯示由蛋白質(zhì)順序測定得出的哺乳動物SCF的氨基酸順序。
圖12顯示A.大鼠SCFcDNA的寡核苷核;B.人SCFDNA的寡核苷酸;C.通用的寡核苷酸。
圖13顯示A.聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增大鼠SCFcDNA的流程;B.PCR擴(kuò)增人SCF cDNA的流程。
圖14顯示A.測定大鼠基因組DNA順序的程序;B.大鼠基因組DNA的核酸順序;C.大鼠SCF cDNA的核酸順序和大鼠SCF蛋白質(zhì)的氨基酸順序。
圖15顯示A.測定人基因組DNA順序的程序;B.人基因組DNA的核酸順序;C.人SCF cDNA的復(fù)合核酸順序及SCF蛋白質(zhì)的氨基酸順序。
圖16顯示一一對應(yīng)排列的人、猴、狗、小鼠和大鼠SCF蛋白質(zhì)的氨基酸順序。
圖17顯示哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體V19.8SCF的結(jié)構(gòu)。
圖18顯示哺乳動物CHO細(xì)胞表達(dá)載體pDSVE.1的結(jié)構(gòu)。
圖19顯示大腸桿菌表達(dá)載體pCFM1156的結(jié)構(gòu)。
圖20顯示A.哺乳動物SCF的放射免疫分析結(jié)果;B.免疫沉淀之哺乳動物SCF的SDS-PAGE結(jié)果。
圖21顯示重組人SCF的Western印跡。
圖22顯示重組大鼠SCF的western印跡。
圖23顯示COS-1細(xì)胞產(chǎn)生的重組大鼠SCF對骨髓移植之影響的直方圖。
圖24顯示重組大鼠SCF治療Steel小鼠巨細(xì)胞性貧血的效果。
圖25顯示用重組大鼠SCF處理之Steel小鼠的外周血白血細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)。
圖26顯示用重組大鼠SCF處理之Steel小鼠的血小板計(jì)數(shù)。
圖27顯示用重組大鼠SCF1-164PEG25處理之Steel小鼠的分化WBC計(jì)數(shù)。
圖28顯示用重組大鼠SCF1-164PEG25處理之Steel小鼠的淋巴細(xì)胞亞群。
圖29顯示重組人順序SCF處理正常靈長目動物后提高外周血WBC計(jì)數(shù)的效果。
圖30顯示重組人順序SCF處理正常靈長目動物后提高血細(xì)胞比容和血小板計(jì)數(shù)的效果。
圖31顯示下列圖譜A.用重組人SCF1-162刺激的人骨髓細(xì)胞集落;B.圖31A所示集落中Wright-Giemsa染色的細(xì)胞。
圖32顯示圖33中所示層析圖之S-Sepharose柱洗脫物的SDS-PAGEA.加還原劑;B.無還原劑。
圖33是對大腸桿菌產(chǎn)生之重組人SCF所作S-Sepharose柱層析的層析圖。
圖34顯示對圖35所示層析圖中C4柱洗脫物所作SDS-PAGE分析的結(jié)果A.加還原劑;B.無還原劑。
圖35是對大腸桿菌產(chǎn)生之重組人SCF所作C4柱層析的層析圖。
圖36是對CHO產(chǎn)生的重組大鼠SCF所作Q-Sepharose柱層析的層析圖。
圖37是CHO產(chǎn)生的重組大鼠SCF之C4柱層析的層析圖。
圖38顯示對圖37所示層析圖中C4柱洗脫物所作SDS-PAGE分析的結(jié)果。
圖39顯示CHO產(chǎn)生的、純化的重組大鼠SCF在去糖基化前后所作SDS-PAGE分析的結(jié)果。
圖40所示A.重組大鼠聚乙二醇化SCF1-164反應(yīng)混合物的凝膠過濾層析圖;B.未修飾的重組大鼠SCF1-164的凝膠過濾層析圖。
圖41顯示結(jié)合到新鮮白血病母細(xì)胞上的標(biāo)記的SCF。
圖42顯示得自HT1080纖維肉瘤細(xì)胞系的人SCF cDNA順序。
圖43顯示表達(dá)人SCF1-248之COS-7細(xì)胞和表達(dá)人SCF1-164之CHO細(xì)胞的放射自顯影圖譜。
圖44顯示得自5637膀胱癌細(xì)胞系的人SCF cDNA順序。
圖45顯示受放射線照射小鼠經(jīng)SCF處理后提高了存活期。
圖46顯示受幅射小鼠在作5%股骨骨髓移植和SCF處理后提高了存活期。
圖47顯示在作0.1和20%股骨骨髓移殖及SCF處理后，提高了受幅射之小鼠的存活期。
下文以優(yōu)選方案的形式給出了實(shí)踐本發(fā)明的舉例說明，本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員將會從以下的詳細(xì)描述中了解到本發(fā)明的許多方面及優(yōu)點(diǎn)。
根據(jù)本發(fā)明，提供了新的干細(xì)胞因子以及編碼這些SCF之全部或其部分順序的DNA順序。術(shù)語“干細(xì)胞因子”或“SCF”是指天然存在的SCF(如天然人SCF)及非天然存在的多肽(即與天然SCF不同者)，后者具有天然存在之干細(xì)胞因子的氨基酸順序及該順序的糖基化復(fù)制本，從而使之具有天然存在之干細(xì)胞因子的造血生物學(xué)活性。干細(xì)胞因子具有刺激早期造血祖細(xì)胞生長的能力，使之能夠成熟為紅細(xì)胞樣細(xì)胞、巨核細(xì)胞、粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及巨噬細(xì)胞。用SCF處理哺乳動物可使髓樣和淋巴樣譜系的造血細(xì)胞數(shù)絕對增加。干細(xì)胞的一個特征性標(biāo)志是它們能夠分化成髓樣和淋巴樣細(xì)胞[Weis-sman，Science，241，58-62(1988)]。用重組大鼠SCF處理Steel小鼠(實(shí)施例8B)可以增加粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、紅細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及血小板數(shù)。用重組人SCF處理正常靈長目動物可增加髓樣和淋巴樣細(xì)胞數(shù)(實(shí)施例8C)。
在成黑素細(xì)胞、生殖細(xì)胞、造血細(xì)胞、腦和脊索細(xì)胞的遷移途徑及固定部位中，有細(xì)胞對SCF的胚胎期表達(dá)。
早期造血祖細(xì)胞已富集在用5-氟尿嘧啶(5-FU)處理的哺乳動物骨髓中。化學(xué)治療藥物(5-FU)可選擇性地消耗后期造血祖細(xì)胞。SCF對5-FU處理后的骨髓具有活性。
SCF的生物活性和組織分布的型式說明了其在治療各種干細(xì)胞缺失的胚胎發(fā)生和血生成，以及其容量中的重要作用。
本發(fā)明提供的DNA順序包括摻入適于經(jīng)選擇之非哺乳動物宿主表達(dá)的“優(yōu)選的”密碼子;規(guī)定限制性核酸內(nèi)切酶的切割位點(diǎn);提供便于構(gòu)建易表達(dá)之載體的其他起始、終止或中間DNA順序。本發(fā)明還提供編碼SCF之多肽類似物或衍生物的DNA順序，前者在一個或多個氨基酸的特性或定位上不同于天然存在者(即含有比指定之SCF有較少殘基的缺失類似物;取代類似物，其中一個或多個指定的殘基被其他殘基取代;以及其中有一個或多個氨基酸殘基被加到多肽之末端或中間部分上的加成類似物)，且其可共有天然存在形式的某些或全部特性。本發(fā)明特別提供了編碼SCF之全長未加工氨基酸順序的DNA順序以及編碼已加工形式者的DNA順序。
本發(fā)明的新的DNA順序包括用于在原核和真核宿主細(xì)胞中表達(dá)多肽產(chǎn)物的順序，該多肽產(chǎn)物至少具有天然存在之SCF的一部分原始結(jié)構(gòu)構(gòu)象以及一種或多種生物學(xué)特性。本發(fā)明的DNA順序具體地包括(a)圖14B、14C、15B、15C、42和44中列出的DNA順序或其互補(bǔ)鏈;(b)與圖14B、14C、15B、15C、42和44中所示DNA順序或其片段雜交(在實(shí)施例3所述的雜交條件或更為嚴(yán)格的條件下)的DNA順序;以及(c)除存在基團(tuán)密碼子的簡并性的情況外，可與圖14B、14C、15B、15C、42和44中所示DNA順序雜交的DNA順序。(b)和(c)部分中所具體包括的是編碼SCF之等位基因變異形式和/或編碼其他種哺乳動物SCF的基因組DNA順序，以及人工制造的編碼SCF、SCF片段和SCF類似物的DNA順序。該DNA順序可摻入利于微生物宿主中信使RNA轉(zhuǎn)錄和翻譯的密碼子?？砂凑誂lton等人的方法(PCT已公開的專利申請WO83/04053)很容易地構(gòu)建這種人造的順序。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本文描述的編碼有SCF活性之多肽的DNA順序，還具有信息資料價值，其提供了迄今尚不能得到的哺乳動物蛋白質(zhì)的氨基酸順序。該DNA的價值還在于它可作為一種以種種重組技術(shù)大規(guī)模合成SCF的有用產(chǎn)品。換句話說，本發(fā)明提供的DNA順序可用于產(chǎn)生新的和有用的病毒及環(huán)形質(zhì)粒DNA載體、新的和有用的被轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的原核和真核宿主細(xì)胞(包括培養(yǎng)生長的細(xì)菌、酵母細(xì)胞和哺乳動物細(xì)胞)，以及培養(yǎng)這些可表達(dá)SCF和其相關(guān)產(chǎn)物之宿主細(xì)胞的方法。
本發(fā)明的DNA順序也是用作標(biāo)記探針的合適材料，該探針可用來分離編碼SCF的人基因組DNA和編碼相關(guān)蛋白質(zhì)的其他基因，以及分離其他種哺乳動物的cDNA和基因組DNA順序。DNA順序也可用于合成蛋白質(zhì)(如在昆蟲細(xì)胞內(nèi))的各種可替代的方法中，或用于人或其他哺乳動物的基因治療?？赏麑⒈景l(fā)明的DNA順序用于產(chǎn)生新的轉(zhuǎn)基因哺乳動物，以其作為大量生產(chǎn)SCF和SCF產(chǎn)品的真核“宿主”[總地參見Palmiter et al.，Science，222，809-814(1983)]。
本發(fā)明提供了純化的和分離的天然SCF(即具有與天然形式相同一級、二級和三級構(gòu)象的純化或人工產(chǎn)物，且糖基化特征亦與天然材料完全相同者)，以及具有天然干細(xì)胞因子之一級結(jié)構(gòu)構(gòu)象(即氨基酸殘基的連續(xù)順序)并完全復(fù)現(xiàn)了天然干細(xì)胞因子的糖基化作用，從而使之具有天然SCF之造血生物學(xué)活性的非天然多肽。這樣的多肽包括衍生物及類似物。
在一優(yōu)選方案中，對SCF的定性是經(jīng)基因組或cDNA克隆方法或基因合成方法得到外源DNA順序，然后制取該順序在原核或真核宿主內(nèi)表達(dá)的產(chǎn)物(如由培養(yǎng)的細(xì)菌、酵母、較高等植物、昆蟲及哺乳動物細(xì)胞中表達(dá))，進(jìn)而證實(shí)其存在。即是說，在一優(yōu)選實(shí)施方案中SCF是“重組的SCF”。在典型酵母菌(如釀酒酵母)或原核細(xì)胞(如大腸桿菌)宿主中表達(dá)的產(chǎn)物是與任何哺乳動物蛋白質(zhì)都沒有關(guān)聯(lián)的。而在脊椎動物[如非人類哺乳動物(如COS或CHO)和鳥類]細(xì)胞中表達(dá)的產(chǎn)物也與任何人蛋白質(zhì)沒有關(guān)聯(lián)。根據(jù)使用的宿主不同，本發(fā)明的多肽是由哺乳動物或其他真核生物的碳水化合物糖基化的，或者是非糖基化的?？墒褂肔ee等人所述的技術(shù)[J.Biol.Chem.，264，13848(1989)]改換宿主細(xì)胞。本發(fā)明的多肽還可包括起始蛋氨酸殘基(在位置-1處)。
除天然存在的SCF的等位基因形式外，本發(fā)明還包括其他SCF產(chǎn)物，如SCF的多肽類似物。所說的類似物包括SCF的片段。依照上述已公開的Alton等人的方法(WO83/04053)，可以很容易地設(shè)計(jì)并制得編碼適于微生物表達(dá)之多肽的基因，這樣的多肽就其一個或多個殘基的特性或定位來說，具有不同于本文指定之多肽的一級構(gòu)象(如取代、末端和中間加入及缺失)。另外，可以用已知的位點(diǎn)特異性誘變技術(shù)很容易地對cDNA和基因組基因進(jìn)行修飾，用以產(chǎn)生SCF的類似物和衍生物。這些產(chǎn)物至少有一種SCF的生物學(xué)性質(zhì)，而在其他方面則有所不同。例如本發(fā)明產(chǎn)物包括經(jīng)缺失而縮短的;或?qū)λ庾饔酶鼮榉€(wěn)定的(因此也可以比天然產(chǎn)物有延長的或持續(xù)更長時間的效果);或業(yè)經(jīng)改變而加入或缺失一個或多個潛在的O-糖基化和/或N-糖基化作用的位點(diǎn);或者有一個或多個缺失的半胱氨酸殘基或被丙氨酸、絲氨酸等殘基所取代，并使之更易于以活性形式由微生物體系中分離出來;或者具有一個或多個被苯丙氨酸取代的酪氨酸殘基，從而能較為容易地結(jié)合到靶蛋白質(zhì)或靶細(xì)胞的受體上。本發(fā)明還包括只重復(fù)SCF內(nèi)一部分連續(xù)氨基酸順序或二級構(gòu)象的多肽片段，該片段可具有SCF的一種特性(如受體結(jié)合)而沒有其他特性(如早期造血細(xì)胞生長活性)。值得注意的是，對于本發(fā)明的一種或多種產(chǎn)物來說，在用于治療[見Weiland et al.，Blut，44，173-175(1982)]或其他目的(如在SCF拮抗作用的檢測中)時，有的活性并不是必不可少的。競爭性拮抗物是非常有用的，例如在過量產(chǎn)生SCF的情況下，或者在人白血病病例中惡性細(xì)胞過度表達(dá)SCF受體時(如實(shí)施例13所述白血病母細(xì)胞中可過度表達(dá)SCF受體)。
本發(fā)明的多肽類似物的適用性是具有報(bào)導(dǎo)中所說的合成肽的免疫學(xué)特性，該合成肽基本上復(fù)制了天然蛋白質(zhì)、糖蛋白和核蛋白的氨基酸順序。更具體地說，已證明有相對低分子量的多肽可參予在持續(xù)時間和程度上與生理學(xué)上有意義的蛋白質(zhì)(如病毒抗原、多肽激素等)所引起之免疫反應(yīng)相似的反應(yīng)。這些多肽參予的免疫反應(yīng)包括誘發(fā)免疫學(xué)活性動物體內(nèi)特異抗體的生成[Lerner et al.，Cell，23，309-310(1981);Ross et al.，Nature，294，654-656(1981);Walter et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77，5197-5200(1980);Lerner et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，78，3403-3407(1981);Walter et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，78，4882-4886(1981);Wong et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79，5322-5326(1982);Baron et al.，Cell，28，395-404(1982);Dressman et al.，Nature，295，185-160(1982);Lerner，Scientific Ame-rican，248，66-74(1983)]。另外，Kaiser等人[Science，223，249-255(1984)]述及合成多肽的生物學(xué)和免疫學(xué)性質(zhì)，提到其具有肽激素的二級結(jié)構(gòu)，而沒有它們的一級結(jié)構(gòu)構(gòu)象。
本發(fā)明還包括一類由互補(bǔ)于人cDNA或SCF基因組DNA順序的一部分DNA編碼的多肽，即Tramontano等人所述的“互補(bǔ)性倒轉(zhuǎn)蛋白質(zhì)”(“complementary inverted proteins”Nucleic Acid Res.，12，5049-5059(1984))。
本發(fā)明的代表性SCF多肽包括但不僅限于圖15C中所示的SCF1-148、SCF1-162、SCF1-164、SCF1-165、和SCF1-183;圖42中所示的SCF185、SCF1-188、SCF1-189和SCF1-248;以及圖44中所示的SCF1-157、SCF1-160、SCF1-161和SCF1-220。
可使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的技術(shù)純化SCF。本發(fā)明的目的包括由條件培養(yǎng)基或人尿、血清等含SCF的材料中純化SCF的方法，該方法包括下述的一個或多個步驟對含SCF的材料進(jìn)行離子交換層析(包括陽離子或陰離子交換層析)，對含SCF的材料進(jìn)行反向液相層析(如使用固相化C4或C6樹脂)、對液體材料進(jìn)行固相化凝集素層析(即將SCF結(jié)合到固相凝集素上，并使用可競爭這種結(jié)合的糖進(jìn)行洗脫)。有關(guān)這些方法的詳細(xì)描述可參見涉及SCF純化方法的實(shí)施例1、10和11。也可用Lai等人的美國專利4，667，016實(shí)施例2中所述的技術(shù)純化干細(xì)胞因子。
可使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，如美國系列申請?zhí)?21，444(共同申請人、題目為促紅細(xì)胞生成素異構(gòu)型，申請日1989年10月13日，已列為本文參考文獻(xiàn))中所述的技術(shù)分離異構(gòu)型SCF。
本發(fā)明還包括用于作SCF治療的醫(yī)藥組合物，該組合物包含治療有效量的本發(fā)明的多肽產(chǎn)物，以及適當(dāng)?shù)南♂寗⒎栏瘎⒃鋈軇?、乳化劑、佐劑?或載體。這里所說的“治療有效量”是指在一定條件和給藥途徑下，足以產(chǎn)生治療效量的用藥量。該組合物可以是液體或凍干品或干燥制劑，且包含有不同緩沖液成分(如Tris-HCl、乙酸鹽、磷酸鹽)、pH和離子強(qiáng)度的稀釋劑、防止吸附于表面上的白蛋白或明膠等添加劑、去污劑(如Tween 20、Tween 80、Pluronic F68、膽酸鹽)、增溶劑(如甘油、聚乙二醇)、抗氧劑(如抗壞血酸、焦亞硫酸鈉)、防腐劑(如乙基汞硫代水楊酸鈉、苯甲醇、parabens)、填充劑或張力校正劑(如乳糖、甘露糖)、且包括聚乙二醇等聚合物與蛋白質(zhì)的共價結(jié)合(以下實(shí)施例12所述)、與金屬的絡(luò)合、或活性材料摻入到多聚化合物(如聚乳酸、聚羥基乙酸、水凝膠等)中或其顆粒制劑的表面上，或摻入脂質(zhì)體、微乳劑、膠粒、單片層或多片層囊泡、血影細(xì)胞或原生質(zhì)球中。這樣的組合物將影響到SCF的物理狀態(tài)、溶解度、穩(wěn)定性、體內(nèi)釋放速率以及體內(nèi)清除速率。對組合物的選擇將依據(jù)于有SCF活性之蛋白質(zhì)的物理和化學(xué)性質(zhì)。例如，由膜結(jié)合形式之SCF制得的產(chǎn)品可要求使用含去污劑的配方。控制或維持釋放的組合物應(yīng)有親脂性包裹物(如脂肪酸、蠟、油)。本發(fā)明還包括用聚合物(如polo-xamers或poloxamines)和SCF包層的顆粒組合物，其中SCF是與抗組織特異性受體的抗體配基或抗原偶聯(lián)的，或與組織特異性受體的配基偶聯(lián)的。有關(guān)本發(fā)明組合物的其他實(shí)施例涉及適于非胃腸道、肺、鼻和口腔等不同給藥途徑的顆粒形式、保護(hù)性包衣、蛋白酶抑制劑或滲透增強(qiáng)劑等。
本發(fā)明還包括含一種或多種其他造血因子的組合物，這些附加因子包括EPO、G-CSF、GM-CSF、CSF-1、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IGF-1或LIF(白血病抑制因子)。
本發(fā)明的多肽可以是通過與可檢測的標(biāo)記物質(zhì)結(jié)合而“被標(biāo)記的”(如用125I放射標(biāo)記的或生物素化的)，以提供用于檢測或定量分析固體組織及血液或尿液樣品中之SCF或其細(xì)胞受體的試劑。
生物素化的SCF可與固相化鏈霉抗生物素蛋白(streptavidin)合用，用以清除自體骨髓移植之骨髓中的白血病母細(xì)胞。生物素化的SCF還可與固相化鏈霉抗生物素蛋白合用，以在自體或異體骨髓移植中富集自體或異源干細(xì)胞。SCF的毒素結(jié)合物，如與蓖麻蛋白[Uhr，Prog.Clin，Biol.Res.，288，403-412(1989)]、白喉內(nèi)毒素[Moolten，J.Natl.Con.Inst.，55，473-477(1975)]及放射性同位素的結(jié)合物可直接用于抗腫瘤治療(實(shí)施例13)或作為骨髓移植的條件攝生劑。
當(dāng)用可檢測的標(biāo)記物(如放射性標(biāo)記和非同位素標(biāo)記如生物素)標(biāo)記后，本發(fā)明的核酸產(chǎn)物可用于雜交過程中，用以確定SCF基因或任何相關(guān)基因家族在染色體圖中的位置。它們也可用于在基因水平上鑒定人SCF基因紊亂，并可作為基因標(biāo)記物用于鑒定相鄰基因及其紊亂。人SCF基因位于第12對染色體上，鼠SCF基因則位于第10對染色體的S1位點(diǎn)上。
單獨(dú)使用SCF或SCF與其他治療結(jié)合使用，可有效地治療多種造血功能紊亂。單獨(dú)使用SCF或結(jié)合使用一種或多種附加造血因子，如EPO、G-CSF、GM-CSF、CSF-1、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IGF-I或LIF，可用于治療造血功能系亂。
可用SCF治療一系列因毒性、輻射或免疫損傷造成的特征在于功能性骨髓細(xì)胞亞群數(shù)目減少的干細(xì)胞功能異常。再生障礙性貧血也是一種干細(xì)胞功能失調(diào)癥，其表現(xiàn)為造血組織被脂肪所代替以及各類血細(xì)胞減少。SCF可增加造血細(xì)胞數(shù)，故可有效地治療再生障礙性貧血(實(shí)施例8B)?？捎肧teel小鼠作為人再生障礙性貧血的模型[Jones，Exp.Hematol.11，571-580，(1983)]。在治療再生障礙性貧血中，利用相關(guān)的細(xì)胞激活素、GM-CSF已獲得了理想的效果[Antin，et al.，Blood，70，129a(1987)]。陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿癥(PNH)是一種以形成有缺陷的血小板和粒細(xì)胞及異常紅細(xì)胞為特征的干細(xì)胞功能失調(diào)癥。
可用SCF治療許多疾病。這些疾病包括脊髓纖維化癥、脊髓硬化癥、骨硬化癥、轉(zhuǎn)移性癌、急性白血病、復(fù)合性骨髓瘤、何杰金氏病、淋巴瘤、Gaucher氏病、尼曼氏病、累-塞二氏病、頑固性低色貧血、Di Guglielmo綜合癥、黑熱病、結(jié)節(jié)病、原發(fā)性脾各類血細(xì)胞減少、粟粒性結(jié)核、暴發(fā)性敗血癥、播散性真菌病、瘧疾、VB12和葉酸缺乏癥、VB6缺乏癥、先天再生障礙性貧血、高色素生成性疾病如花斑癥和白瘢風(fēng)。實(shí)施例8B和8C中舉例說明了SCF對類紅細(xì)胞、巨核細(xì)胞和粒細(xì)胞的刺激作用。
SCF可促進(jìn)原始生殖細(xì)胞、神經(jīng)脊衍生的黑素細(xì)胞、后脊素產(chǎn)生的連合軸突、消化道濾泡細(xì)胞、中腎和后腎小管以及嗅球的生長，當(dāng)這些部位出現(xiàn)特異性組織損傷時是特別有用的。SCF可用于治療神經(jīng)損傷，并且是神經(jīng)細(xì)胞的生長因子。SCF可用于體外受精過程或治療不育癥。SCF還可用于治療因放射治療或化療引起的腸道損傷。
可用SCF、抗SCF抗體或SCF-毒素結(jié)合物治療干細(xì)胞骨髓增殖性疾病，如真性紅細(xì)胞增多、慢性髓細(xì)胞白血病、特發(fā)性骨髓外髓細(xì)胞化生、原發(fā)性血小板減少及急性白血病。
有許多病例記載造血細(xì)胞生長因子G-CSF、GM-CSF和IL-3促進(jìn)了白血病細(xì)胞的增殖[Delwel et al.，Blood，72，1944-1949(1988)]。因?yàn)樵S多化學(xué)治療藥物的成功取決于惡性細(xì)胞生活周期比正常細(xì)胞更活躍這一事實(shí)，所以單用SCF或結(jié)合其他因子使用，可以作為惡性細(xì)胞的生長因子，使之對化學(xué)治療藥物更為敏感。實(shí)施例13中即顯示了白血病母細(xì)胞上可過度表達(dá)SCF受體。
目前正在研究許多重組造血因子提高因化學(xué)或放射治療所造成的白細(xì)胞降低的能力問題。盡管這些因子在這方面是很有用的，但也存在著受到損傷的早期造血間隔期(特別是因輻射引起的)，因此必須在這些較晚作用的生長因子能發(fā)揮其最適作用之前使之再次增殖。單獨(dú)使用SCF或與這些因子聯(lián)合使用可進(jìn)一步減少或消除因化療或放射治療引起的白細(xì)胞與血小板的降低。此外，SCF可使病人耐受更強(qiáng)力的抗腫瘤或放射治療(實(shí)施例19)。
在同源、同種或自體骨髓移植中，可使用SCF增加造血祖細(xì)胞。已表明使用造血生長因子可以減少骨髓移植后嗜中性細(xì)胞數(shù)恢復(fù)的時間[Donahue et al.，Nature，321，872-875(1986);Welte et al.，J.Exp.Med.，165，941-948(1987)]。對于骨髓移植，可單獨(dú)或聯(lián)合使用以下三種方案在抽骨髓或外周血白色體形成之前單用SCF或聯(lián)合使用其他造血因子處理供體;移植前于體外處理骨髓，以活化或擴(kuò)增細(xì)胞數(shù);最后，可處理接受體以提高供體骨髓的植入量。
可基于轉(zhuǎn)染(或用反錄病毒感染)造血干細(xì)胞，用SCF提高基因治療的效能。SCF可以促進(jìn)被轉(zhuǎn)染之早期造血祖細(xì)胞的生長和增殖。可單用SCF或聯(lián)合使用IL-6、IL-3(或這兩者)處理培養(yǎng)物。一旦被轉(zhuǎn)染后，即可將這些骨髓移植物中的細(xì)胞輸入有遺傳疾病的病人體內(nèi)[Lim，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86，8892-8896(1989)]?？捎糜谥委熯z傳病的基因包括腺嘌呤脫氨酶、葡糖腦苷脂酶、血紅蛋白及囊性纖維變性基因。
SCF可單獨(dú)或聯(lián)合其他因子如IL-7用于治療獲得性免疫缺陷癥(AIDS)或嚴(yán)重的聯(lián)合免疫缺陷狀態(tài)(SCID)(實(shí)施例14)。這種作用的例證在于SCF治療可以提高循環(huán)T輔助細(xì)胞CD4+，OKT+4)的絕對水平。這些細(xì)胞是導(dǎo)致愛滋病病人免疫缺陷之人免疫缺陷病毒(HIV)的主要靶細(xì)胞[Montagnier，"Human T-Cell Leukemia/Lymphoma Virus"，ed.R.C.Gallo，Cold Spring Harbor，New York，369-379(1984)]。此外，SCF可用于對抗AZT等抗HIV藥物的骨髓抑制作用[Gogu，Life Sciences，45，No.4(1989)]。
急性失血后可用SCF加速造血功能的恢復(fù)。
用SCF作體內(nèi)治療，可加強(qiáng)免疫系統(tǒng)抗腫瘤能力。Rosenberg等人(N.Eng.J.Med.，313，1485(1987)]描述了用最近克隆的細(xì)胞激活素(IL-2)直接增強(qiáng)免疫功能，即是這種治療實(shí)用性的一個例子。
SCF與一種或多種其他造血因子合用時，可間隔短時間分開給藥或一同給藥。在用SCF治療前，先擴(kuò)增祖細(xì)胞群體，而后者可以對終末起作用的造血因子(如G-CSF或EPO)起反應(yīng)。給藥途徑可以是靜脈內(nèi)、腹腔內(nèi)、皮下或肌肉內(nèi)。
本發(fā)明還涉及與干細(xì)胞因子特異結(jié)合的抗體。下文實(shí)施例7描述了生產(chǎn)多克隆抗體的方法。本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方案涉及與SCF特異結(jié)合的單克隆抗體(見實(shí)施例20)。與常用的(多克隆)抗體制劑(其典型地包括針對不同抗原決定基的不同抗體)相反，每種單克隆抗體都是針對抗原上單一決定基的。單克隆抗體可用于改善借助抗原-抗體結(jié)合之診斷和分析方法的選擇性和特異性。另外，還可用于中和或從血清中除去SCF。單克隆抗體的第二個優(yōu)點(diǎn)是它們可由培養(yǎng)的雜交瘤細(xì)胞合成，而沒有其他免疫球蛋白污染。可從培養(yǎng)的雜交瘤細(xì)胞或腹腔內(nèi)注射了雜交瘤的小鼠腹水液中制取單克隆抗體。最初由Kohler和Milstein[Eur.J.Immunol.6，511-519(1976)]描述的雜交瘤技術(shù)業(yè)已廣泛用于產(chǎn)生能高水平分泌抗許多特異抗原之單克隆抗體的雜交細(xì)胞系。
下列實(shí)施例旨在進(jìn)一步舉例描述本發(fā)明，而不構(gòu)成對本發(fā)明范圍的限制。
實(shí)施例1由Buffalo大鼠肝細(xì)胞條件培養(yǎng)基中純化/鑒定干細(xì)胞因子A.體外生物學(xué)試驗(yàn)1.HPP-CFC試驗(yàn)天然哺乳動物大鼠SCF和重組大鼠SCF蛋白質(zhì)具有多種不同的生物學(xué)活性?；钚灾皇瞧鋵υ缙谠煅?xì)胞的影響?？捎酶咴鲋承詽撛诩湫纬杉?xì)胞(HPP-CFC)檢測法檢測到這種活性[Zsebo，et al.，supra(1988)]、為了研究這些因子對早期造血細(xì)胞的影響，HPP-CFC檢測系統(tǒng)中須使用從5-氟尿嘧啶(5-FU)處理后2天的動物體內(nèi)得到的小鼠骨髓細(xì)胞?；熕幬?-FU可選擇性地殺滅晚期造血祖細(xì)胞，因而檢測早期祖細(xì)胞及作用于這些細(xì)胞的因子。在CSF-1或IL-6存在下將大鼠SCF接種到半固體培養(yǎng)物中。該瓊脂培養(yǎng)物含有McCoys完全培養(yǎng)基(GIBCO)、20%胎牛血清、0.3%瓊脂和2×105個骨髓細(xì)胞/ml。McCoys完全培養(yǎng)基含有下列成分1×McCoys培養(yǎng)基中添加0.1mM丙酮酸鹽、0.24×必需氨基酸、0.24×非必需氨基酸、0.027%碳酸氫鈉、0.25×維生素、0.72mM甘氨酰胺、25μg/mlL-絲氨酸和12μg/mlL-天冬酰胺。骨髓細(xì)胞得自靜脈注射了150mg/Kg5-FU的Balb/C小鼠。用5-FU處理后2天收獲小鼠股骨沖洗出骨髓。鋪板前用紅細(xì)胞溶解劑(Becton Dickeson)溶解紅細(xì)胞。將含上述混合物的試驗(yàn)物質(zhì)鋪敷在30mm平皿中。14天后刮下含數(shù)千個細(xì)胞的集落(直徑大于1mm)。該檢測法用于天然哺乳動物細(xì)胞產(chǎn)生之大鼠SCF的整個純化過程。
在一典型試驗(yàn)中，大鼠SCF引起所鋪敷的每200，000個細(xì)胞約有50個HPP-CFC增殖。大鼠對5-FU處理的小鼠骨髓細(xì)胞有協(xié)同增效活性;該檢測中，如只存在單一因子而沒有合用SCF和CSF-1或SCF和IL-6(有活性)則將不形成HPP-CFC集落。
2.MC/9檢測法天然產(chǎn)生的和重組的大鼠SCF的另一個有用的活性是能夠引起IL-4依賴性小鼠肥大細(xì)胞系MC/9(ATCC CRL8306)的增殖。按照ATCC CRL8306法將MC/9細(xì)胞與一種IL-4源一起培養(yǎng)。該生物檢測法中使用的培養(yǎng)基是RPMI-1640.4%胎牛血清、5×10-5M2-巰基乙醇和1×谷氨酰胺-Pen-strep。不需加另外的生長因子，MC/9細(xì)胞即可對SCF有增殖反應(yīng)。檢測這種增殖的方法是，首先在沒有生長因子的條件下將細(xì)胞培養(yǎng)24小時，在含試驗(yàn)樣品之96小井培養(yǎng)板各小井內(nèi)加5000個細(xì)胞培養(yǎng)48小時，用0.5μCi3H-胸苷(比放射活性為20Ci/mmol)脈沖處理4小時，將細(xì)胞收獲到玻璃纖維濾膜上，然后測定特異結(jié)合的放射活性。在本實(shí)施例C2部分所述的ACA54凝膠過濾步驟之后，用該方法檢測哺乳動物細(xì)胞衍生之大鼠SCF的純化過程。一般說來，SCF可使cpm數(shù)超出本底4-10倍。
3.CFU-GM
已經(jīng)確定了在沒有干擾集落刺激因子(CSF)的情況下純化的天然和重組哺乳動物SCF對正常未耗盡之小鼠骨髓細(xì)胞的作用。用CFU-GM檢測法[Broxmeyer et al.，Exp.Hematol.，5，87(1977)]估測SCF對正常骨髓的影響。簡單地說，在溶解紅血細(xì)胞后將整個骨髓細(xì)胞鋪敷在含有試驗(yàn)物質(zhì)的半固態(tài)瓊脂培養(yǎng)基上。10天后記錄含多于40個細(xì)胞簇的集落。可將瓊脂培養(yǎng)物置于玻片上干燥、經(jīng)特殊組織學(xué)染色確定細(xì)胞的形態(tài)學(xué)。
對于正常小鼠骨髓，純化的哺乳動物大鼠SCF是一種多潛能CSF，其可在無需加其他因子的情況下刺激含成熟細(xì)胞、中性白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞及巨核細(xì)胞之集落的生長。在鋪敷的200，000個細(xì)胞中，有100多個細(xì)胞集落生長了10天以上。大鼠及人重組SCF與EPO合用可刺激紅細(xì)胞樣細(xì)胞的產(chǎn)生(見實(shí)施例9)。
B.條件培養(yǎng)基將得自美國典型培養(yǎng)物保藏中心的Buffalo大鼠肝(BRL)3A細(xì)胞(ATCC CRL 1442)培養(yǎng)在20升灌注培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)的微載體上，以產(chǎn)生SCF。除用濾網(wǎng)固定微載體和充氧管路外，該系統(tǒng)還使用一個Biolafitte發(fā)酵器(ICC-20型)。通過一個阻隔閥和計(jì)算機(jī)控制的泵系統(tǒng)，定時反向沖洗，以保持75微米篩網(wǎng)不被微載體阻塞。每個篩網(wǎng)都可起到培養(yǎng)基供入和收集網(wǎng)的作用。這種振蕩流動方式可確保篩網(wǎng)不被阻塞。通過一個裝有硅酮管(長50英尺、內(nèi)徑0.25英吋，壁厚0.03英吋)的螺旋管提供氧合作用。用于培養(yǎng)BRL 3A細(xì)胞的生長培養(yǎng)基是最低基本培養(yǎng)基(含Earle氏鹽)(GIBCO)、2mM谷氨酰胺、3g/L葡萄糖、磷酸胰蛋白胨(2.95g/L)、5%胎牛血清和5%小牛血清。除沒有血清外，收獲培養(yǎng)基與之相同。用生長于旋轉(zhuǎn)瓶內(nèi)并經(jīng)胰酶消化除去的3×109個BRL 3A細(xì)胞接種含Cytodex 2微載體(Pharmacia，濃度為5g/L)的反應(yīng)器。使細(xì)胞附著于微載體上并在其上生長8天。必要時可根據(jù)葡萄糖消耗情況通過反應(yīng)器輸注生長培養(yǎng)基。葡萄糖濃度維持在大約1.5g/L。8天后，向反應(yīng)器內(nèi)輸注6倍體積的無血清培養(yǎng)基以去除大部分血清(蛋白濃度＜50μg/ml)。反應(yīng)器分批工作直到葡萄糖濃度降到2g/L以下。此后，使反應(yīng)器以大約10升/天的連續(xù)輸注速率工作。通過調(diào)整CO2流速將培養(yǎng)物的pH維持在6.9±0.3。必要時通過補(bǔ)充純氧使溶解氧維持在20%以上。溫度維持在37±0.5℃。
由上述系統(tǒng)中產(chǎn)生大約336升無血清條件培養(yǎng)基，用作純化天然哺乳動物細(xì)胞衍生之大鼠SCF的起始材料。
C.純化除特別說明者外，所有純化工作均在4℃下進(jìn)行。
1.DEAE-纖維素陰離子交換層析通過0.45μ Sartocapsules(Sartorius)過濾，澄清無血清培養(yǎng)BRL 3A細(xì)胞所產(chǎn)生的條件培養(yǎng)基。以相似方法，對不同批量的培養(yǎng)基(41升、27升、39升、30.2升、37.5升和161升)分別進(jìn)行濃縮、滲濾/緩沖液交換和DEAE-纖維素陰離子交換層析。然后合并DEAE纖維素收集物，并在本實(shí)施例C2-5部分中作為一批作進(jìn)一步加工。為舉例說明，按下述方法處理41升這一批使用有4個截留分子量為10，000之聚砜膜盒的Millipore Pellicon正切流動式超濾裝置(總膜面積20ft2、泵速～1095ml/min，過濾速度250-315ml/min)將條件培養(yǎng)基濃縮到大約700ml。然后向濃縮物內(nèi)加入500ml50mM Tris-HCl(pH7.8)、使用正切流動式超濾裝置重新濃縮到500ml，并將此處理過程重復(fù)6次來完成滲濾/緩沖液交換，以準(zhǔn)備陰離子交換層析。最后使?jié)饪s/滲濾的制劑恢復(fù)到700ml。將制劑加到已用50mM Tris-HCl(pH7.8)緩沖液平衡的DEAE纖維素陰離子交換柱(5×20.4cm;Whatman DE-52樹脂)上。加樣后，用2050ml Tris-HCl緩沖液洗柱，并應(yīng)用鹽梯度
，以167ml/小時的流速，每管收集15ml。層析結(jié)果如圖1所示。HPP-CFC集落數(shù)代表HPP-CEC試驗(yàn)中呈現(xiàn)的生物學(xué)活性;對各管分別取100μ作檢測分析。圖中沒有顯示加樣和洗柱期間收集的洗脫部分，這些部分中未檢測出生物學(xué)活性。
受到濃縮、滲濾/緩沖液交換和陰離子交換層析的各批條件培養(yǎng)基的行為均相似。以牛血清白蛋白作標(biāo)準(zhǔn)品，用Bradford方法[Anal.Biochem.72，248-254(1976)]測得各批制劑的蛋白質(zhì)濃度范圍為30-50μg/ml。用于該制備過程之條件培養(yǎng)基的總體積約為336升。
2.ACA54凝膠過濾層析合并按上述方法對六批條件培養(yǎng)基作DEAE纖維素柱層析得到的有生物學(xué)活性部分(如圖1所示第87-114管)，并用Amicon攪拌槽和YM10超濾膜將其濃縮到終體積74ml。將該材料加到用50mM Tris-HCl、50mM NaCl(pH7.4)平衡過的ACA54(LKB)凝膠過濾柱上(圖2)。以70ml/小時的流速洗脫并以14ml為一管收集。由于抑制因子與活性部分一同被洗脫，故活性峰(HPP-CEC集落數(shù))出現(xiàn)分離現(xiàn)象;但根據(jù)先前的層析圖，活性成份是與主蛋白峰共洗脫的，因此可得到一份活性部分的集合物。
3.麥胚凝集素-瓊脂糖層析合并由ACA54凝膠過濾柱洗脫的第70-112管(500ml)。將其分成兩等份，每份均使用在20mM Tris-HCl、500mM NaCl(pH7.5)中平衡過的麥胚凝集素-瓊脂糖柱(5×24.5cm;樹脂得自E-Y Laboratories，San Mateo，CA;麥胚凝集素可識別某些碳水化合物結(jié)構(gòu))進(jìn)行層析。上樣后，用約2200ml柱緩沖液洗柱，然后加入350mM溶于柱緩沖液中的350mMN-乙酰-D-葡糖胺溶液，由圖3所示約第210管開始洗脫結(jié)合的材料。以122ml/小時的流速洗脫并以每管13.25ml收集之。圖3中顯示其中一份的層析情況。將檢測部分對磷酸鹽緩沖鹽水透析;取5μl經(jīng)過透析的材料作MC/9檢測(cpm值如圖3所示)，10μl作HPP-CFC檢測(集落數(shù)如圖3所示)。從中可以看出，活性材料被結(jié)合到柱上且可用N-乙酰-D-葡糖胺洗脫，而上樣和洗柱期間大部分污染材料已通過了層析柱。
4.S-Sepharose Fast Flow陽離子交換層析合并圖3所示得自麥胚凝集素-瓊脂糖層析的第211-225管和得自第二次層析的同等部分(375ml)，并對25mM甲酸鈉(pH4.2)透析。為使接觸低pH的時間減小到最大限度，透析過程要對5升緩沖液進(jìn)行8小時以上，且此期間換4次透析液。在此透析過程結(jié)束時，樣品體積為480ml，樣品的pH和導(dǎo)電率接近于透析緩沖液的pH和導(dǎo)電率。透析期間樣品中出現(xiàn)了沉淀的材料。離心(22，000g，30分鐘)除去沉淀物，并將上清液加到預(yù)先用甲酸鈉緩沖液平衡的S-Sepharose Fast Flow陽離子交換柱(3.3×10.25cm;樹脂購自pharmacia公司)上。流速465ml/小時;每管收集14.2ml。上樣后，用240ml柱緩沖液洗柱，并提供0-750mM NaCl梯度(NaCl溶于緩沖液中，總梯度體積為2，200ml)，由圖4所示約第45管開始洗脫結(jié)合的材料。圖4中給出了洗脫曲線。加入200μl0.97M Tris堿，將收集的部分調(diào)到pH7-7.4。圖4中的cpm數(shù)還是指示MC/9生物學(xué)檢測的結(jié)果;所指出的部分對磷酸鹽緩沖鹽水透析，并取20μl進(jìn)行分析。從圖4中可以看出，大部分生物活性材料通過了柱(未結(jié)合);而大部分污染材料則在鹽梯度中被洗脫(已結(jié)合)。
5.使用硅結(jié)合之碳?xì)浠衔飿渲膶游龊喜D4所示由S-Sepharose柱洗脫的第4-40管(540ml)。450ml集合物與等體積緩沖液B(100mM乙酸銨(pH6)∶異丙醇＝25∶75)混合并以540ml/小時的流速加于用緩沖液A(60mM乙酸銨(pH6)∶異丙醇＝62.5∶37.5)平衡過的C4柱(Vydac Proteins C4;2.4×2cm)上。上樣后，使流速降至154ml/小時，并用200ml緩沖液A洗柱。施加緩沖液A到緩沖液B的線性梯度(總體積140ml)并以每管9.1ml收集。將經(jīng)S-Sephrose層析得到的合并部分、C4柱起始樣品、過柱合并收集物、以及洗柱合并物均經(jīng)加入適當(dāng)體積的1mg/ml儲備液使之達(dá)到含40μg/ml牛血清白蛋白，然后對磷酸鹽緩沖鹽水透析，得到用于生物學(xué)檢測的制劑。同樣，將40μl等分的梯度洗脫物與360μl含16μg牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖鹽水混合，然后對磷酸鹽緩沖鹽水透析以備作生物學(xué)檢測。用MC/9檢測法檢測各部分的生物學(xué)活性(6.3μl等分的制備的梯度洗脫部分;cpm數(shù)示于圖5中)。檢測結(jié)果還表明，回收的活性中有大約75%在過柱和洗柱部分中，而25%則在梯度洗脫部分中(見圖5)。圖6中顯示了各部分等分樣品的SDS-PAGE[Laemmli，Nature，227，680-685(1970);堆積膠含4%(W/V)丙烯酰胺;分離膠含12.5%(W/V)丙烯酰胺〕。對于所述凝膠來說，等分樣品在加入凝膠上之前均于真空下干燥，然后用20μl樣品處理緩沖液(未還原，即沒有2-巰基乙醇)重新溶解并煮沸5分鐘。泳道A和B分別代表柱起始材料(890ml中取75μl)和過柱洗脫物(880ml中取75μl);圖中左側(cè)的數(shù)碼標(biāo)記代表分子量(Mr)為所示數(shù)據(jù)103倍之標(biāo)記物的遷移位置(還原的);其中標(biāo)記物是磷酸化酶b(Mr為97，000)、牛血清白蛋白(Mr為66，200)、卵白蛋白(Mr為42，700)、碳酸酐酶(Mr為31，000)、大豆胰蛋白酶抑制物(Mr為21，500)以及溶菌酶(Mr為14，400);泳道4-9代表梯度洗脫時收集的相應(yīng)部分(9.1ml中取60μl)。對凝膠進(jìn)行銀染色[Morrissey，Anal.Biochem.，117，307-310(1981)]。比較泳道A和B可以看出，大部分可染色的材料均通過了柱。正好位在Mr31，000分子量標(biāo)準(zhǔn)品之上和下方的第4-6管中的被染色材料與在梯度洗脫部分中測知的生物學(xué)活性相符，且代表了生物學(xué)活性材料。應(yīng)注意的是，該材料可在泳道4-6中看到，但在泳道A和/或B中則沒有看到，這是因?yàn)榍罢呱蠘恿空剂丝傮w積的較大部分(4-6泳道占0.66%，而泳道A和B僅占0.0084%)。合并由該柱上洗脫的第4-6管。
如上所述，約有75%被回收的活性物質(zhì)通過了圖5的C4柱?；旧习瓷鲜龇椒?，使用C4樹脂再次層析分離該材料，不同的是使用的柱子較大(1.4×7.8cm)，且流速較慢(50-60ml/小時)?；厥盏幕钚灾屑s50%在通過柱子的樣品中，且有50%在梯度洗脫物中，其在SDS-PAGE上的表現(xiàn)與圖6中的活性梯度洗脫部分相似。合并各活性部分(29ml)。
基本上按上述方法進(jìn)行分析性C4柱層析，并以兩種生物檢測法分析之。如圖7所指出的由該分析性層析柱上洗脫的各管，其MC/9和HPP-CFC生物活性是共洗脫的。SDS-PAGE分析(圖8)顯示，在顯示有兩種生物學(xué)活性的柱洗脫部分中存在分子量約31，000的蛋白質(zhì)。
已用C4柱層析法純化了見于S-Sepharose層析之第二個(相對小的)活性峰中的活性材料(如圖4所示之第62-72管，即鹽梯度早期洗脫的部分)。其在SDS-PAGE上與過S-Sepharose柱后又經(jīng)C4柱層析所得到的材料有相同的行為，并且有同樣的N末端氨基酸順序(見實(shí)施例2D)。
6.對純化的總結(jié)表2中給出了上面1-5中所述純化步驟的總結(jié)。
表2哺乳動物SCF純化法概述步驟體積(ml) 總蛋白(mg)5條件培養(yǎng)基 335，700 13，475DEAE纖維素12，900 2，164ACA-54 550 1，513麥胚凝集素-瓊脂糖2375 413S-Sepharose 540410C4樹脂357.3 0.25-0.4061.所給出的值代表文中所述不同批量之值的總和。
2.如該實(shí)施例中所述，經(jīng)離心法除去S-Sepharose層析制備中透析該樣品時出現(xiàn)的沉淀材料。離心后(480ml)樣品含264mg總蛋白。
3.合并按上述順序作兩次C4柱層析后得到的活性梯度洗脫部分。
4.下一步驟只使用450ml這種材料(該實(shí)施例見上述)。
5.除另外指出之外，均用Bradford方法(supra，1976)測定。
6.估計(jì)值，基于SDS-PAGE后銀染色的強(qiáng)度，以及實(shí)施例2的K部分中所述的氨基酸組成分析。
D.SDS-PAGE和糖苷酶處理圖9中顯示了對兩次大量C4柱層析后得到的集合之梯度洗脫物所作SDS-PAGE分析的結(jié)果。
取第一次C4柱洗脫集合物中的60μl上樣(泳道1)，并取第二次C4柱洗脫集合物中的40μl上樣(泳道2)。這些凝膠均進(jìn)行銀染色。分子量標(biāo)志物同圖6所示。如上所述，在Mr 31，000標(biāo)志物位置上下分散遷移的材料代表了生物學(xué)活性材料;表現(xiàn)異質(zhì)性在很大程度上是由于糖基化作用的異質(zhì)性。
為了證明糖基化作用的特征，用125I標(biāo)記純化的材料，用各種糖苷酶處理，并以放射自顯影術(shù)經(jīng)SDS-PAGE法(還原條件)分析之。結(jié)果示于圖9中。泳道3和9為未經(jīng)糖苷酶處理之125I標(biāo)記的材料。泳道4-8代表用糖苷酶處理之125I標(biāo)記的材料(見下述)。泳道4，神經(jīng)氨酸苷酶;泳道5，神經(jīng)氨酸苷酶和O-聚糖酶;泳道6，N-聚糖酶;泳道7，神經(jīng)氨酸苷酶和N-聚糖酶;泳道8，神經(jīng)氨酸苷酶、O-聚糖酶和N-聚糖酶。條件是在5mM3-[(3-膽酰胺丙基)二甲基銨]-1-丙磺酸酯(CHAPS)、33mMα-巰基乙醇、10mM Tris-HCl(pH7-7.2)中，37℃下3小時。所用神經(jīng)氨酸苷酶(來源于Arthrobacter Ureafaciens;Calbiochem)終濃度為0.23單位/ml。O-聚糖酶(Genzyme;內(nèi)-α-N-乙?；?氨基半乳糖苷酶)為45毫單位/ml。N-聚糖酶(Genzyme;肽N-糖苷酶F;肽-N4[N-乙?；?β-葡糖胺基]天冬酰胺酰胺酶)為10單位/ml。
用糖苷酶處理未標(biāo)記的純化SCF，并在SDS-PAGE后經(jīng)銀染色對產(chǎn)物作觀察，可得到與圖9所示者相似的結(jié)果。
必要時可作各種對照保溫。這些包括在適當(dāng)?shù)珱]有糖苷酶的緩沖液中保溫，以證明結(jié)果是否因加入糖苷酶制劑所致;加已知為糖苷酶底物的糖基化蛋白質(zhì)(如糖基化重組人促紅細(xì)胞生成素)保溫，以證明所用糖苷酶是否有活性;以及加糖苷酶但不加底物保溫，以證明糖苷酶本身并未產(chǎn)生可見的凝膠帶或使該譜帶模糊不清。
也可用內(nèi)-β-N-乙酰葡糖酰胺酶F(endo F;NEN Dupont)及用內(nèi)-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶H(endo H;NEN Bupont)，再加適當(dāng)?shù)膶φ毡赝瓿商擒彰柑幚?。?nèi)endo F處理的條件是在1%(W/V)SDS、100mM2-巰基乙醇、100mM EDTA、320mM磷酸鈉(pH6)存在下煮沸3分鐘，然后用Nonidet P-40(終濃度1.17%，V/V)、磷酸鈉(終濃度200mM)和endo F(終濃度7單位/ml)的混合液作3倍稀釋。endo H處理的條件與之相似，不同的是所用SDS濃度為0.5%(W/V)，endo H濃度為1μg/ml。用endo F處理的結(jié)果與用N聚糖酶處理結(jié)果相同，而endo H對純化的SCF無影響。
由上述糖苷酶處理實(shí)驗(yàn)可以得出多個結(jié)論。用N-聚糖酶[其可除去復(fù)合物及高甘露糖N-連接的碳水化合物(Tarentino et al.，Biochemistry，24，4665-4671)(1985)]、endo F[其作用與N-聚糖酶相似(Elder and Alexander，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79，4540-4544)(1982)]、endo H(其可除去高甘露糖和某些雜合型N-連接的碳水化合物〕[Tarentino et al.，Methods Enzymol.，50C，574-580(1978)]、神經(jīng)氨酸苷酸(其可除去唾液酸殘基)及O-聚糖酶〔其可除去某些O-連接的碳水化合物(Lambin et al.，Biochem.Soc.Tran.，12，599-600，(1984)]所作的各種處理提示存在N連接的和O連接的碳水化合物、大多數(shù)N連接的碳水化合物是復(fù)合物形式的，而且存在唾液酸，至少有些唾液酸是O連接部分的一部分。可從氨基酸順序資料中得到關(guān)于N結(jié)合鍵之可能位點(diǎn)的某些信息(實(shí)施例2)。用N-聚糖酶、endo F和N-聚糖酶/神經(jīng)氨酸苷酶處理可將SDS-PAGE顯現(xiàn)的異源材料轉(zhuǎn)化為更為同源之快速遷移形式，這一事實(shí)與所有材料均代表同一種多肽、且異質(zhì)性系因糖基化作用的異質(zhì)性所致的這一結(jié)論相符合。還值得提到的是，相對于SDS-PAGE中所用分子量標(biāo)志物來說，聯(lián)合用各種糖苷酶處理所得到的最小形式的分子量范圍為18，000-20，000。
證實(shí)在SDS-PAGE上分子量31，000位置附近分散遷移的材料均代表了具有相同堿性多肽鏈的生物學(xué)活性材料，是根據(jù)得自在該區(qū)域內(nèi)遷移之材料(如電泳轉(zhuǎn)移并用溴化氰處理之后;實(shí)施例2)的氨基酸順序資料與已證明用重組DNA方法表達(dá)分離的基因所產(chǎn)生的生物活性材料的氨基酸順序(實(shí)施例4)相匹配之一事實(shí)而得出的。
實(shí)施例2哺乳動物SCF的氨基酸順序分析A.對純化蛋白質(zhì)的反相高效液相層析(HPLC)使用C4小孔徑柱(Vydac，孔徑300A，2mm×15cm)對實(shí)施例1中純化的約5μg SCF(濃度＝0.117mg/ml)進(jìn)行反相HPLC分析。在70分鐘內(nèi)用從97%流動相A(0.1%三氟乙酸)/3%流動相B(90%乙腈溶于0.1%三氟乙酸中)到30%流動相A/70%流動相B的線性梯度洗脫蛋白質(zhì)，然后以每分鐘0.2ml的流速再進(jìn)行10分鐘等臨界洗脫(cratic elution)。減去緩沖液空白層析分析值后，SCF表現(xiàn)為滯留時間70.05分鐘的單一對稱峰(見圖10)。在這些條件下沒有檢測到大的污染蛋白峰。
B.電泳轉(zhuǎn)移蛋白帶的順序測定按下述方法用N-聚糖酶(一種特異性裂解共價結(jié)合到蛋白質(zhì)上的Asn連接的碳水化合物部分的酶)處理實(shí)施例1中純化的SCF(0.5-1.0nmol)(見實(shí)施例1D)。于真空下干燥6ml由圖5所示C4柱洗脫之第4-6管得到的材料。然后加入150μl的14.25mM CHAPS、100mM2-巰基乙醇、335mM磷酸鈉(pH8.6)，并于37℃下保溫95分鐘。再加入300μl的74mM磷酸鈉、15單位/ml N-聚糖酶(pH8.6)，繼續(xù)保溫19小時。然后使樣品通過9-18%SDS-聚丙烯酰胺梯度凝膠(厚0.7mm;20×20cm)。使用10mM Caps緩沖液(pH10.5)以0.5安培的恒定電流電泳1小時[Matsudaira，J.Biol.Chem.，261，10035-10038(1987)]將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚二氟乙烯(PVDF，Millipore Corp.)上。經(jīng)考馬斯蘭染色后即可看到被轉(zhuǎn)移的蛋白帶。這些帶存在于分子量約29，000-33，000及約26，000處，即只產(chǎn)生了部分地去糖基化作用(參見實(shí)施例1D，圖9);前面一條帶代表未被消化的材料，后面一條帶代表已除去了N連接之碳水化合物的材料。切下這些帶并直接加于(40%為Mr29，000至33，000蛋白質(zhì);80%為Mr26，000蛋白質(zhì))蛋白質(zhì)順序測定儀上(Applied Biosystems Inc.，477型)。按照廠商推薦的程序進(jìn)行蛋白質(zhì)順序分析(Hewick et al.，J.Biol.Chem.，256，7990-7997(1981)]，并使用微孔徑C18反相HPLC連續(xù)分析所釋放的乙內(nèi)酰苯硫脲基氨基酸。兩條帶對20-28次順序測定循環(huán)沒有呈現(xiàn)信號，揭示兩者使用Edman化學(xué)降解法均不能作順序測定。每次順序測定的本底水平都在1-7pmol之間，此遠(yuǎn)低于存在于帶中的蛋白量。這些數(shù)據(jù)表明存在于帶中的蛋白質(zhì)是N末端被封閉的。
C.電泳轉(zhuǎn)移之蛋白質(zhì)的原位CNBr裂解和順序測定為了進(jìn)一步證實(shí)蛋白質(zhì)確實(shí)是被封閉的，由順序測定儀(B部分)上去掉膜并對印跡轉(zhuǎn)移的蛋白質(zhì)進(jìn)行原位溴化氰(CNBr)裂解[CNBr(5%，W/V)在70%甲酸中，45℃處理1小時]，然后干燥并作順序分析。測出了強(qiáng)順序信號，其代表經(jīng)CNBr裂解甲硫氨酰肽鍵所得到的內(nèi)肽。
在前5次操作過程中，兩條帶產(chǎn)生下列完全相同的混合順序信號。
已鑒定的氨基酸Cycle 1Asp;Glu;Val;Ile;LeuCycle 2Asp;Thr;Glu;Ala;Pro;ValCycle 3Asn;Ser;His;Pro;LeuCycle 4Asp;Asn;Ala;Pro;LeuCycle 5Ser;Tyr;Pro直到第20次操作周期時，兩條帶仍產(chǎn)生相似的信號。Mr26，000帶的初始產(chǎn)率為40-115pmol，Mr 29，000-33，000帶為40-150pmol。這些值與原來加到順序分析儀上的蛋白質(zhì)摩爾量差不多。結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)相當(dāng)SCF的蛋白帶含有被封閉的N末端。用于獲得N末端被封閉蛋白質(zhì)之順序信息的方法包括(a)使N末端去封閉(見D部分);(b)用CNBr(見E部分)、胰蛋白酶(見F部分)和金黃色葡萄球菌(V-8菌株)蛋白酶(Glu-c)(見G部分)進(jìn)行內(nèi)部裂解產(chǎn)生肽?？稍谌コ环忾]的N末端氨基酸或分離肽片段之后進(jìn)行順序分析。有關(guān)實(shí)施例詳述如下。
D.用焦谷氨酸氨基肽酶處理之BRL干細(xì)胞因子的順序分析存在于SCF氨基末端的封閉部分的化學(xué)性質(zhì)是難以預(yù)測的。封閉可發(fā)生在體內(nèi)轉(zhuǎn)譯之后[F.Wold，Ann.Rev.Biochem.，50，783-814(1981)]或體外純化過程中。有兩種轉(zhuǎn)譯后修飾作用是最為常見的。在N-α-乙酰轉(zhuǎn)移酶催化下，可發(fā)生某些N末端氨基酸如Ala、Ser等的乙酰化作用。此可通過分離和質(zhì)譜分析N末端封閉肽得以證實(shí)。如果蛋白質(zhì)的氨基末端是谷氨酰胺，則可能發(fā)生其r-酰胺的脫氨基作用?？墒褂媒构劝彼岚被拿笝z測焦谷氨酸。該酶可除去焦谷氨酸殘基，留下從第二個氨基酸開始的游離氨基末端。然后用Edman化學(xué)降解法進(jìn)行順序測定。
SCF(按實(shí)施例1所述純化的;400pmol)在50mM磷酸鈉緩沖液(pH7.6，含有二硫蘇糖醇和EDTA)中與1.5單位小牛肝焦谷氨酸氨基肽酶(pE-AP)37℃下保溫16小時。反應(yīng)后將混合物直接加到蛋白質(zhì)順序分析儀上。經(jīng)46次循環(huán)即可鑒定出主要順序。初產(chǎn)率約為40%，重復(fù)得率為94.2%。含N末端焦谷氨酸之SCFN末端順序是pE-AP裂解位點(diǎn)
xxx，在第43位上沒有給出具體的氨基酸這些結(jié)果表明SCF含有作為其N末端的焦谷氨酸。
E.CNBr肽的分離和順序分析按實(shí)施例1所述用N聚糖酶處理實(shí)施例1中純化的SCF(20-28μg;1.0-1.5nmol)。在該過程中完成向Mr26，000材料的轉(zhuǎn)化。干燥樣品并在70%甲酸(5%)中室溫下用CNBr處理18小時。用水稀釋消化產(chǎn)物、干燥并重新溶解在0.1%三氟乙酸中。使用C4小孔徑柱經(jīng)反相HPLC法分離CNBr肽，洗脫條件同本實(shí)施例A部分所述。收集幾個主要肽部分并作順序分析。結(jié)果示于下表中肽滯留時間(分) 順序4
CB-4 15.5L-P-P---CB-6122.1 a.I-T-L-N-Y-V-A-G-(M)b.V-A-S-D-T-S-D-C-V-L-S==-L-G-P-E-K-D-S-R-V-S-V-(_)-K----
CB-8 28.0 D-V-L-P-S-H-C-W-L-R-D-(M)
CB-10 30.1 (含有CB-8的順序)CB-15243.0 E-E-N-A-P-K-N-V-K-E-S-L-K-K-P-T-R-(N)-F-T-P-E-E-F-F-S-I-F-D3-R-S-I-D-A------CB-14 37.3和CB-16 兩個肽都含有CB－15的相同順序
1.12、13和25位上的氨基末測出。肽b沒有分析到末端。
2.CB-15中的(N)未測出;它是根據(jù)可能的N連接之糖基化位點(diǎn)推斷的。該肽順序沒有測完。
3.基于N-聚糖酶除去N連接的糖而認(rèn)定Asn的位點(diǎn)可能已被轉(zhuǎn)化為Asp。
4.所用單字母氨基酸代碼分別是A，Ala;C，Cys;D，Asp;E，Glu;F，Phe;G，Gly;H，His;I，Ile;K，Lys;L，Leu;M，Met;N，Asn;P，Pro;Q，Gln;R，Arg;S，Ser;T，Thr;V，Val;W，Trp;Y，Tyr。
F.BRL干細(xì)胞因子之胰蛋白酶消化片段的分離和順序測定用1μg胰蛋白酶對實(shí)施例1中純化的SCF(20μg，在150μ10.1M碳酸氫銨中)37℃下消化3.5小時。將消化產(chǎn)物直接加在小孔徑C4柱中進(jìn)行反相HPLC分離，所用洗脫條件同本實(shí)施例A部分所述。所有被洗脫肽的峰值滯留時間均不同于未消化的SCF(A部分)。被分離肽的順序分析結(jié)果如下所示肽 滯留時間(分) 順序
T-17.1 E-S-L-K-K-P-E-T-RT-2128.1 V-S-V-(_)-KT-332.4I-V-D-D-L-V-A-A-M-～E-E-N-A-P-KT-4240.0 N-F-T-P-E-E-F-F-S-I-F-(_)-RT-5346.4 a.L-V-A-N-L-P-N-D-Y-M-I-T-L-N-Y-V-A-G-
M-D-V-L-P-S-H-C-W-L-Rb.S-I-D-A-F-K-D-F-M-V-A-S-D-T-S-D-C-V-L-s-(_)-(_)-L-G----T-7472.8 E-S-L-K-K-P-E-T-R-(N)-F-T-P-E-E-F-F-S-I-F-(_)-RT-873.6 E-S-L-K-K-P-E-T-R-N-F-T-P-E-E-F-F-S-I-F-D-R1.4位的氨基酸未確定。
2.12位的氨基酸未確定。
3.肽T-5的b中，20和21位氨基酸未確定;
假定它們是O連接的糖的連接位點(diǎn)。
4.10位的氨基酸未測出;根據(jù)可能的N連接的糖基化位點(diǎn)推測其為Asn。21位的氨基酸未測出。
G.金黃色葡萄球菌Glu-C蛋白酶裂解后BRL干細(xì)胞因子肽的分離和順序測定以酶對底物1∶20的比例，37℃下用Glu-C蛋白酶將實(shí)施例1中純化的SCF(20μg，在150μ10.1M碳酸氫銨中)消化18小時。立即用反相小孔徑C4柱HPLC分離消化產(chǎn)物。收集5個主要肽部分并作順序測定(下示)
肽 帶留時間 順序
S-1 5.1 N-A-P-K-N-V-K-ES-2127.7 S-R-V-S-V-(_)-K-P-F-M-L-P-P-V-A-(A)S-3246.3 順序未測知
S-5371.0 S-L-K-K-P-E-T-R-N-F-T-P-E-E-F-F-S-I-F-(N)-R-S-I-D-A-F-K-D-F-M-V-A-S-D
S-6372.6 S-L-K-K-P-E-T-R-N-F-T-P-E-E-F-F-S-I-F-(N)-R-S-I-D-A-F-K-D-F-M-V-A-S-D-T-S-D1.S-2肽的6位氨基酸未給出;其可能是O連接的糖的連接位點(diǎn)。只以低得率測到S-2肽之16位上的Ala。
2.肽S-3可能是衍生于SCF之N末端的N末端封閉肽。
3.括號內(nèi)的N可能是N連接的糖的連接位點(diǎn)。
H.BNPS-糞臭素裂解后BRL干細(xì)胞因子的順序分析經(jīng)真空離心使溶于10mM碳酸氫銨中的SCF(2μg)徹底干燥，然后重新溶解于100μl冰醋酸中。向溶液內(nèi)加入10-20倍摩爾過量的BNPS-糞臭素，并將混合物于50℃下保溫60分鐘。然后經(jīng)真空離心干燥反應(yīng)混合物。先用100μl水，繼之用50μl水提取干燥的殘留物。然后按上述方法對合并的提取物作順序分析。測得的順序如下
10Leu-Arg-Asp-Met-Val-Thr-His-Leu-Ser-Val-Ser-Leu-Thr-Thr-Leu-20Leu-Asp-Lys-Phe-Ser-Asn-Ile-Ser-Glu-Gly-Leu-Ser-(Asn)-Tyr-30 40Ser-Ile-Ile-Asp-Lys-Leu-Gly-Lys-Ile-Val-Asp----28位氨基酸未被明確測出，基于可能的N連接的糖基化位點(diǎn)而將其定為Asn。
I.BRL干細(xì)胞因子的C末端氨基酸測定將等份的SCF蛋白(500pmol)的緩沖液交換成10mM乙酸鈉(pH4.0)(終體積90μl)，并加入Brij-35至0.05%(W/V)。取5μl等分樣品作蛋白定量。用上述緩沖液將40μl樣品稀釋到100μl。以酶對底物1∶200的比例加入羧基肽酶P(來源于penicillium janthinellum)。于25℃下進(jìn)行消化并于0、15、30、60和120分鐘時各取20ml等分樣品。在不同的時間點(diǎn)加入三氟乙酸到終濃度為5%，以終止消化。干燥樣品并于70℃下與溶于0.2M NaHCO3(pH9.0)中的Dabsyl氯化物(二甲基氨基偶氮苯磺?；?反應(yīng)12分鐘，以衍生釋放的氨基酸[Chang et al.，Methods Enzymol.，90，41-48(1983)]。用Chang等人改進(jìn)的小孔徑反相HPHL法[Techniques in Protein chemistry，T.Hugli ed.，Acad.Press，NY(1989)，pp.305-311]分析衍生的氨基酸。與衍生的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品(1pmol)比較后得到各時間點(diǎn)氨基酸組成的定量結(jié)果。在O時間可測到污染的甘氨酸。丙氨酸是唯一隨保溫時間延長而增加的氨基酸。保溫2小時后，測得Ala總量為25pmol，相當(dāng)于每摩爾蛋白質(zhì)釋放0.66mol Ala。這一結(jié)果表明天然哺乳動物SCF分子含有作為其羧基末端的Ala，此與對含C末端Ala之C末端肽S-2的順序分析結(jié)果相符。這一結(jié)論也與已知的羧基肽酶P的特異性相一致[lu et al.，J.Chromatog.，447，351-364(1988)]。例如，如果遇有Pro-Val時，裂解即停止。肽S-2具有順序S-R-V-S-V-(T)-K-P-F-M-L-P-P-V-A-(A)，并推測其為SCF的C末端肽(參見本實(shí)施例的J部分)。該C末端順序-P-V-A-(A)限制了蛋白酶只裂解丙氨酸。肽S-2的氨基酸組成表明存在1個Thr、2個Ser、3個Pro、2個Ala、3個Val、1個Met、1個Leu、1個Phe、1個Lys和1個Arg，總共16個殘基。測得2個Ala殘基表明該肽的C末端可能有兩個Ala殘基(見G部分的表)。因此BRL SCF終止在Ala164或Ala165。
J.SCF的順序結(jié)合對(1)除去N末端焦谷氨酸后的完整干細(xì)胞因子，(2)CNBr肽，(3)胰蛋白酶肽，以及(4)Glu-C肽酶片段所作順序分析的結(jié)果，推斷出N末端順序和C末端順序(圖11)。N末端順序開始于焦谷氨酸并終止在Met-48處。C末端順序含有84/85個氨基酸(82位至164/165位)。在各分離的肽中均未測出49位至81位的順序。但在按本實(shí)施例H部分所述方法以BNPS一類臭素裂解BRL SCF后測出了一個大肽的順序。由這些附加數(shù)據(jù)以及從大鼠SCF測得的DNA順序(實(shí)施例3)，可將N和C末端順序一一對準(zhǔn)地列出，并可列出整個順序(如圖11所示)。分別經(jīng)焦谷氨酸氨基肽酶消化和羧基肽酶P消化進(jìn)一步證實(shí)分子的N末端是焦谷氨酸，且C末端是丙氨酸。
根據(jù)這些順序資料，可知Asn-72是糖基化了的;Asn-109和Asn-120在某些分子中可能是糖基化的，但在另一些分子則不是。在作順序分析時可測到Asn-65，因此其可能只是部分(而不是全部)糖基化的。根據(jù)DNA順序推測，在氨基酸順序分析期間可以測出Ser-142、Thr-143和Thr-155，因此其可能是O連接的碳水化合物的連接位點(diǎn)。圖11中指出了這些可能的碳水化合物連接位點(diǎn);實(shí)體字母指示N連接的碳水化合物，開放黑體字母指示O連接的碳水化合物。
K.BRL干細(xì)胞因子的氨基酸組成分析經(jīng)濃縮并將緩沖液換成50mM碳酸氫銨制備用于氨基酸組成分析的、得自圖7所示C4柱洗脫物的材料。
兩份70μl樣品分別在含有0.1%苯酚和0.05%2-巰基乙醇的6N HCl中110℃下真空水解24小時。干燥水解產(chǎn)物，重新溶解在檸檬酸鈉緩沖液中并使用離子交換層析(Beckman 6300型氨基酸分析儀)分析之。結(jié)果如表3所示。用164個氨基酸(據(jù)蛋白質(zhì)順序分析資料)計(jì)算氨基酸組成可比使用193個氨基酸(如根據(jù)PCR得到的DNA順序分析資料推測的，圖14C)更好地與預(yù)測值相符合。
表3哺乳動物SCF的定量氨基酸組成每摩爾蛋白質(zhì)中推測的每分子殘基數(shù)2氨基酸氨基酸組份的摩爾數(shù)1Run＃1 Run＃2 (A) (B)Asx 24.46 24.26 25 28Thr 10.37 10.43 11 12Ser 14.52 14.30 16 24Glx 11.44 11.37 10 10Pro 10.90 10.85 9 10Gly 5.81 6.20 4 5Ala 8.62 8.35 7/8 8Cys nd nd 4 5Val 14.03 13.96 15 15Met 4.05 3.99 6 7Ile 8.31 8.33 9 10Leu 17.02 16.97 16 19Tyr 2.86 2.84 3 7Phe 7.96 7.92 8 8His 2.11 2.11 2 3Lys 10.35 11.28 12 14Trp nd nd 1 1Arg 4.93 4.99 5 6
續(xù)表3每摩爾蛋白質(zhì)中推測的每分子殘基數(shù)2氨基酸氨基酸組份的摩爾數(shù)1Run＃1 Run＃2 (A) (B)Total 158 158 164/165 193計(jì)算的分子量 18，42431.基于蛋白質(zhì)順序分析測知的158個氨基酸(不包括Cys和Trp)。
2.根據(jù)蛋白質(zhì)順序資料(A)或DNA順序資料(B)計(jì)算的理論值。
3.基于1-164氨基酸順序。
在氨基酸組成分析中，包括已知量的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)品亦可定量樣品中的蛋白質(zhì);被分析樣品得出的數(shù)值為0.117mg/ml。
實(shí)施例3克隆大鼠和人SCF基因A.大鼠SCF cDNA片段的擴(kuò)增和順序分析確定了大鼠SCF蛋白質(zhì)片段的氨基酸順序，便有可能設(shè)計(jì)出對大鼠SCF特異的混合的系列寡核苷酸。用該寡核苷酸作為雜交探針篩選大鼠cDNA和基因組文庫;并作為引物使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法擴(kuò)增部分cDNA [Mullis et al.，Methods in Enzymol.，155，335-350(1987)]。用氨基磷酸酯法[Beaucage et al.，Tetrahedron Lett.，22，1859-1862(1981);McBride et al.，Te-trahedron Lett.，24，245-248(1983)]合成寡脫氧核苷酸;其順序示于圖12A中。其中A代表腺嘌呤;T代表胸腺嘧啶;C代表胞嘧啶;G代表鳥嘌呤;I代表次黃苷。圖中星號代表含限制性核酸內(nèi)切酶識別順序的寡核苷酸。順序是按5′→3′方向?qū)懗龅摹?br> 使用32P標(biāo)記的基于實(shí)施例2中得到之氨基酸順序合成的混合的寡核苷酸探針，219-21和219-22(圖12A)，篩選大鼠基因組文庫、大鼠肝cDNA文庫及兩個BRL cDNA文庫。在這些使用cDNA克隆的標(biāo)準(zhǔn)方法[Maniatis et al.，Molecular Cloning，Cold Spring Harbor，212-246(1982)]所作的實(shí)驗(yàn)中，沒有分離到SCF克隆。
分離SCF核酸順序的一個可替代的方法包括使用PCR技術(shù)。該方法學(xué)中，在有脫氧核苷三磷酸存在的熱循環(huán)控制裝置(cycler)中，通過多次由適當(dāng)DNA聚合酶(如Tag I DNA聚合酶)催化的重復(fù)過程，于體外選擇性地?cái)U(kuò)增兩個DNA引物所包括的DNA區(qū)域。PCR擴(kuò)增的特異性是以兩個側(cè)接在被擴(kuò)增的DNA片段上并與相反鏈雜交的寡核苷酸引物為基礎(chǔ)的。對復(fù)雜混合物中特定DNA區(qū)域有雙側(cè)特異性的PCR是使用兩個有對該區(qū)域特異之順序的引物完成的。有單側(cè)特異性的PCR則是利用了一個區(qū)域特異性引物和第二個能在靶位點(diǎn)上起引發(fā)作用的引物，其中所說的靶位點(diǎn)存在于特定混合物之許多或所有DNA分子上[Loh et al.，Science，243，217-220(1989)]。
成功地PCR擴(kuò)增反應(yīng)的DNA產(chǎn)物是DNA順序資料的來源[Gyllensten，Biotechniques，7，700-708(1989)]，并可用以制得比寡核苷酸探針具有更大長度和更高特異性的標(biāo)記的雜交探針。也可用適當(dāng)?shù)囊镯樞蛟O(shè)計(jì)PCR產(chǎn)物，將其克隆到質(zhì)粒載體中，用以表達(dá)被編碼的肽產(chǎn)物。
圖13A中概略說明了獲得大鼠SCF cDNA之DNA順序的基本方案。小箭頭指示PCR擴(kuò)增，大箭頭則指示DNA順序測定反應(yīng)。PCR90.6和96.2與DNA順序測定相結(jié)合，用以獲得大鼠SCF cDNA的部分核酸順序。用于這些PCR的引物是基于圖11中所示氨基酸順序的混合的寡核苷酸。使用由PCR90.6和96.2得到的順序資料，制成特有的順序引物(224-27和224-28，圖12A)并用于繼后的擴(kuò)增和順序測定反應(yīng)。使用單側(cè)特異性PCR在PCR90.3、96.6和625.1中得到含有cDNA之5′末端的DNA。在PCR90.4中得到另一個接近SCF蛋白之C末端的DNA順序。按本實(shí)施例C部分中所述的方法，由PCR產(chǎn)物630.1、630.2、84.1和84.2中得到大鼠SCF cDNA之其余編碼區(qū)的DNA順序。用以獲得大鼠SCF cDNA的技術(shù)如下所述。
按Okayama等人所述方法[Methods in Enzymol.，154，3-28(1987)]由BRL細(xì)胞制備RNA。按照J(rèn)acobson所述方法[Methods in Enzymol.，152，254-261(1987)]用Oligo(dT)纖維素柱分離poly A+RNA。
用1μg BRL poly A+RNA作模板，(dT)12-18作引物，按照Mo-MLV反轉(zhuǎn)錄酶提供者(Bethesda Research Labora-tories)推薦的方法合成第一條cDNA鏈。RNA鏈用0.14M NaOH于84℃下降解10分鐘，或在沸水浴中降解5分鐘。加入過量醋酸銨中和該溶液，先用苯酚/氯仿，再用氯仿/異戊醇提取cDNA，然后用乙醇沉淀之。為了使Oligo(dc)相關(guān)引物在PCR中有單側(cè)特異性，按照以前所述方法[Deng et al.，Methods in Enzy-mol.，100，96-103(1983)]，用得自小牛胸腺的末端轉(zhuǎn)移酶[Boeringer Mannheim]在第一條cDNA鏈的3′末端加上一個poly(dG)尾部。
除特別指出者外，各次PCR循環(huán)中的變性步驟均在94℃下進(jìn)行1分鐘;鏈延長反應(yīng)在72℃下進(jìn)行3或4分鐘。退火的溫度和時間對每次PCR來說均不相同，通常根據(jù)同時進(jìn)行的幾個不同PCR的大致條件而定。當(dāng)引物濃度降低致使引物制品的積聚量下降時[Watson，Amplifica-tions，2，56(1989)]，表明需要較長退火時間;當(dāng)PCR產(chǎn)物的濃度高時，則要使用較短的退火時間和較高的引物濃度以增加得率。決定退火溫度的主要因素是引物-靶聯(lián)系的Td估算值[Suggs et al.，"Developmental Biology Using Purified Genes"，eds.Brown，D.D.and Fox，C.F.(Academic，New York)PP.683-693(1981)]。用于擴(kuò)增的酶可購自下列任一個制造廠商Stratagene，Promega或Per-kin-Elmer Cetus。反應(yīng)化合物均按廠商推薦的方法使用。擴(kuò)增反應(yīng)可在Coy Tempcycle或Perkin Elmer Cetus DNA熱循環(huán)控制裝置中進(jìn)行。
通常是在溴乙錠存在下，通過瓊脂糖凝膠電泳對SCF cDNA片段的擴(kuò)增進(jìn)行分析，并經(jīng)用紫外光照射DNA譜帶，激發(fā)熒光后觀察之。在某些提前產(chǎn)生小片段的情況下，可用聚丙烯酰胺凝膠電泳法分析PCR產(chǎn)物?？稍谟靡粋€或多個內(nèi)部套裝引物(internally-nestedprimers)進(jìn)行下一次擴(kuò)增時觀察適當(dāng)?shù)腄NA帶，來進(jìn)一步確定所觀察到的代表SCF cDNA片段的帶。最后則要根據(jù)對PCR產(chǎn)物的二脫氧順序測定[Sanger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，74，5463-5467(1977)]結(jié)果，并將預(yù)略的翻譯產(chǎn)物與SCF肽順序資料相比較來證實(shí)之。
在最初的PCR實(shí)驗(yàn)中，使用了基于SCF蛋白質(zhì)順序[Gould，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86，1934-1938(1989)]合成的混合寡核苷酸。下面敘述用于得到大鼠cDNA編碼氨基酸-25到162之DNA順序資料的PCR擴(kuò)增方法。
在PCR90.6中，各用4pmol反應(yīng)體積為20μl的222-11和223-6擴(kuò)增BRL cDNA。取一等份PCR90.6產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上作電泳分離，并觀察有預(yù)期大小的帶。進(jìn)一步用各20pmol反應(yīng)體積為50μl的引物222-11和223-6擴(kuò)增1μlPCR90.6產(chǎn)物，反應(yīng)進(jìn)行15次，退火溫度為45℃。然后在引物222-11和219-25(PCR96.2)存在下使該產(chǎn)物的一部分?jǐn)U增25次，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后可見產(chǎn)生了一條主產(chǎn)物帶。用同樣兩個引物對PCR96.2的產(chǎn)物進(jìn)行不對稱擴(kuò)增可產(chǎn)生被成功地編定了順序的模板。在222-11和套裝引物219-21存在下，經(jīng)產(chǎn)物的PCR擴(kuò)增過程進(jìn)一步完成對96.2產(chǎn)物中SCF順序的選擇性擴(kuò)增。用該P(yáng)CR的產(chǎn)物作為模板進(jìn)行不對稱擴(kuò)增并制備放射標(biāo)記的探針(PCR2)。
為了分離大鼠SCF cDNA的5′端，利用含有(dC)n順序并互補(bǔ)于cDNA poly(dG)尾部的引物作為非特異性引物。用含有(dC)12(10pmol)和223-6(4pmol)的PCR90.3作引物并用BRL cDNA作為模板。該反應(yīng)產(chǎn)物很象一個有很高分子量的聚集體，在瓊脂糖凝膠電泳中保留在接近點(diǎn)樣孔的位置上。在體積為25μl的25pmol(dC)12和10pmol223-6存在下，對1μl產(chǎn)物溶液再進(jìn)行15次擴(kuò)增循環(huán)，退火溫度為45℃。然后用內(nèi)部套裝引物219-25和201-7(PCR96.6)對0.5μl該產(chǎn)物再進(jìn)行25次擴(kuò)增。201-7的順序示于圖12C中。瓊脂糖凝膠電泳未觀察到可見的帶。以40℃退火溫度再次進(jìn)行25次PCR后，可見到一條明顯的帶。進(jìn)行Southrern印跡分析后觀察到一條明顯的雜交帶。使用201-7和套裝引物224-27，以45℃退火溫度再次進(jìn)行20次PCR(625.1)。經(jīng)PCR不對稱擴(kuò)增后作順序測定，得到超出假定的前SCF信號肽編碼順序之推測氨基末端的順序。用該順序設(shè)計(jì)含有大鼠SCF cDNA編碼區(qū)之5′末端的寡核苷酸引物227-29。同樣，測定PCR90.4的順序可得到終止在氨基酸162處的3′DNA編碼順序(見圖13.A)。
B.克隆大鼠干細(xì)胞因子基因組DNA用按上面A部所述對編碼大鼠SCF的cDNA作PCR擴(kuò)增制得的探針篩選含有大鼠基因組順序的基因文庫(得自CLONTECH Laboratories，Inc.;catalog No.RL1022J)。使用得自成年雄性Spraque-Dawley大鼠的DNA在噬菌體λ載體EMBL-3 SP6/T7中構(gòu)建該庫。據(jù)提供者鑒定，該庫含2.3×106個平均插入段大小為16Kb的獨(dú)克隆。
用PCR法產(chǎn)生用于篩選該基因組文庫的32P標(biāo)記的探針。在含有16.7μM32P[α]-dATP、200μMdCTP、200μMdGTP、200μMdTTP、由Perkin Elmer Cetus提供的反應(yīng)緩沖液、0.05單位/ml的Taq聚合酶(Perkin Elmer Cetus)、0.5μM219-26、0.05μM223-6和1μl含有兩引物之靶位點(diǎn)模板90.1的反應(yīng)混合物中制備探針PCR1(圖13A)。除改變引物和模板外，使用相似反應(yīng)條件制備探針PCR2。該探針制備中使用了0.5μM222-11、0.05μM219-21和1μl得自PCR96.2的模板。
按照Maniatis等人[supra(1982)]所述方法接種約106個噬菌體。按廠商推薦的方法將噬斑轉(zhuǎn)移到已變性的Gene Screen PlusTM濾膜(22cm×22cm，NEN/Dupont)上，中和并干燥之。對每個平皿均作兩次濾膜轉(zhuǎn)移。
濾膜在1M NaCl、1%SDS、0.1%牛血清白蛋白、0.1%Ficoll、0.1%聚乙烯吡咯烷酮(雜交溶液)中65℃下預(yù)雜交約16小時并于-20℃下保存。將濾膜轉(zhuǎn)移到含有32P標(biāo)記的PCR1探針(1.2×105cpm/ml)的新鮮雜交溶液中，65℃下雜交14小時。室溫下在0.9M NaCl、0.09M檸檬酸鈉、0.1%SDS(pH7.2)(洗滌溶液)中將濾膜洗2小時，然后再于65℃下在新鮮洗滌溶液中洗30分鐘。由平皿上除去相當(dāng)于放射自顯影圖譜上放射活性點(diǎn)之平皿區(qū)域中的噬菌體克隆，并再次用探針PCR1和PCR2篩選之。
用限制性核酸內(nèi)切酶BamHI、SphI或SstI消化得自陽性克隆的DNA，將所得片段再克隆到pUC119中，然后作順序分析。圖14A中圖解顯示了對大鼠基因組SCF DNA進(jìn)行順序分析的戰(zhàn)略(方案)。該圖中，頂部的線代表編碼SCF的大鼠基因組DNA區(qū)域。線上的缺口指示已測定了順序的區(qū)域。大方框代表具有上面各方框指示的相應(yīng)被編碼氨基酸之SCF基因編碼區(qū)域的外顯子。箭頭代表已確定順序并用以組裝大鼠SCF基因之相符順序的個別區(qū)域。大鼠SCF基因的順序如圖14B中所示。
使用PCR1探針篩選大鼠基因組文庫，分離出相應(yīng)于編碼氨基酸19至176之外顯子的克隆。為了得到氨基酸19編碼區(qū)上游之外顯子的克隆，可使用寡核苷酸探針228-30篩選該基因庫。按前述方法用同一組濾膜與探針PCR1預(yù)雜交，并在含有32P標(biāo)記之寡核苷酸228-30(0.03pmole/ml)的雜交溶液中50℃下雜交16小時。室溫下在洗滌溶液中洗濾膜30分鐘，然后再在新鮮洗滌溶液中于45℃下洗15分鐘。由平皿上除去相當(dāng)于放射自顯影圖上放射活性點(diǎn)之區(qū)域內(nèi)的噬菌體克隆并用探針228-30重新篩選之。用限制性核酸內(nèi)切酶消化得自陽性克隆的DNA并再克隆之。使用探針228-30，得到相當(dāng)于編碼氨基酸-20至18之外顯子的克隆。
為分離相當(dāng)于含5′未轉(zhuǎn)譯區(qū)和氨基酸-25至-21編碼區(qū)之外顯子的克隆而作了幾種嘗試。結(jié)果沒有分離到大鼠SCF基因這個區(qū)域的克隆。
C.克隆適于在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的大鼠cDNA設(shè)計(jì)哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，以確定大鼠SCF的活性多肽產(chǎn)物是否能在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)并被分泌出來。所設(shè)計(jì)的系統(tǒng)用于表達(dá)大鼠SCF之剪短的轉(zhuǎn)譯產(chǎn)物(SCF1-162和SCF1-164)以及根據(jù)圖14C所示基因順序之翻譯推測的蛋白質(zhì)(SCF1-193)。
用于這些研究工作中的表達(dá)載體是含有pUC119、SV40和HTLVI順序的穿梭載體。設(shè)計(jì)這些載體，使之可以在大腸桿菌和哺乳動物細(xì)胞內(nèi)自身復(fù)制，并在病毒DNA順序的控制下表達(dá)被插入的外源DNA。該存在于大腸桿菌DH5中的定名為V19.8的載體已寄存在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(12301 Parklawn Drive，Rockville，Md.)(ATCC No.68124)。該載體是Souza的美國專利4，810，643號(已列為本文參考文獻(xiàn))中所述之pSVDM19的衍生物。
將大鼠SCF1-162cDNA插入到質(zhì)粒載體V19.8中。該cDNA順序如圖14C中所示。如圖13A所示，在PCR反應(yīng)630.1和630.2中合成用于該構(gòu)建過程的cDNA。這些PCR代表了獨(dú)立的擴(kuò)增并利用了合成的寡核苷酸引物227-29和227-30。這些引物的順序是按本實(shí)施例A部分所示由PCR產(chǎn)生的cDNA中獲得的。反應(yīng)混合物體積為50μl，其由1×反應(yīng)緩沖液(得自Perkin Elmer Cetus試劑盒)、250μm dATP、250μMdCTP、250μM dGTP和250μM dTTP、200ng oligo(dT)引導(dǎo)的cDNA、1pmol227-29、1pmol227-30以及2.5單位Taq聚合酶(Perkin Elmer Cetus)組成。經(jīng)在94℃下變性1分鐘、37℃下退火2分鐘及72℃下鏈延長反應(yīng)1分鐘，對該cDNA進(jìn)行10個周期的擴(kuò)增。在經(jīng)過這些最初的PCR擴(kuò)增周期后，向各反應(yīng)內(nèi)加入10pmol的227-29和10pmol的227-30。將退火溫度改為55℃，繼續(xù)按上述方法進(jìn)行30個周期的擴(kuò)增。用限制性核酸內(nèi)切酶HindⅢ和SstⅡ消化PCR的產(chǎn)物。同樣用HindⅢ和SstⅡ消化V19.8，且其中一種情況是用小牛腸堿性磷酸酶處理業(yè)經(jīng)消化的質(zhì)粒載體;而另一種情況下則由瓊脂糖凝膠中分離消化后產(chǎn)生的大片段。使用T4多核苷酸連接酶將該cDNA連接到V19.8上。按已述方法[Okayama et al.，supra(1987)]將此連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌DH5中。用Sanger的二脫氧方法測定由個別細(xì)菌克隆制備之DNA的順序。圖17顯示了V19.8SCF的構(gòu)建過程。按實(shí)施例4和5中所述用這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞。
用構(gòu)建上述表達(dá)SCF1-162之載體的相似的方法構(gòu)建用于表達(dá)大鼠SCF1-164的載體，其中包括使用PCR擴(kuò)增法合成cDNA，然后插入V19.8中。用含SCF1-162cDNA的V19.8(V19.8SCF1-162)作模板，227-29作基因之5′端的引物，237-19作基因之3′端的引物，以PCR擴(kuò)增法合成用于該構(gòu)建過程的cDNA。重復(fù)的反應(yīng)混合物(50μl)含有1×反應(yīng)緩沖液、250μM dATP、dCTP、dGTP和dTTP、2.5單位Taq聚合酶、20ng V19.8SCF1-162和各20pmol引物。經(jīng)于94℃下變性1分鐘、55℃下退火2分鐘和72℃下鏈延長2分鐘，對cDNA作35個周期的擴(kuò)增。用限制性核酸內(nèi)切酶HindⅢ和SstⅡ消化擴(kuò)增的產(chǎn)物并插入V19.8中。所得載體含有SCF氨基酸-25至164的編碼區(qū)，繼后是終止密碼子。
同時使用用于大鼠SCF1-162的相似方法，將193氨基酸形式的大鼠SCF(大鼠SCF1-193是根據(jù)圖14C所示DNA順序的翻譯產(chǎn)物推測的)的cDNA插入到質(zhì)粒載體V19.8中。用于該構(gòu)建過程的cDNA是利用寡核苷酸227-29和230-25在PCR反應(yīng)84.1和84.2(圖13A)中合成的。兩反應(yīng)代表了由不同的RNA制備物開始的獨(dú)立擴(kuò)增。通過本實(shí)施例A部分中所述的PCR反應(yīng)得到227-29的順序，并由大鼠基因組DNA(圖14B)得到引物230-25的順序。反應(yīng)混合物(50μl)由1×反應(yīng)緩沖液(得自Perkin Elmer Cetus試劑盒)、250μM dATP、250μM dCTP、250μM dGTP、和250μM dTTP、200ng Oligo(dT)引導(dǎo)的cDNA、10pmol227-29、10pmol 230-25及2.5單位Taq聚合酶(Perkin Elmer Cetus)組成。使用下列條件將該cDNA擴(kuò)增5個周期94℃下變性11/2分鐘，50℃下退火2分鐘，72℃下鏈延長2分鐘。經(jīng)過這些最初的擴(kuò)增周期后，再于60℃的退火溫度下，按上述條件繼續(xù)進(jìn)行35個周期的擴(kuò)增。用限制性核酸內(nèi)切酶HindⅢ和SstⅡ消化PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物。用HindⅢ和SstⅡ消化V19.8DNA并由瓊脂糖凝膠電泳帶中分離消化后的大片段。使用T4多核苷酸連接酶將該cDNA連接到V19.8上。將此連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)染到感受態(tài)大腸桿菌菌株DH5中并測定由個別克隆制備之DNA的順序。按實(shí)施例4中所述用這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞。
D.人SCF cDNA PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增和順序分析如圖13B所示，使用PCR擴(kuò)增法由肝癌細(xì)胞系Hep G2(ATCC HB8065)中得到人SCF cDNA。其基本方案是用有由大鼠SCF cDNA推知之順序的引物，經(jīng)PCR來擴(kuò)增人cDNA。
按Maniatis等人[supra(1982)]所述方法制備RNA，并按廠商推薦的方法使用Oligo dT纖維素制備Poly A+RNA(Collaborative Research Inc.)。
按上述制備BRL cDNA的方法制備第一股cDNA鏈，不同的是用2μM寡核苷酸228-28(見圖12C)引導(dǎo)合成，該引物在連接到較長特有順序的3′端處有一個短的隨機(jī)順序。該228-28的特有順序部分提供了一個用引物228-29作非特異性引物經(jīng)PCR進(jìn)行擴(kuò)增的靶位點(diǎn)。至少與大鼠SCF順序的一部分有關(guān)的人cDNA順序是使用引物227-29和228-29經(jīng)PCR由HepG2 cDNA擴(kuò)增的(PCR22.7，見圖13B;于60℃下，退火進(jìn)行15次擴(kuò)增，然后再于55℃下退火進(jìn)行15次擴(kuò)增)。瓊脂糖凝膠電泳沒有出現(xiàn)清楚的帶，只看到一個模糊不清的顯然是異源的DNA。進(jìn)一步使用內(nèi)部套裝的大鼠SCF引物222-11和引物228-29，與1μlPCR22.7產(chǎn)物進(jìn)行PCR(PCR24.3;于55℃退火條件下進(jìn)行20次擴(kuò)增)，以試圖優(yōu)先擴(kuò)增與大鼠SCF cDNA密切相關(guān)的順序。結(jié)果在瓊脂糖凝膠上只觀察到一個模糊的異源DNA產(chǎn)物。用引物222-11和227-30雙側(cè)特異性擴(kuò)增PCR24.3產(chǎn)物(PCR25.10;20次)，產(chǎn)生了一條與相應(yīng)的大鼠SCF cDNA PCR產(chǎn)物有同樣大小的主產(chǎn)物帶。使用224-24作為順序分析引物測定非對稱PCR產(chǎn)物(PCR33.1)的順序，測出了大約有70個堿基的人SCF順序。
相似地，首先用引物224-25和228-29(PCR 24.7.20次)，然后用引物224-25和227-30(PCR41.11)擴(kuò)增1μl PCR22.7產(chǎn)物，結(jié)果產(chǎn)生了一條與相應(yīng)的大鼠SCF產(chǎn)物有同樣大小的主帶，而且在非對稱擴(kuò)增(PCR42.3)之后產(chǎn)生了與大鼠SCF高度同源的順序(使用224-24作為順序分析引物)。合成有針對人SCF cDNA之獨(dú)特順序的寡脫氧核苷酸，其順序如圖12B中所示。
為了得到大鼠SCF PCR產(chǎn)生之編碼順序的人對應(yīng)物(用于表達(dá)和活性研究)，用引物227-29和227-30在50μl反應(yīng)混合物中對1μlPCR22.7產(chǎn)物進(jìn)行PCR(PCR39.1)。擴(kuò)增反應(yīng)在Coy Tempcycler中完成。因?yàn)閷θ薙CF cDNA和大鼠SCF特定引物227-30之間的錯配程度尚不明了，所以在前三個反應(yīng)周期里使用了低嚴(yán)格的退火條件(37℃);然后才在55℃下退火。結(jié)果顯現(xiàn)了一條與大鼠同系物有同樣大小的清晰的帶(約590bp)，然后進(jìn)一步稀釋小部分PCR39.1產(chǎn)物并與同一引物進(jìn)行PCR(PCR41.1)。因?yàn)樵赑CR41.1的產(chǎn)物中觀察到了一個以上的帶，故進(jìn)一步與內(nèi)部套裝的引物進(jìn)行PCR，以在克隆之前至少確定其一部分順序。經(jīng)用引物231-27和227-29進(jìn)行23次PCR循環(huán)(PCR51.2)后，出現(xiàn)一條很明顯的帶。用引物227-29和231-27進(jìn)行非對稱PCR并作順序分析，進(jìn)一步證實(shí)了人SCF cDNA順序的存在。按上文C部分所述克隆大鼠SCF1-162 PCR片段的方法，將PCR41.1SCF DNA克隆到表達(dá)載體V19.8中。用Sanger的二脫氧方法測定個別細(xì)胞克隆的DNA順序。
E.克隆人干細(xì)胞因子基因組DNA使用擴(kuò)增cDNA制得的PCR7探針(圖13B)篩選含人基因組順序的基因庫。使用互補(bǔ)于人SCF cDNA之一部分的核糖探針(riboprobe)(見下述)再次篩選陽性噬斑。用PCR41.1(圖13B)的產(chǎn)物起始制備PCR7探針。進(jìn)一步用引物227-29和227-30擴(kuò)增PCR41.1的產(chǎn)物。由瓊脂糖凝膠上洗脫所得的590bp片段并再次用同一引物(PCR58.1)擴(kuò)增之。在含有10pmol233-13的50μl反應(yīng)混合物中將PCR58.1的產(chǎn)物稀釋1，000倍并擴(kuò)增10次。向該反應(yīng)混合物中加入10pmole227-30后，繼續(xù)進(jìn)行20次PCR。再加入80pmole233-13，使反應(yīng)體積增加到90μl并繼續(xù)進(jìn)行15次PCR。以50μl反應(yīng)體積將反應(yīng)產(chǎn)物稀釋200倍，加入20pmole231-27和20pmole233-13，使用48℃的退火溫度以反應(yīng)96.1進(jìn)行35次PCR。使用相似于制備PCR1的反應(yīng)條件制備32P標(biāo)記的PCR7，其中不同的是以50μl的反應(yīng)體積將PCR96.1稀釋100倍;用5pmole的231-27作單一引物;以94℃下變性1分鐘、48℃下退火2分鐘及72℃下鏈延長2分鐘的反應(yīng)條件，進(jìn)行45次PCR。
核糖探針(核糖探針1)是一種32P標(biāo)記的互補(bǔ)于圖15B所示人SCF DNA之核苷酸2-436的單鏈RNA。為了構(gòu)建產(chǎn)生該探針的載體，用HindⅢ和EcoRI消化PCR41.1(圖13B)產(chǎn)物DNA并克隆到質(zhì)粒載體pGEM3(Promega，Madison，Wisconsin)的多聚接頭中。然后用HindⅢ消化將重組pGEM3∶hSCF質(zhì)粒DNA切成線形。按照Promega公司產(chǎn)品說明書所述使用方法用T7RNA聚合酶經(jīng)脫落(run-off)轉(zhuǎn)錄由線性化的質(zhì)粒DNA制備32P標(biāo)記的核糖探針1。反應(yīng)混合物(3μl)含有250ng線性化質(zhì)粒DNA和20μM32P-rCTP(catalog ＃NEG-008H，New England Nuc-lear(NEN)(沒有未標(biāo)記的CTP)。
從Stratagene公司(La Jolla，CA;catalog＃946203)得到人基因組庫。該文庫是使用由白種人男性胎盤制得的DNA在λ噬菌體FixⅡ載體中構(gòu)建的。由提供者鑒定的該文庫特征是含有2×106個平均插入段長度大于15Kb的初級噬斑。按Maniatis等人[supra(1982)]所述方法鋪敷大約106個噬菌體。按照廠商推薦的方法將斑轉(zhuǎn)移到Gene Screen PlusTM濾膜上。(22cm2;NEN/Dupont)。每個平皿作兩片濾膜轉(zhuǎn)移。
濾膜在6×SSC(0.9M NaCl、0.09M檸檬酸鈉，pH7.5)、1%SDS中，于60℃下預(yù)雜交，并于62℃下在6×SSC、含有32P標(biāo)記之PCR7探針(2×105cpm/ml)的1%SDS溶液中雜交20小時。濾膜于62℃下在6×SSC、1%SDS中洗16小時。從相當(dāng)于放射自顯影圖上放射活性點(diǎn)的平皿區(qū)域內(nèi)除去噬菌體積結(jié)物并用探針PCR7和核糖探針1再次篩選。用PCR7探針再次篩選的條件基本上同上所述。用核糖探針1再次篩選的方法是濾膜在6×SSC、1%SDS中預(yù)雜交，并于62℃下在0.25M Na3PO4(pH7.5)、0.25M NaCl、0.001M EDTA、15%甲酰胺、7%SDS和1×106cpm/ml的核糖探針中雜交18小時。濾膜于62℃下在6×SSC、1%SDS中洗30分鐘，再在1×SSC、1%SDS中(62℃)洗30分鐘。用限制性核酸內(nèi)切酶BamHI、SphI或SstI消化陽性克隆的DNA，并將所得片段再克隆到PUC119中，之后進(jìn)行順序測定。
使用探針PCR7，得到一個包含編碼氨基酸40至176之外顯子的克隆，該克隆已保藏在ATCC(保藏號40681)。為得到其他SCF外顯子的克隆，用核糖探針2和寡核苷酸探針235-29篩選人基因組文庫，篩選方法大致同前，但其中不同的是于37℃下與探針235-29雜交并于37℃下將該雜交濾膜洗1小時，再于44℃下洗1小時。用核糖探針2、核糖探針3和寡核苷酸探針235-29與236-31重新篩選陽性克隆。使用產(chǎn)生核糖探針1的相似方法制得核糖探針2和3，其中不同的是(a)用限制性核酸內(nèi)切酶PvuⅡ(核糖探針2)或PstⅠ(核糖探針3)將重組pGEM3hSCF質(zhì)粒DNA切成線形，以及(b)使用SP6RNA聚合酶(Promega)合成核糖探針3。
圖15A顯示用于確定人基因組DNA順序的戰(zhàn)略。該圖中，頂部的線代表人基因組DNA編碼SCF的區(qū)域。線上的缺口指示已測定了順序的區(qū)域。大方框代表SCF基因編碼區(qū)的外顯子，并在每個方框上方標(biāo)出了相應(yīng)的被編碼的氨基酸。該人SCF基因的順序如圖15B所示。圖15C中顯示了用PCR技術(shù)得到之人SCF cDNA的順序。
F.人SCF cDNA 5′區(qū)的順序?qū)τ蓛蓚€基因特異性引物引導(dǎo)PCR得到的產(chǎn)物作順序分析，揭示了兩個引物之3′末端結(jié)合區(qū)域的順序。如實(shí)施例3A所述，一側(cè)PCR可產(chǎn)生側(cè)翼區(qū)域的順序。一側(cè)PCR被用于擴(kuò)展人SCF cDNA之5′未翻譯區(qū)的順序。
按實(shí)施例3D所述，用寡核苷酸228-28(圖12C)作探針，由得自人膀胱癌細(xì)胞系5637(ATCC HTB9)的poly A+RNA制備第一條cDNA鏈。用dG殘基為該cDNA接尾，然后使用含(dC)n順序的引物連同SCF特異性引物進(jìn)行一側(cè)PCR擴(kuò)增，結(jié)果沒有產(chǎn)生延伸已知順序之(5′)上游區(qū)的cDNA片段。
對寡核苷酸228-28引導(dǎo)合成第二條鏈的產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可得到小量順序信息。上述未接尾的5637第一股cDNA鏈(50ng)和2pmole228-28與Klenow聚合酶及各0.5mM dATP、dCTP、dGTP和dTTP在10μl1×缺口翻譯緩沖液[Maniatis et al.，Molecular Cloning，a Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory(1982)]中10-12℃保溫30分鐘。用引物228-29連同套裝SCF引物(依次使用235-30、233-14、236-31和235-29)經(jīng)連續(xù)一側(cè)PCR擴(kuò)增所得的cDNA，產(chǎn)生了在瓊脂糖凝膠上顯現(xiàn)模糊的復(fù)雜產(chǎn)物混合物。當(dāng)用兩個SCF引物(227-29和235-29，例如產(chǎn)物一大約150bp的產(chǎn)物)擴(kuò)增差不多體積的連續(xù)一側(cè)PCR產(chǎn)物時，可觀察到有漸漸增加密度的特異性產(chǎn)物帶，表明大量富集了SCF相關(guān)的cDNA片段。試圖通過去掉瓊脂糖凝膠上模糊不清的部分，并經(jīng)PCR再次擴(kuò)增以選擇有特定大小范圍的產(chǎn)物，結(jié)果在多數(shù)情況下都沒有產(chǎn)生含有SCF相關(guān)順序的確切的帶。
一個只含有235-29引物的反應(yīng)(PCR16.17)，正如用限制性酶PvuⅡ和PstⅠ作酶切分析和用套裝引物進(jìn)行PCR分析所顯示的，結(jié)果產(chǎn)生了顯然是在除預(yù)期位點(diǎn)之外的一個編碼區(qū)5′端的未知位點(diǎn)上由235-29引導(dǎo)產(chǎn)生的帶。用凝膠電泳法純化該產(chǎn)物并用引物235-29再次擴(kuò)增，同時嘗試使用32P標(biāo)記的引物228-30，以Sanger氏雙脫氧法測定其順序。所得順序即為設(shè)計(jì)寡核苷酸254-9(圖12B)的基礎(chǔ)。當(dāng)將該3′定向引物與5′定向SCF引物合用于繼后的PCR時，則得到有預(yù)期大小的帶。對這些PCR產(chǎn)物進(jìn)行直接Sanger法順序分析，得到了圖15C所示人SCF cDNA順序的核苷酸180至204。
為了得到更多的hSCF cDNA5′端順序，使用SCF特異性引物(2pmol的233-14)，在16μl含0.2單位MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶(購自BRL)和各500μM dNTP的反應(yīng)混合物中由5637polyA+RNA(約300ng)制備第一股cDNA鏈。經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)的苯酚-氯仿和氯仿提取及乙醇沉淀(從1M乙酸銨中)步驟后，將核酸懸浮在20μl水中，在沸水浴中5分鐘，然后冷卻并在8μMdATP存在下于含CoCl2緩沖液中用末端轉(zhuǎn)移酶接尾[Deng and Wu，Methods in Enzymology，100，pp96-103]。經(jīng)苯酚-氯仿提取和乙醇沉淀以純化所得產(chǎn)物(dA)n接尾的第一股cDNA鏈，并懸浮在20μl10mM Tris(pH8.0)和1mM EDTA中。
按下述方法由大約20ng(dA)n接尾的5637cDNA中富集并擴(kuò)增人SCF相關(guān)的cDNA5′末端片段于SCF特異性引物236-31和在3′端或其附近含有(dT)n順序的引物或引物混合物，如引物221-12或引物220-3、220-7及220-11(圖12C)的混合物存在下，進(jìn)行最初的26次一側(cè)PCR循環(huán)。然后在第二組PCR中，用引物221-12和235-29擴(kuò)增這些PCR的產(chǎn)物(1μl)。經(jīng)瓊脂糖凝膠分析后，均觀察到一條約370bp的主產(chǎn)物帶。用巴斯德吸管的尖端由凝膠上吸出含該帶之一部分的凝膠栓，并轉(zhuǎn)移到小的微量離心管中。加入10μl水并于84℃加熱鍋中熔化該凝膠栓。將含有引物221-12和235-29(各8pmole)的PCR混合物在40μl反應(yīng)體積中與2μl熔化并稀釋的凝膠栓一起保溫。15個反應(yīng)周期后，經(jīng)瓊脂糖凝膠分析可見到一大約370bp的輕微彌散的帶。進(jìn)行非對稱PCR以產(chǎn)生頂和底鏈順序測定模板各反應(yīng)混合物均含有4μlPCR反應(yīng)產(chǎn)物和40pmole引物221-12或235-29，并在總反應(yīng)體積100μl中進(jìn)行25次PCR(1分鐘、95℃;30秒，55℃;40秒，72℃)。用32P標(biāo)記的引物262-13(圖12B)對221-12引發(fā)的PCR產(chǎn)物混合物作直接順序分析(于標(biāo)準(zhǔn)的提取和乙醇沉淀步驟之后)，得到從核苷酸1到179的5′順序(圖15C)。
G.對干細(xì)胞因子之第一編碼外顯子位點(diǎn)處的人基因組DNA的擴(kuò)增和順序分析用SCF寡核苷酸探針篩選人基因組文庫，沒有發(fā)現(xiàn)任何含有第一編碼外顯子之已知部分的克隆。然后使用一側(cè)PCR技術(shù)擴(kuò)增并克隆該外顯子周圍的基因組順序。
使用非SCF引物如228-28或221-11，并借助DNA聚合酶I(Klenow酶，大片段;Boehringer-Mannheim)，于適合在許多不同位點(diǎn)上引導(dǎo)的非嚴(yán)格(低溫度)條件下(如12℃)對熱變性的人胎盤DNA(購自Sigma公司)進(jìn)行引物延伸。然后用含有Taq聚合酶和各100μM dNTP的Taq DNA聚合酶緩沖液將各反應(yīng)混合物稀釋5倍，并于72℃下使DNA鏈延伸反應(yīng)進(jìn)行10分鐘。然后于SCF第一外顯子寡核苷酸(如254-9)和適當(dāng)?shù)姆荢CF引物(228-29或221-11)存在下，經(jīng)PCR富集符合干細(xì)胞因子第一外顯子順序的產(chǎn)物。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明，大多數(shù)產(chǎn)物都是短鏈的(小于300bp)。為富集較長的產(chǎn)物，切下相當(dāng)于長度大于300bp之瓊脂糖凝膠部分，并以電泳法洗脫之。經(jīng)乙醇沉淀后重新懸浮在水中，將該凝膠純化的PCR產(chǎn)物作為HindⅢ至SfiⅠ的片段克隆到含有SfiⅠ位點(diǎn)的pGEM4衍生物中。
用SCF第一外顯子寡核苷酸篩選細(xì)胞集落。鑒定出幾個陽性集落并用Sanger氏法測定出插入段的順序。如圖15B所示，所得順序通過相符外顯子-內(nèi)含子交界點(diǎn)由第一外顯子向下游延伸到相鄰內(nèi)含子。
H.對小鼠、猴和狗的SCF cDNA編碼區(qū)的擴(kuò)增和順序測定由得自猴肝細(xì)胞(購自Clontech)和NIH-3T3細(xì)胞系(小鼠，ATCC CRL1658)及D17(狗，ATCC CCL183)的總RNA或polyA+RNA制備第一條cDNA鏈。用于合成第一條cDNA鏈的引物是非特異性引物228-28或SCF引物(227-30，237-19，237-20，230-25或241-6)。用引物227-29和引物227-30、237-19或237-20之一進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到了一個有預(yù)期大小的片段，然后直接或于克隆到V19.8中或pGEM載體中之后測定其順序。
利用SCF特異性引物連同254-9或228-29一起，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到接近SCF cDNA之5′端的附加順序。使用230-25或241-6，必要時還使用3′定向SCF引物，對230-25引導(dǎo)的cDNA(對于小鼠細(xì)胞來源者)或241-6引導(dǎo)的cDNA(對于猴細(xì)胞來源者)進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，得到SCF編碼區(qū)之3′端的附加順序。在擴(kuò)增D17cDNA的相似實(shí)驗(yàn)中，沒有得到SCF PCR產(chǎn)物帶。使用非特異性引物228-28由D17總RNA合成第一條鏈，并用3′定向的SCF引物(如227-29或225-31)連同228-29一起經(jīng)PCR富集所得復(fù)雜產(chǎn)物混合物中的SCF相關(guān)順序。用SfiⅠ切割該產(chǎn)物混合物，并作為SfiⅠ位點(diǎn)到平端的片段將其克隆到含有SfiⅠ位點(diǎn)的pGEM4(Promega，Madison，Wisconsin)衍生物中。用放射標(biāo)記的237-20篩選所得的異質(zhì)性文庫，測定幾個陽性克隆的DNA順序，得到狗SCF3′端順序。圖16中顯示了一一對應(yīng)之人(圖42)、猴、狗、小鼠和大鼠SCF成熟蛋白質(zhì)的氨基酸順序。
已知的SCF氨基酸順序就其大部分順序來說都是高度同源的。在所有5個種的編碼區(qū)中，都存在同樣的相符信號肽順序。圖中數(shù)字1指示的是通過據(jù)大鼠SCF類推，預(yù)期為成熟蛋白質(zhì)之氨基末端的氨基酸。狗cDNA順序含有一個不明確的密碼子(密碼子129)，致使相應(yīng)氨基酸順序中有一未定的纈氨酸/亮氨酸。人、猴、大鼠和小鼠氨基酸順序均成一線并列，而沒有任何插入或缺失。與其他種動物相比較，狗順序在130位上有一個多出的殘基。人和猴只在一個位置上有所不同，即130位的纈氨酸(人)被丙氨酸(猴)保守取代。在殘基164附近的位點(diǎn)處進(jìn)行假想的加工之前或之后，各個種之間的推測的SCF順序是高度保守的。
實(shí)施例4重組大鼠SCF在COS-1細(xì)胞中的表達(dá)為在COS-1細(xì)胞(ATCC CRL1650)中進(jìn)行暫時表達(dá)，將含有大鼠SCF1-162和SCF1-193基因的載體V19.8(實(shí)施例3C)轉(zhuǎn)染到重復(fù)的60mm平皿中(Wigler et al.，Cell，14，725-731(1978)]。質(zhì)粒V19.8SCF如圖17中所示。作為對照，也用沒有插入段的載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在翻譯后的不同時間點(diǎn)收獲組織培養(yǎng)物上清液并分析其生物學(xué)活性。表4總結(jié)了HPP-CFC生物檢測的結(jié)果，表5總結(jié)了由各典型轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)得到的MC/93H-胸苷攝入數(shù)據(jù)。用下列質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的COS-1細(xì)胞上清液所作生物檢測的結(jié)果如表4和5所示C末端在氨基酸162位之C末端剪短形式的大鼠SCF(V19.8大鼠SCF1-162)、在81位含谷氨酸的SCF1-162[V19.8大鼠SCF1-162(Glu81)]，以及在19位上含有丙氨酸的SCF1-162[V19.8大鼠SCF1-162(Ala19)]。這些氨基酸取代是實(shí)施例3所述的大鼠SCF1-162擴(kuò)增過程中進(jìn)行PCR反應(yīng)的產(chǎn)物。測定個別V19.8大鼠SCF1-162克隆的順序，發(fā)現(xiàn)兩個克隆有氨基酸取代。從表4和5中可以看出，重組大鼠SCF在用以純化天然哺乳動物SCF(實(shí)施例1)的生物檢測法中是有活性的。
表4對大鼠SCF DNA轉(zhuǎn)染之COS-1細(xì)胞的培養(yǎng)物上清液所作的HPP-CFC檢測樣品 分析CM的體積(μl)集落數(shù)/200，000細(xì)胞V19.8(無插入段) 100 050 025 012 0V19.8大鼠SCF1-162100 ＞5050 ＞5025 ＞5012 ＞506 303 8V19.8大鼠SCF1-162100 26(Glu81) 50 1025 212 0V19.8大鼠SCF1-162100 41(Ala19) 50 1825 5
樣品 分析CM的體積(μl)集落數(shù)/200，000細(xì)胞12 06 03 0表5對大鼠SCF DNA轉(zhuǎn)染之COS-1細(xì)胞的培養(yǎng)物上清液所作的MC/93H-胸苷攝入試驗(yàn)樣品 分析CM的體積(μl) cpmV19.8(無插入段) 25 1，93612 2，2526 2，1823 1，682V19.8SCF1-16225 11，64812 11，3226 11，4823 9，638V19.8SCF1-16225 6，220(Glu81) 12 5，3846 3，6923 1，980
V19.8SCF1-16225 8，396(Ala19) 12 6，6466 4，5663 3，182在用于檢測正常骨髓細(xì)胞增殖作用的人CFU-GM[Broxmeyer et al.，supra(1977)]試驗(yàn)中分別檢測重組大鼠SCF及其他因子，結(jié)果如表6所示。表6中顯示了用V19.8SCF1-162及其他因子轉(zhuǎn)染4天后，對培養(yǎng)物的COS-1上清液所作檢測的結(jié)果。集落數(shù)為三份重復(fù)培養(yǎng)物的平均值。
在CFU-GM試驗(yàn)中，重組大鼠SCF對正常人骨髓具有協(xié)同活性。在表6所示的實(shí)驗(yàn)中，SCF與人GM-CSF、人IL-3及人CSF-1均有協(xié)同作用。在其他試驗(yàn)中，還觀察到G-SCF的協(xié)同活性。使用大鼠SCF處理14天后，可見有人骨髓的增殖;但這些群落均不足40個細(xì)胞。用天然哺乳動物衍生的SCF獲得了相似的結(jié)果。
表6對大鼠SCF DNA轉(zhuǎn)染之COS-1細(xì)胞培養(yǎng)物上清液所作的人CFU-GM檢測樣品 集落數(shù)/100，000細(xì)胞(±SEM)鹽水 0GM-CSF 7±1G-CSF 24±1IL-3 5±1
樣品 集落數(shù)/100，000細(xì)胞(±SEM)CSF-1 0SCF1-1620GM-CSF+SCF1-16229±6G-CSF+SCF1-16220±1IL-3+SCF1-16211±1CSF-1+SCF1-1624±0實(shí)施例5重組SCF在中國倉鼠卵細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)本實(shí)施例涉及一種用于由CHO細(xì)胞(DHFR-;ATCCCCL61)分泌SCF的穩(wěn)定的哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)。
A.重組大鼠SCF用以產(chǎn)生SCF的表達(dá)載體是V19.8(圖17)。用以建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體的可選擇標(biāo)志物是質(zhì)粒pDSVE.1中的二氫葉酸還原酶基因。質(zhì)粒pDSVE.1(圖18)是pDSVE的衍生體，是用限制酶SalⅠ消化pDSVE，并連接到由兩個寡核苷酸，即5′TCGAC CCGGA TCCCC 3′和3′G GGCCT AGGGG AGCT 5′組成的寡核苷酸片段上而構(gòu)建的。
美國專利系列申請?zhí)?25，344和152，045中已描述了載體pDSVE。V19.8和pDSVE.1的載體部分包含一個較長的同源部分，其包括細(xì)菌COIEI復(fù)制原點(diǎn)、氨芐青毒素抗性基因以及SV40復(fù)制原點(diǎn)。這種交迭可在轉(zhuǎn)化過程中導(dǎo)致同源重組，以利于共轉(zhuǎn)化。
在有或沒有10μg載體小鼠DNA的情況下，使用1.0或0.1μg已用限制酶PvuI切成線性的pDSVE.1和10μg V19.8SCF，完成V19.8SCF構(gòu)建物和pDSVE.1的磷酸鈣共沉淀[Wigler et al.，supra(1978)]?；趤碜詐DSVE.1之DHFR基因的表達(dá)來選擇集落。使用克隆唧管摘取能在沒有加入-和胸苷的培養(yǎng)基中生長的集落，并擴(kuò)充為獨(dú)立的細(xì)胞系。以MC/93H-胸苷摻入試驗(yàn)檢測個別細(xì)胞系的細(xì)胞上清液。典型實(shí)驗(yàn)的結(jié)果示于表7中。
表7對大鼠SCF DNA轉(zhuǎn)染的穩(wěn)定的CHO細(xì)胞上清液所作的MC/93H胸苷摻入試驗(yàn)轉(zhuǎn)染的DNA 檢測的條件培養(yǎng)基的體積 cpmV19.8SCF1-16225 33，92612 34，9736 30，6573 14，7141.5 7，160None 25 69412 1，0826 8803 6721 1，354
B.重組人SCF還使用共同專利申請系列號No.501，904(申請日1990年3月29日)中所述的表達(dá)載體pDSVRα2來實(shí)現(xiàn)SCF在CHO細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。該載體包含一個基于DHFR基因的表達(dá)進(jìn)行克隆選擇和擴(kuò)增的基因。經(jīng)過兩個步驟產(chǎn)生克隆pDSRα2SCF。用限制酶BamHI消化V19.8SCF，并將SCF插入段連接到pGEM3的BamHI位點(diǎn)上。用HindⅢ和SalⅠ消化的pGEM3 SCF的DNA，并連接到用HindⅢ和SalⅠ消化的pDSRα2中。重復(fù)同樣方法，以得到在圖15C所示順序之162、164和183位氨基酸和圖42所示順序之248位上編碼羧基末端的人基因。用10nM氨甲喋呤攻擊已建立的細(xì)胞系[Shimke，"Methods in Enzymology，151，85-104(1987)]，以提高DHFR和相鄰SCF基因的表達(dá)水平。用放射免疫法(如在實(shí)施例7中)，和/或用人外周血淋巴細(xì)胞體外誘導(dǎo)集落形成法來檢測重組人SCF的表達(dá)水平。該試驗(yàn)基本上按實(shí)施例9(表12)中所述方法進(jìn)行，不同的是使用外周血代替骨髓，并于人EPO(10單位/ml)存在下，在20%O2、5%CO2和75%N2環(huán)境下進(jìn)行保溫。表8中顯示了典型實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。表達(dá)人SCF1-164的CHO克隆已于1990年9月25日保藏在ATCC(CRL10557)，并定名為Hu164SCF17。
表8對用人SCF DNA轉(zhuǎn)染的穩(wěn)定CHO細(xì)胞系之條件培養(yǎng)基所作的hPBL集落檢測轉(zhuǎn)染的DNA 檢測的培養(yǎng)基(μl) 集落數(shù)/105細(xì)胞pDSRα2hSCF1-16450 5325 4512.5 276.25 13pDSRα2hSCF1-16210 435 442.5 311.25 170.625 21None(CHO對照) 50 4實(shí)施例6重組SCF在大腸桿菌中的表達(dá)A.重組大鼠SCF本實(shí)驗(yàn)涉及借助表達(dá)[Met-1]大鼠SCF1-193(圖14C)編碼的DNA順序在大腸桿菌中表達(dá)SCF多肽。雖然可使用任何一種適于用該DNA進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)的載體，但這里所選用的質(zhì)粒是pCFM1156(圖19)。
可很容易地由pCFM836(參見已列為本文參考文獻(xiàn)的美國專利4，710，473號)構(gòu)建該質(zhì)粒，其大致方法是用T4聚合酶進(jìn)行末端充填，以破壞兩個內(nèi)源性NdeⅠ限制性位點(diǎn)，然后進(jìn)行平端連接，并用下示的小寡核苷酸取代唯一ClaⅠ和KpnⅠ限制性位點(diǎn)間的小DNA順序
借助合成的λPL啟動子控制pCFM1156質(zhì)粒中的蛋白質(zhì)表達(dá)，其中前者本身則處于溫度敏感性λCI857抑制基因[如由大腸桿菌菌株FM5(ATCC保藏號53911)或K12△Htrp中得到的]的控制下。構(gòu)建pCFM1156，使之具有一個含最適化核糖體結(jié)合位點(diǎn)和直接接在合成PL啟動子3′端上的起始密碼子的DNA順序。含有ATG起始密碼子的唯一NdeI限制性位點(diǎn)，位于其后接有λt-oop轉(zhuǎn)錄終止順序之多限制性位點(diǎn)克隆群的前面。
用Bg1Ⅱ和SstⅡ消化如實(shí)施例3中所述由PCR擴(kuò)增的cDNA(圖14C)克隆的含大鼠SCF1-193基因之質(zhì)粒V19.8SCF1-193，并分離一個603bp DNA片段。為了提供Met起始密碼子并保留大鼠SCF多肽之前三個氨基酸殘基(Gln、Glu和Ile)的密碼子，制得有NdeⅠ和Bg1Ⅱ粘性末端的合成的寡核苷酸接頭5′ TATGCAGGA 3′ACGTCCTCTAG 5′將此小寡核苷酸和大鼠SCF1-193基因片段在圖19所示質(zhì)粒的唯一NdeⅠ和SstⅡ位點(diǎn)處插入pCFM1156中。此連接反應(yīng)的產(chǎn)物即為表達(dá)質(zhì)粒pCFM1156大鼠SCF1-193。
將pCFM1156大鼠SCF1-193質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)FM5大腸桿菌宿主細(xì)胞中?；趐CFM1156載體上攜帶的抗生素(卡那霉素)抗性標(biāo)志選擇含質(zhì)粒的細(xì)胞。由培養(yǎng)的細(xì)胞中分離質(zhì)粒DNA，經(jīng)DNA順序分析進(jìn)一步確定合成寡核苷酸的DNA順序及其與大鼠SCF基因相接處的DNA順序。
為構(gòu)建編碼[Met-1]大鼠SCF1-162多肽的質(zhì)粒pCFM1156大鼠SCF1-162，由V19.8大鼠SCF1-162中分離EcoRⅠ至SstⅡ的限制性片段，并經(jīng)連接反應(yīng)，在唯一的EcoRⅠ和SstⅡ限制性位點(diǎn)上插入到質(zhì)粒pCFM大鼠SCF1-193中，從而取代大鼠SCF基因羧基末端的編碼區(qū)。
為了構(gòu)建分別編碼[Met-1]大鼠SCF1-164和[Met-1]大鼠SCF1-165多肽的質(zhì)粒pCFM1156大鼠SCF1-164及pCFM1156大鼠SCF1-165，由PCR擴(kuò)增的編碼SCF基因之3′末端的DNA中分離EcoRⅠ至SstⅡ的限制性片段，并設(shè)計(jì)在編碼SCF基因之羧基末端區(qū)域的DNA中引入位點(diǎn)特異性改變。在pCFM1156大鼠SCF1-164的構(gòu)建中使用寡核苷酸引物227-29和237-19，在pCFM1156大鼠SCF1-165的構(gòu)建中使用227-29和237-20，以進(jìn)行DNA擴(kuò)增。
B.重組的人SCF本實(shí)施例涉及借助編碼[Met-1]人SCF1-164和[Met-1]人SCF1-183的DNA順序(圖15C)在大腸桿菌中表達(dá)人SCF多肽。用含有人SCF1-162基因的質(zhì)粒V19.8人SCF1-162作為PCR擴(kuò)增人SCF基因的模板。用寡核苷酸引物227-29和237-19產(chǎn)生PCR DNA，然后用限制性核酸內(nèi)切酶PstⅠ和SstⅡ消化之。為了提供Met起始密碼子并保留人SCF多肽之前四個氨基酸殘基(Glu、Gly、Ile、Cys)的密碼子，制備具有NdeⅠ和PstⅠ粘性末端的合成寡核苷酸接頭5′ TATGGAAGGTATCTGCA 3′3′ ACCTTCCATAG 5′經(jīng)連接反應(yīng)將此小寡聚接頭和PCR衍生的人SCF基因片段在圖19所示質(zhì)粒的唯一NdeⅠ和SstⅡ位點(diǎn)處插入表達(dá)質(zhì)粒pCFM1156(如前所述)中。
將pCFM1156人SCF1-164質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)FM5大腸桿菌宿主細(xì)胞內(nèi)?；跀y帶在pCFM1156載體上的抗生素(卡那霉素)抗性標(biāo)志選擇含質(zhì)粒的細(xì)胞。由培養(yǎng)的細(xì)胞中分離質(zhì)粒DNA，并經(jīng)DNA順序分析進(jìn)一步確定人SCF基因的DNA順序。
為了構(gòu)建編碼[Met-1]人SCF1-183(圖15C)多肽的質(zhì)粒pCFM1156人SCF1-183，由pGEM人SCF114-183(見下述)中分離編碼人SCF基因之羧基末端的EcoRI至HindⅢ限制性片段，由pCFM1156人SCF1-164中分離編碼人SCF基因之氨基末端的SstⅠ至EcoRⅠ限制性片段，并從pCFM1156中分離大的HindⅢ至SstⅠ限制性片段。將這三個DNA片段連接在一起，形成pCFM1156人SCF1-183質(zhì)粒，然后將其轉(zhuǎn)化到FM5大腸桿菌宿主細(xì)胞內(nèi)。利用卡那霉素抗性選擇細(xì)胞集落后，分離質(zhì)粒DNA并經(jīng)DNA順序分析進(jìn)一步確定其正確DNA順序。pGEM人SCF114-183質(zhì)粒是含有EcoRⅠ-SphⅠ片段之pGEM3的衍生物，其中EcoRⅠ-SphⅠ片段包括如圖15C所示的人SCF cDNA順序的核苷酸609至820。用寡核苷酸引物235-31和241-6(圖12B)以及PCR22.7(圖13B)作模板，由PCR中分離該質(zhì)粒中的EcoRⅠ-SphⅠ插入段。引物241-6的順序是以人基因組順序至含氨基酸176密碼子之外顯子的3′側(cè)為基礎(chǔ)的。
C.發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)生人SCF1-164的大腸桿菌在16升發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵培養(yǎng)含有質(zhì)粒pCFM1156人SCF1-164的FM5大腸桿菌K12宿主，以制備SCF1-164。種子培養(yǎng)物于-80℃下保存在含17%甘油的Luria培養(yǎng)液內(nèi)。為制備接種物，將100μl融化的種子儲備物轉(zhuǎn)移到裝在2升埃倫美厄培養(yǎng)瓶內(nèi)的500ml Luria培養(yǎng)液中，并在搖庫(250RPM)上使之30℃生長過夜。
為制備大腸桿菌細(xì)胞糊狀物，用以作為純化本實(shí)施例所述人SCF1-164的起始材料，可使用下述的發(fā)酵條件。
將接種培養(yǎng)物無菌操作下轉(zhuǎn)移到含8升分批培養(yǎng)基(見表9)的16升發(fā)酵器內(nèi)。使培養(yǎng)物以批量方式生長，直到其OD-600約為3.5。此時，使用蠕動泵將無菌發(fā)酵原料(發(fā)酵原料1，表10)送入發(fā)酵器以控制進(jìn)料速度。進(jìn)料速度隨時間成指數(shù)增加達(dá)到生長速度為0.15/小時。生長期間溫度控制在30℃。通過控制空氣流速、攪拌速度、管內(nèi)回流壓力及補(bǔ)氧量，將發(fā)酵器內(nèi)溶解氧的濃度自動控制在50%飽和度。使用磷酸和氫氧化銨將pH自動控制在7.0。在OD-600約為30時，將發(fā)酵器內(nèi)溫度提高到42℃，以誘導(dǎo)發(fā)酵的生產(chǎn)期。同時停止供給發(fā)酵原料1，而以200ml/小時的速度加入發(fā)酵原料2(表11)。約6小時后，將發(fā)酵器內(nèi)容物冷卻到15℃。SCF1-164的產(chǎn)率約為30mg/OD-L。在BeckmanJ6-B轉(zhuǎn)子中以3000g離心1小時收獲細(xì)胞沉淀物。收獲的細(xì)胞糊狀物于-70℃下冷凍保存。
生產(chǎn)SCF1-164的優(yōu)選方法與上述者相似，不同的是作了如下改動1)直到培養(yǎng)物的OD-600值達(dá)到5-6時方開始加入發(fā)酵原料1。
2)原料1的給料速度增加更為緩慢，以使生長速度更慢(約0.08)。
3)OD-600為20時開始誘導(dǎo)培養(yǎng)物。
4)向發(fā)酵器內(nèi)引入原料2的速度為300ml/小時。
其他所有操作，包括培養(yǎng)基均與上述者相似。
使用該方法，在OD＝25時所達(dá)到的產(chǎn)率約為35-40mg/OD-L。
表9分批培養(yǎng)基的組成酵母浸膏 10ag/L葡萄糖 5K2HPO43.5KH2PO44MgSO4·7H2O 1NaCl 0.625Dow P-2000消泡劑 5ml/8L維生素溶液b2ml/L微量金屬元素溶液c2ml/La.除特別注明者外，所有成分均以g/L為單位。
b.維生素溶液核黃素，0.42g/L;泛酸5.4g/L;煙酸，6g/L;吡哆醇，1.4g/L;生物素，0.06g/L;葉酸，0.04g/L。
c.微量金屬元素溶液FeCl3·6H2O，27g/L;ZnCl2·4H2O，2g/L;CaCl2·6H2O，2g/L;Na2MoO4·2H2O，2g/L;CuSO4·5H2O，1.9g/L;濃鹽酸，100ml/L。
表10原料培養(yǎng)基1的組成酵母浸膏 50ag/L葡萄糖 450MgSO4·7H2O 8.6微量金屬元素溶液b10ml/L維生素溶液c10ml/La.除特別注明者外，所有成分均以g/L為單位。
b.微量金屬元素溶液FeCl3·6H2O，27g/L;ZnCl2·4H2O，2g/L;CaCl2·6H2O，g/L;Na2MoO4·2H2O，2g/L;CuSO4·5H2O，1.9g/L;濃鹽酸，100ml/L。
c.維生素溶液核黃素，0.42g/L;泛酸5.4g/L;煙酸，6g/L;吡哆醇，1.4g/L;生物素，0.06g/L;葉酸，0.04g/L。
表11原料培養(yǎng)基2的組成胰蛋白胨 172a酵母浸膏 86葡萄糖 258a.所有成分均以g/L為單位。
實(shí)施例7免疫檢測法檢測SCF按下述程序完成定量測定SCF的放射免疫檢測法(R1A)。
將如實(shí)施例1中所述由BRL3A細(xì)胞中純化的SCF制劑與抗血清一起，于37℃下保溫2小時。保溫2小時后，在冰上冷卻樣品管，加入125I-SCF，并在4℃下至少保溫20小時。各試管均含有500μl由50μl稀釋的抗血清、約60，000cpm125I-SCF(3.8×107cpm/μg)、5μl trasylol和0-400μl SCF標(biāo)準(zhǔn)品組成的保溫混合物[加緩沖液(磷酸鹽緩沖鹽水、0.1%牛血清白蛋白、0.05%Triton X-100、0.025%疊氮化物)補(bǔ)足體積]?？寡迨怯玫米訠RL3A條件培養(yǎng)基的50%純天然SCF制劑免疫兔，并由第二次試驗(yàn)采血血樣制得的。試驗(yàn)中所用的終抗血清稀釋度為1∶2000。
加入150μl Staph A(Calbiochem)沉淀抗體結(jié)合的125I-SCF。室溫下保溫1小時后，離心樣品并用0.75ml含0.15M NaCl、2mM EDTA和0.05%Triton X-100的10mMTris-HCl(pH8.2)洗細(xì)胞沉淀物兩次。洗過的沉淀物在γ計(jì)數(shù)器上計(jì)數(shù)，以確定125I-SCF結(jié)合的百分比。由全部最終數(shù)值中減去無血清管的結(jié)合計(jì)數(shù)，以糾正非特異性沉淀誤差。圖20中顯示了一典型RIA的結(jié)果。由未標(biāo)記之標(biāo)準(zhǔn)品產(chǎn)生的對125I-SCF結(jié)合的百分抑制率是劑量依賴性的(圖20A)，而且如圖20B所示，當(dāng)用SDS-PAGE和放射自顯影技術(shù)檢驗(yàn)免疫沉淀物時，可見125I-SCF蛋白質(zhì)帶受到競爭。圖20B中，泳道1是125I-SCF，泳道2、3、4和5是分別受到0、2、100和200ng SCF標(biāo)準(zhǔn)品競爭的免疫沉淀的125I-SCF。正如根據(jù)RIA管中抗體可沉淀之cpm數(shù)值減少，以及免疫沉淀的125I-SCF蛋白帶(約在Mr31，000處遷移)減弱所看出的，該多克隆抗血清能夠誤別按實(shí)施例1所述方法純化的SCF標(biāo)準(zhǔn)品。
也可用Western印跡法檢測在大腸桿菌、COS-1和CHO細(xì)胞中表達(dá)的重組SCF。用SDS-PAGE法分離部分純化之大腸桿菌表達(dá)的大鼠SCF1-193(實(shí)施例10)、COS-1細(xì)胞表達(dá)的大鼠SCF1-162和SCF1-193以及人SCF1-162(實(shí)施例4和9)和CHO細(xì)胞表達(dá)的大鼠SCF1-162(實(shí)施例5)。電泳后，使用Bio-Rad Transblot裝置將蛋白帶轉(zhuǎn)移到0.2μm硝化纖維素濾膜上(60V，5小時)。在含有10%羊血清的PBS(pH7.6)中封閉硝化纖維素濾膜4小時，然后加入1∶200稀釋的兔預(yù)免疫或免疫血清(免疫方法同上所述)，室溫下保溫14小時。加入辣根過氧化物酶結(jié)合的羊抗兔IgG試劑(Vector Laboratories.)和4-氯代-1-萘酚顯色劑后即可顯現(xiàn)出抗體-抗血清復(fù)合物。
圖21和22中給出了兩次Western分析的結(jié)果。圖21中，泳道3和5是200μlCOS-1細(xì)胞產(chǎn)生的人SCF1-162;泳道1和7是200μlCOS-1細(xì)胞產(chǎn)生的人EPO(用V19.8EPO轉(zhuǎn)染的COS-1細(xì)胞);泳道8是預(yù)染色的分子量標(biāo)志物。泳道1-4與預(yù)免疫血清保溫，泳道5-8加免疫血清保溫。該免疫血清可特異地識別表觀分子量約30，000的彌散帶，后者來自產(chǎn)生人SCF1-162的COS-1細(xì)胞，而不是來自產(chǎn)生人EPO的COS-1細(xì)胞。
在圖22所示的Western印跡中，泳道1和7是1μg大腸桿菌中產(chǎn)生之大鼠SCF1-193的部分純化制劑;泳道2和8是麥胚凝集素-瓊脂糖純化之COS-1細(xì)胞產(chǎn)生的大鼠SCF1-193;泳道4和9是麥胚凝集素-瓊脂糖純化之COS-1細(xì)胞產(chǎn)生的大鼠SCF1-162;泳道5和10是麥胚凝集素-瓊脂糖純化之CHO細(xì)胞產(chǎn)生的大鼠SCF1-162;泳道6是預(yù)染色的分子量標(biāo)志物。泳道1-5和泳道6-10分別加預(yù)免疫和免疫血清保溫。大腸桿菌產(chǎn)生的大鼠SCF1-193(泳道1和7)以表觀分子量約24，000道爾頓遷移，而COS-1細(xì)胞產(chǎn)生的大鼠SCF1-193(泳道2和8)則以表觀分子量約24-36，000道爾頓遷移。這種分子量上的差異是可以想見的，因?yàn)椴溉閯游锛?xì)胞能夠產(chǎn)生糖基化作用，而細(xì)菌細(xì)胞則不能。用編碼大鼠SCF1-162的順序轉(zhuǎn)染COS-1(泳道4和9)或CHO細(xì)胞(泳道5和10)可比用編碼SCF1-193的順序轉(zhuǎn)染泳道2和8表達(dá)有更低平均分子量的SCF。
COS-1和CHO細(xì)胞表達(dá)的大鼠SCF1-162產(chǎn)物是一系列表觀分子量為24-36，000道爾頓的帶。被表達(dá)的SCF的這種異質(zhì)性很可能是由于碳水化合物的變異，致使SCF多肽受到不同程度的糖基化作用。
總地說來，Western分析表明用天然哺乳動物SCF免疫之兔的免疫血清可識別大腸桿菌、COS-1和CHO細(xì)胞中產(chǎn)生的重組SCF，但不能識別包含COS-1細(xì)胞產(chǎn)生之EPO的對照樣品中的帶。另外，同一兔的預(yù)免疫血清沒有與任何大鼠或人SCF表達(dá)產(chǎn)物反應(yīng)，也進(jìn)一步證明了SCF抗血清的特異性。
實(shí)施例8重組SCF的體內(nèi)活性A.骨髓移植中使用大鼠SCF按實(shí)施例4所述，進(jìn)行用V19.8SCF1-162轉(zhuǎn)染COS-1細(xì)胞的大容量實(shí)驗(yàn)(T175cm2培養(yǎng)瓶代替60mm培養(yǎng)皿)。收獲約270ml上清液?；旧习磳?shí)施例1中所述，在麥胚凝集素-瓊脂糖柱和S-Sepharose柱上層析分離該上清液。在基于小鼠W/WV遺傳學(xué)的骨髓移植模型中估測重組SCF的活性。W/WV小鼠具有干細(xì)胞缺陷，而導(dǎo)致巨細(xì)胞性貧血(大紅細(xì)胞)，并可以由正常動物體內(nèi)移植骨髓而不必照射受體動物[Russel et al.，Science，144，844-846(1964)]。移植后正常供體干細(xì)胞比有缺陷的受體細(xì)胞生長快。
下列實(shí)施例中，各組均包括6只年令相當(dāng)?shù)男∈?。由正常供體小鼠體內(nèi)收集骨髓并移植到W/WV小鼠體內(nèi)。在移植后不同時間化驗(yàn)全血血象，并根據(jù)受體外周血細(xì)胞向供體表現(xiàn)型的轉(zhuǎn)化來確定供體骨髓是否已被接受。而受體向供體表現(xiàn)型的轉(zhuǎn)化則是借助于監(jiān)測紅細(xì)胞的前向散射圖形(FASCAN，Becton Dickenson)而確定的。在每個時間點(diǎn)比較各移植動物與供體和受體未移植動物的血象。使用以Kolmogorov-Smirnov統(tǒng)計(jì)學(xué)為基礎(chǔ)的計(jì)算機(jī)程序分析得自血流系統(tǒng)的直方圖來完成這一比較[Young，J.Histochem.and Cytochem.，25，935-941(1977)]。移植物生長的一個獨(dú)立的定性指征是通過對受體血液的血紅蛋白電泳分析所確定的血紅蛋白類型[Wong et al.，Mol.and Cell.Biol.，9，798-808(1989)]，此與根據(jù)Kolmogorov-Smirnov統(tǒng)計(jì)學(xué)分析得出的良好結(jié)果完全符合。
將大約3×105個細(xì)胞在沒有作SCF處理(圖23對照組)的情況下由C56BL/6J供體小鼠移植給W/WV受體動物。第二組則接受3×105個已用SCF(600單位/ml)于37℃下處理20分鐘并被一同注射的供體細(xì)胞(圖23預(yù)處理組)。(1單位SCF定義為在MC/9生物檢測法中產(chǎn)生的最大半刺激量)。第三組中，移植3×105個供體細(xì)胞后，以每天大約400單位SCF的劑量給受體小鼠作皮下注射(sub-Q)三天(圖23皮下注射組)。如圖23所示，在兩個SCF處理組中供體骨髓接植比未處理的對照組快。移植后29天時，SCF預(yù)處理組已轉(zhuǎn)化為供體表現(xiàn)型。這一實(shí)例說明了SCF在骨髓移植中的治療作用。
B.大鼠SCF在Steel小鼠體內(nèi)的活性S1位點(diǎn)的突變可導(dǎo)致造血細(xì)胞、色素細(xì)胞和生殖細(xì)胞的缺失。造血細(xì)胞缺乏的明顯表現(xiàn)是紅細(xì)胞[Russell，In Al Gorden，Regu-lation of Hematopoiesis，Vol.1，649-675，Appleton-Century-Crafts，New York(1970)]、中性白細(xì)胞[Ruscetti，Proc，Soc.Exp.Biol.Med.，152，398(1970)]、單核細(xì)胞[Shibata，J.Immunol.，135，3905(1985)]、巨核細(xì)胞[Ebbe，EXP，Hematol.，6，201(1978)]天然殺傷細(xì)胞[Clark，Immuno Genetics，12，601(1981)]及肥大細(xì)胞[Hayashi，Dev.Biol.，109，234(1985)]數(shù)目的減少。Steel小鼠支持干細(xì)胞的能力差，因此是一種骨髓移植的不良受體[Bannerman，Prog.Hematol.，8，131(1973)]。Steel(S1/S1)小鼠體內(nèi)缺乏編碼SCF的基因。
Steel小鼠對SCF活性有體內(nèi)敏感性。利用Steel-Dickie(S1/S1d)小鼠對各種不同的重組SCF蛋白質(zhì)作不同時間的檢測。由Jacken Labs，Bar Harbor，ME購得6至10周令的Steel小鼠。用SYSMEX F-800微型細(xì)胞計(jì)數(shù)器(Baxtor，Irvine，CA)檢測外周血紅細(xì)胞、白紅蛋白和血小板。用Coulter Channelyzer 256(Coulter Elec-tronics，Marietta，GA)細(xì)胞計(jì)數(shù)裝置計(jì)數(shù)外周血白細(xì)胞(WBC)。
在圖24所示的實(shí)驗(yàn)中，用大腸桿菌產(chǎn)生的、按實(shí)施例10所述方法純化的SCF1-164，以每天每公斤體重100μg的劑量給Steel-dickie小鼠注射30天，然后再以每天每公斤體重30μg的劑量注射20天。注射時用生理鹽水(Abbott Labs，North Chiacago，IL)+0.1%胎牛血清配制該蛋白質(zhì)。每日皮下注射1次。在圖24中所示的時間采集約50μl尾血檢驗(yàn)外周血象。將采集的血樣放入3%EDTA包被的注射器中并分散到涂擦EDTA粉末的微量離心管內(nèi)(Brinkman，Westburg，NY)。相對于對照組，處理組動物可發(fā)生非常明顯的巨大紅細(xì)胞性貧血。停止治療后治療組動物又回復(fù)到原來的巨紅細(xì)胞性貧血狀態(tài)。在圖25和26所示的實(shí)驗(yàn)中，用上述各種重組形式的SCF以100μg/公斤/天的劑量給Steel小鼠注射20天。按實(shí)施例10所述方法制備兩種形式的大腸桿菌產(chǎn)生的大鼠SCF，即SCF1-164和SCF1-193。另外，還檢測按實(shí)施例12所述方法制得的結(jié)合了聚乙二醇的大腸桿菌SCF1-164(即SCF1-164PEG25)。還檢測了按實(shí)施例5所述方法制備并按實(shí)施例11所述方法純化的CHO產(chǎn)生的SCF1-162。用3%EDTA包被的注射器經(jīng)心臟穿刺由動物體內(nèi)采血并分散到用EDTA粉擦過的試管中。處理20天后的外周血象如圖25、26所示，其中圖25顯示白細(xì)胞(WBC)、圖26顯示血小板。SCF1-164PEG25組的WBC差異如圖27所示?？梢娪兄行园准?xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和血小板數(shù)的絕對增多。使用SCF1-164PEG25可顯示出最為突出的效果。
還對不同類型的淋巴細(xì)胞亞群作了檢測，所得數(shù)據(jù)如圖28所示。人CD4的鼠類等同物，或T輔助細(xì)胞的標(biāo)志物是L3T4[Dialynas，J.Immunol.，131，2445(1983)]。LYT-2是細(xì)胞毒性T細(xì)胞上的鼠抗原[Ledbetter，J.Exp.Med.，153，1503(1981)]。用抗這兩種抗原的單克隆抗體來估測治療組動物的T細(xì)胞亞類。
按下述方法染全血中的T淋巴細(xì)胞亞群從個別動物體內(nèi)抽取200μl全血并加到EDTA處理過的試管中。每份血樣品均用無菌去離子水溶解60分鐘，然后制成10×Dulbecco′s磷酸鹽緩沖鹽溶液(PBS)(Gibco，Grand Island，NY)的等滲液。用含有0.1%胎牛血清(Flow Laboratory，Mclean，VA)和0.1%疊氮鈉的1×PBS(Gibco，Grand Island，NY)將溶解的血樣品洗兩次。使各份血樣品沉淀到96孔園底群集皿中，并離心之。將細(xì)胞沉淀物(含2-10×105細(xì)胞)重新懸浮于20μl結(jié)合有藻紅蛋白(PE)(Becton Dickinson，Mountain View，CA)的大鼠抗小鼠L3T4和20μl結(jié)合有異硫氰酸熒光素的大鼠抗小鼠Lyt-2中，并在冰上(4℃)保溫30分鐘。保溫后在上述1×PBS中洗細(xì)胞2次。然后在FACScan細(xì)胞分析系統(tǒng)(Becton Dickinson，Mountain View，CA)中分析各血樣。使用標(biāo)準(zhǔn)自動補(bǔ)償方法和校準(zhǔn)小珠(Calibrite beads)(Becton Dickin-son，Mountain View，CA)對該系統(tǒng)進(jìn)行校正使之標(biāo)準(zhǔn)化。所得數(shù)據(jù)表明了輔助性T細(xì)胞群和細(xì)胞毒性T細(xì)胞數(shù)目的絕對增加。
C.SCF在靈長類動物體內(nèi)的活性檢測大腸桿菌中表達(dá)的(實(shí)施例6B)并按實(shí)施例10中所述方法純化的同種人SCF1-164在正常靈長類動物體內(nèi)的活性。將成年雄性狒狒(Papio sp.)分成三組進(jìn)行研究未治療組，n＝3;SCF100μg/公斤/天給藥組，n＝6;SCF30μg/公斤/天給藥組，n＝6。治療組每天接受一次SCF皮下注射。在氯胺酮麻醉下自動物體內(nèi)采血。在給藥的第1、6、11、15、20和25天采集血樣并作全血細(xì)胞計(jì)數(shù)、網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)和血小板計(jì)數(shù)。
所有被治療動物均存活，并且對SCF無任何不良反應(yīng)。如圖29中所示，給予100μg/公斤/體重的動物表現(xiàn)白細(xì)胞數(shù)增加。圖29中還列出了外周血涂片經(jīng)Wright-Giemsa染色后，作人工計(jì)數(shù)所得到的不同細(xì)胞計(jì)數(shù)值。可見中性白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞均呈現(xiàn)絕對增多。如圖30所示，100μg/公斤體重治療組的血細(xì)胞比容和血小板數(shù)也有所增加。
以200μg/Kg/天的劑量，給正常狒狒連續(xù)靜脈輸注入SCF(按實(shí)施例12中所述方法用聚乙二醇修飾的hSCF1-164)，檢測其在動物體內(nèi)的作用并與未修飾的蛋白質(zhì)比較。從0天開始給藥，共處理28天。所得外周血WBC計(jì)數(shù)結(jié)果如下表所示。從中可以看出，PEG修飾的SCF可比未經(jīng)修飾的SCF更早地引起外周血WBC數(shù)目的增加。
用每天每公斤體重200μg hSCF1-164處理動物＃M88320 動物＃M88129天數(shù) WBC數(shù) 天數(shù) WBC數(shù)0 5800 0 6800+7 10700 +7 7400+14 12600 +14 20900+16 22000 +21 18400+22 31100 +23 24900+24 28100 +29 13000+29 9600 +30 23000+36 6600 +37 12100+43 5600 +44 10700+51 7800用每天每公斤體重200μg PEG-h SCF1-164處理動物＃M88350 動物＃M89116天數(shù) WBC數(shù) 天數(shù) WBC數(shù)-7 12400 -5 7900-2 11600 0 7400+4 24700 +6 16400+7 20400 +9 17100+11 24700 +13 18700+14 32600 +16 19400
動物＃M88350 動物＃M89116天數(shù) WBC數(shù) 天數(shù) WBC數(shù)+18 33600 +20 27800+21 26400 +23 20700+25 16600 +27 20200+28 26900 +29 18600+32 9200 +33 7600實(shí)施例9重組人SCF的體外活性按實(shí)施例4中所述表達(dá)大鼠SCF的方法，在COS-1細(xì)胞中表達(dá)經(jīng)實(shí)施例3D所述PCR反應(yīng)制得的相應(yīng)于氨基酸1-162的人SCF的cDNA。用人骨髓及小鼠HPP-CFC和MC/9檢測法檢測COS-1上清液。在小鼠檢測法中，于所試濃度下該人蛋白質(zhì)沒有活性，但它對人骨髓是有活性的。檢測所用的培養(yǎng)條件如下以Ficoll-Hypaque梯度(Pharmacia)離心取自健康自愿者的人骨髓并培養(yǎng)在2.1%甲基纖維素、30%胎牛血清、6×10-5M2-巰基乙醇、2mM谷氨酰胺、ISCOVE氏培養(yǎng)基(GIBCO)、20U/ml EPO中，并在含有7%O2、10%CO2和83%N2的濕氣中以1×105細(xì)胞/ml的濃度培養(yǎng)14天。表12中顯示了由重組人和大鼠SCF COS-1上清液產(chǎn)生的集落數(shù)。其中只計(jì)數(shù)那些大小等于或大于0.2mm的集落。
表12在對SCF反應(yīng)中人骨髓細(xì)胞集落的生長轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒 檢測的CM體積μl集落數(shù)/100，000細(xì)胞±SDV19.8未插入 100 050 0V19.8人SCF1-162100 33±750 22±3V19.8大鼠SCF1-162100 13±150 10圖31A中顯示了生長14天后的集落(放大12倍)。箭頭指示一典型集落。這些集落就其大體積(平均0.5mm)來說相似于小鼠HPP-CEC集落。由于存在EPO，使得某些集落血紅蛋白化。當(dāng)使用Cytospin(Shandon)分離集落并離心在玻片上，然后用Wright-Giemsa染色時，可見主要細(xì)胞類型為如圖31B中所示具有大核胞漿比例的未分化細(xì)胞(放大400×)。圖31B中箭頭分別指示下列結(jié)構(gòu)箭頭1，胞漿;箭頭2，核;箭頭3，液泡。未成熟細(xì)胞為一類大細(xì)胞，當(dāng)其成熟時細(xì)胞逐漸變小[Diggs et al.，The Morpho-logy of Human Blood Cells，Abbott Labs，3(1978)]。造血成熟過程中，早期細(xì)胞的核相對于胞漿來說要大些。另外，用Wright-Giemsa染色后，未成熟細(xì)胞的胞漿比核深些。而當(dāng)細(xì)胞成熟時，核染色則比胞漿深些。從含重組人SCF之培養(yǎng)物得到的人骨髓細(xì)胞的形態(tài)學(xué)看，可以認(rèn)為SCF作用的靶細(xì)胞的直接產(chǎn)物是相對未成熟的造血祖細(xì)胞。
在瓊脂集落檢測中，試驗(yàn)了重組人SCF與上述其他生長因子對人骨髓細(xì)胞的作用，結(jié)果如表13所示。就個別CSF來說，SCF與G-CSF、GM-CSF、IL-3和EPO有協(xié)同作用，可加速骨髓靶細(xì)胞的增殖。
表13重組人SCF與其他人集落刺激因子的協(xié)同作用集落數(shù)/105細(xì)胞(14天)空白對照 0hG-CSF 32±3hG-CSF+hSCF 74±1hGM-CSF 14±2hGM-CSF+hSCF 108±5hIL-3 23±1hIL-3+hSCF 108±3hEpo 10±5hEpo+IL-3 17±1hEpo+hSCF 86±10hSCF 0重組人SCF的另一活性是能夠引起軟瓊脂中人急性髓性白血病(AML)細(xì)胞系KG-1(ATCC CCL246)的增殖?；旧习匆咽龅腒G-1瓊脂克隆法[Koeffler et al.，Science，200，1153-1154(1978)]試驗(yàn)得自轉(zhuǎn)染細(xì)胞的COS-1上清液，方法上不同的是鋪板細(xì)胞濃度為3000個/ml。表14中給出了各組三份培養(yǎng)物的統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)。
表14KG-1軟瓊脂克隆試驗(yàn)轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒 分析的體積 集落數(shù)/3000細(xì)胞±SDV19.8(未插入段) 25 2±1V19.8人SCF1-16225 14±012 8±06 9±53 6±41.5 6±6V19.8大鼠SCF1-16225 6±1人GM-CSF 50(5ng/ml) 14±5實(shí)施例10在大腸桿菌中表達(dá)的重組SCF產(chǎn)物的純化按實(shí)施例6C所述方法發(fā)酵培養(yǎng)可表達(dá)人SCF1-164的大腸桿菌。將收獲的細(xì)胞(912g濕重)懸浮在水中至體積為4.6升，然后使之三次通過實(shí)驗(yàn)室勻漿器(Gaulin Model 15MR-8TBA)(8000psi)。離心(17700×g，30分鐘，4℃)得到破碎的細(xì)胞團(tuán)塊，用水洗一次(再次懸浮并離心)，然后懸浮在水中至體積為400ml。將含有不溶性SCF(約10-12gSCF)的細(xì)胞碎片加到3950ml適當(dāng)混合物中，該混合物內(nèi)各組分及終濃度分別為8M尿素(超純品)、0.1mM EDTA、50mM乙酸鈉，pH6-7;估計(jì)SCF濃度為1.5mg/ml。室溫下保溫4小時以溶解SCF。離心(17700g，30分鐘，室溫)除去其余的不溶性物質(zhì)。為使已溶解的SCF重新拆迭/再氧化，攪拌下將上清部分緩緩加入39.15升適當(dāng)混合物中，該混合物內(nèi)的各成分及其終濃度為2.5M尿素(超純品)、0.01mM EDTA、5mM乙酸鈉、50mM Tris-HCl(pH8.5)、1mM谷胱甘肽、0.02%(重量/體積)疊氮鈉。SCF的濃度約為150μg/ml。室溫下攪拌約60小時后[也可以是較短時間，如約20小時]，使用有3個截留分子量為10000之聚砜膜(總面積15平方英尺)的Millipore Pellicon超濾裝置將該混合物濃縮2倍，然后對7倍體積的20mM Tris-HCl(pH8)透析。濃縮/超濾期間的溫度為4℃，泵送速率為5升/分鐘，過濾速度為600ml/分鐘?；厥罩疁粑锏慕K體積為26.5升。用SDS-PAGE法檢測樣品有或沒有還原，此證明大多數(shù)(＞80%)細(xì)胞碎片SCF經(jīng)與8M尿素保溫而被溶解，并如對未還原樣品所作SDS-PAGE分析中看到的，在拆迭/氧化之后存在多種形式的SCF。如圖9所示，代表正確氧化之主要形式的SCF(見下述)，相對于分子量標(biāo)志物(還原的)，其遷移的表觀分子量約為17，000(未還原的)。其他形式包括以表觀分子量約18-20，000遷移的材料(未還原的)，其代表有不正確鏈內(nèi)二硫鍵的SCF;而以表觀分子量范圍為37，000(未還原的)遷移的帶(或更大的帶)則被認(rèn)為是代表不同的SCF形式，它們具有可導(dǎo)致這樣一些SCF多肽鏈的鏈內(nèi)二硫鍵，即它們可以共價連接以分別形成二聚體或較大的寡聚體。經(jīng)分離步驟后，可除去余留的大腸桿菌污染物和不要的SCF形成，從而得到生物學(xué)活性構(gòu)象上有明顯均質(zhì)性的純化的SCF。
加入375ml10%(體積/體積)乙酸，將超濾滯留物的pH調(diào)到4.5，從而出現(xiàn)可見的沉淀物質(zhì)。60分鐘后，大部分沉淀物即已沉到容器底部，棄去上層之24升并通過CunoTM30SP深濾器以500ml/分鐘的速度過濾，直到完全澄清。然后用水將濾液稀釋1.5倍，并于-4℃下加至在25mM乙酸鈉(pH4.5)中平衡過的S-Sepharose Fast Flow柱(Pharmacia)上。在4℃下，以5L/h流速進(jìn)行柱層析。加入樣品后，用5倍柱床體積(約6升)的柱緩沖液洗柱，并用在緩沖液中的0至0.35M NaCl梯度洗脫?？偺荻润w積為20升，所收集的每部分(管)為200ml。洗脫曲線如圖33所示。用SDS-PAGE法分析從S-Sepharose柱中收集的各等份(10μl)還原(圖32A)和未還原(圖32B)的樣品。由分析可以看出，實(shí)際上在280nm處的所有吸收(圖32和33)都是由于SCF材料的存在。
在主吸收峰(第22-38管，圖33)中，是以正確氧化的形式占優(yōu)勢。見于各部分中的次要形式包括在SDS-PAGE分析中表觀分子量為18-20，000的非正確氧化的物質(zhì)(未還原的)，其出現(xiàn)于主吸收峰的前肩部(第10-21管，圖32B);且二硫鍵結(jié)合的二聚體材料則存在于整個吸收區(qū)域(第10-38管，圖32B)中。
合并由S-Sepharose柱上收集的第22-38部分(管)，加入約11毫升6NHCl將其pH調(diào)到2.2，并于4℃下加到用50%(體積/體積)乙醇、12.5mM HCl(溶液A)平衡的VydacC4柱(高8.4cm，直徑9cm)上。柱樹脂的制備是先將干樹脂懸浮于80%(體積/體積)乙醇、12.5mM HCl(溶液B)中，然后用溶液A平衡之。加樣品之前，用溶液A到溶液B(總體積6升)的空白梯度過柱，然后再用溶液A平衡。加樣品之后，用2.5升溶液A洗柱，并以2670ml/小時的流速用溶液A至溶液B的梯度(總體積18升)洗脫結(jié)合在柱上的SCF材料。以每管50ml收集286管，并按上述方法用280nm吸光率(圖35)和SDS-PAGE法(每管25μl)分析各等分部分(圖34A，還原條件;圖34B，非還原條件)。合并含有高純度正確氧化之SCF的第62-161管[其后在該梯度中洗脫了小量分子量約18-20，000的非正確氧化的單體(未還原的)(約為第166-211管)及后來的二硫鍵結(jié)合的二聚體(約為第199-235管，圖35)]。
為了由第62-161管的集合物中除去乙醇并濃縮SCF，繼后須使用Q-Sepharose Fast Flow離子交換樹脂(Pharmacia)。用水稀釋集合物(5升)至15.625升，使乙醇濃度約達(dá)到20%(體積/體積)。然后加入1M Tris堿(135ml)至pH8，再加入1M Tris-HCl，pH8(23.6ml)，使總Tris濃度達(dá)到10mM。進(jìn)一步加入10mM Tris-HCl，pH8(約15.5升)，至總體積為31.25升，乙醇濃度約為10%(體積/體積)。將所得材料于4℃加至用10mM Tris-HCl(pH8)平衡的Q-Sephorose Fast Flow柱(高6.5cm，直徑7cm)上，然后用2.5升柱緩沖液洗柱。加樣品和洗柱期間的流速約為5.5升/小時。為洗脫結(jié)合的SCF，以反方向通過柱泵入200mM NaCl、10mM Tris-HCl(pH8)，流速約200ml/小時。各管約收集12ml，并按上述280nm吸光率及SDS-PAGE法分析之。合并第16-28管(157ml)。
將含有SCF的合并物加至兩個分離的、用4℃鹽酸緩沖鹽水平衡的Sephacryls-200HR(Pharmacia)凝膠過濾柱(5×138cm)上(各加78.5ml)。以大約75ml/小時的流速收集，每管約收集15ml。各層析柱上，根據(jù)280nm吸光率洗脫的主峰各管大致相當(dāng)于1370至1635ml的洗脫體積。將兩個柱上相當(dāng)于吸收峰的各管合并，約得到525ml集合物，其中約含有2.3g SCF。使用Millipore Millipak 20膜性濾筒過濾除菌。
另外，也可在過濾除菌前超濾濃縮并滲析緩沖液交換C4柱洗脫的材料。
分離的重組人SCF1-164材料是高純度的(對SDS-PAGE膠塊作銀染色證明純度＞98%)，并可看作是醫(yī)藥級的。使用實(shí)施例2中所述方法，發(fā)現(xiàn)該材料的氨基酸組成與根據(jù)SCF基因推測者一致，并且如所期望的，其N末端氨基酸順序?yàn)镸et-Glu-Gly-Ile...，并保有由起始密碼子編碼的Met。
使用與回收在大腸桿菌中表達(dá)之人SCF1-164的相近方法，可以具有高生物學(xué)特異活性的純化狀態(tài)回收大鼠SCF1-164(發(fā)酵后也在細(xì)胞內(nèi)以不溶性形式存在)。同樣也可以回收人SCF1-183和大鼠SCF1-193。在拆迭/氧化期間，大鼠SCF1-193傾向于形成各種形式氧化的品種，而且更難于經(jīng)層析除去不需要的形式。
在回收早期階段，即溶解和拆迭/氧化階段，大鼠SCF1-193和人SCF1-183傾向于蛋白水解降解。蛋白水解作用的主要部位在殘基160和170之間?？山?jīng)適當(dāng)控制操作條件(如SCF濃度、pH值、加入2-5mM的EDTA或其他蛋白酶抑制劑)來減小蛋白水解作用，并可通過適當(dāng)?shù)姆旨壏蛛x步驟除去已存在的部分降解物。
雖然較好方案是，在拆迭/氧化期間使用尿素溶解(如前所述)，但也可以有效地利用其他助溶劑，如鹽酸胍(如溶解期間用6M，拆迭/氧化期間用1.25M)和月桂酰肌氨酸鈉。拆迭/氧化后除去所用試劑，繼之可使用適當(dāng)分離步驟回收經(jīng)SDS-PAGE證實(shí)的純化之SCF。
此外，雖然拆迭/氧化期間使用1mM谷胱甘肽是一優(yōu)選方案，但也可以利用具有相同或相近效果的其他條件。例如，這些條件包括用2mM谷胱甘肽加0.2mM氧化態(tài)谷胱甘肽，或4mM谷胱甘肽加0.4mM氧化態(tài)谷胱甘肽，或用1mM2-巰基乙醇或其他硫醇試劑代替1mM谷胱甘肽。
除上述層析方法外，用于回收純化之活性SCF的其他方法包括疏水相互作用層析法[如使用苯基-Sepharose(Pharmacia)，于1.7M硫酸銨存在下，中性pH時加樣，并用降低硫酸銨的梯度洗脫]、固相化金屬親合層析法[如使用帶有Cu2+離子的螯合-Sepharose(Pharmacia)，在接近中性pH并存在1mM咪唑的條件下加樣，并用增加咪唑的梯度洗脫]、羥基磷灰石層析[在中性pH和1mM磷酸鹽存在下加樣，并用增加磷酸鹽的梯度洗脫]，以及其他本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法。
也可以在大腸桿菌中表達(dá)相當(dāng)于由圖42中氨基酸1-248編碼的全部或部分開放讀碼，或相當(dāng)于由可能存在之切接mRNA編碼的開放讀碼(如由圖44中cDNA順序代表者)的其他形式的人SCF，并按本實(shí)施例中所述的相似方法或其他本領(lǐng)域已知方法以純化形式回收之。
包括如實(shí)施例16所述之所謂跨膜區(qū)的其他形式SCF的純化和配制方法，可涉及利用去污劑(包括非離子型去污劑)和脂質(zhì)(包括含磷脂的脂質(zhì)體結(jié)構(gòu))。
實(shí)施例11來自哺乳動物細(xì)胞的重組SCFA.發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)生SCF的CHO細(xì)胞在20升灌注培養(yǎng)系統(tǒng)中，在微載體上培養(yǎng)重組的中國倉鼠卵(CHO)細(xì)胞(CHOpDSRα2 hSCF1-162細(xì)胞株)以產(chǎn)生人SCF1-162。其發(fā)酵器系統(tǒng)與培養(yǎng)BRL3A細(xì)胞(實(shí)施例1B)所用者相似，不同的是用于培養(yǎng)CHO細(xì)胞的生長培養(yǎng)基是Dulbecco氏改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)與Ham氏F-12營養(yǎng)混合物以1∶1比例混合的混合培養(yǎng)基(GIBCO)，其中添加了2mM谷氨酸胺、非必需氨基酸(用1∶100稀釋的Gibco＃320-1140使已有濃度加倍)及5%胎牛血清。除去掉血清外，收獲培養(yǎng)基完全相同。用生長于兩個3升轉(zhuǎn)瓶中的5.6×109個CHO細(xì)胞接種反應(yīng)器。使細(xì)胞生長至濃度為4×105細(xì)胞/ml。此時將100g預(yù)滅菌的cytodex-2微載體(pharmacia)作為3升在磷酸鹽緩沖鹽水中的懸液，加到反應(yīng)器內(nèi)。使細(xì)胞接觸微載體并在其上生長4天?？筛鶕?jù)葡萄糖消耗情況，通過反應(yīng)器灌注生長培養(yǎng)基。葡萄糖濃度維持在大約2.0g/L。四天后向反應(yīng)器內(nèi)加入六倍體積的無血清培養(yǎng)基，以除去大部分血清(蛋白質(zhì)濃度＜50μg/ml)。然后不連續(xù)分批工作，直到葡萄糖濃度降至2g/L以下。從該點(diǎn)之后，反應(yīng)器以大約20升/天的連續(xù)灌注速率進(jìn)行工作。調(diào)整CO2流速使培養(yǎng)物的pH保持在6.9±0.3。必要時經(jīng)補(bǔ)充純氧以使溶解氧保持在20%空氣飽和度。溫度保持在37±0.5℃。
由上述體系中約產(chǎn)生450升無血清條件培養(yǎng)基，并用作純化重組人SCF1-162的起始材料。
使用細(xì)胞株CHO pDSRα2 rSCF1-162，也可按相似方式產(chǎn)生約589升無血清條件培養(yǎng)基，并用作純化大鼠SCF1-162的起始材料。
B.純化重組哺乳動物細(xì)胞表達(dá)的大鼠SCF1-162除特別指出者外，所有純化工作均在4℃下進(jìn)行。
1.濃縮和透濾(diafiltration)通過0.45μ Sartocapsules(Sartorius)過濾以澄清上文A部分所述無血清培養(yǎng)細(xì)胞株CHO pDSRα2大鼠SCF1-162所產(chǎn)生的條件培養(yǎng)基。對幾批材料(36升、101升、102升、200升和150升)分別進(jìn)行濃縮和透濾/緩沖液交換。下面以36升批份為例說明操作方法。使用有3個截留分子量為10，000之醋酸纖維素膜卡盒的Millipore Pellicon正切流動超濾裝置，將過濾的條件培養(yǎng)基濃縮至大約500ml(總膜面積15ft2，泵速～2，200ml/min，過濾速度～750ml/min)。然后向濃縮物內(nèi)加入1000ml10mM Tris-HCl(pH6.7-6.8)、再使用正切流動超濾裝置濃縮至500ml，并如此再重復(fù)5次，以完成陰離子交換層析制備中的滲濾/緩沖液交換。最后回收的濃縮/滲濾之制劑體積為1000ml。受到濃縮和透濾/緩沖液交換之各批條件培養(yǎng)基的行為均相似。按Bradford方法[Anal.Bioch.，72，248-254(1976)]，用牛血清白蛋白作標(biāo)準(zhǔn)品測得各批份的蛋白質(zhì)濃度為70-90μg/ml。用于該制備之條件培養(yǎng)基的總體積約為589升。
2.Q-Sepharose Fast Flow陰離子交換層析合并按上述方法由5批條件培養(yǎng)基濃縮/透濾的制劑(總體積5，000ml)。加入1M HCl將pH調(diào)到6.75。使用2000ml 10mM Tris-HCl(pH6.7)，使導(dǎo)電率達(dá)到約0.700mmho。將該制劑加到已用10mM Tris-HCl(pH6.7緩沖液)平衡的Q-Sepharose Fast Flow陰離子交換柱(36×14cm;Pharmacia Q-Sepharose Fast Flow樹脂)上。加樣后，用28，700ml Tris緩沖液洗柱;再用23，000ml5mM醋酸/1mM甘氨酸/6M尿素/20μM CuSO4(約pH4.5)洗柱;然后用10mM Tris-HCl、20μM CuSO4、pH6.7緩沖液洗柱，使pH回復(fù)到中性并除去尿素，再加以鹽梯度(0-700mM NaCl在10mM Tris-HCl、20μM CuSO4，pH6.7緩沖液中;總體積40升)。以大約3，250ml/小時的流速，按每部分490ml收集。層析圖形如圖36所示?！癕C/9cpm”是指MC/9檢測中的生物學(xué)活性;所指示各部份每份檢測5μl。圖中未顯示加樣和洗柱期間收集的洗脫物;在這些部分中測不出生物學(xué)活性。
3.使用硅結(jié)合的碳?xì)浠衔飿渲瑢游龊喜D36中所示的第44-66部分(11200ml)，并加入EDTA到終濃度為1mM。將該材料以大約2000ml/小時的流速加到用緩沖液A(10mM Tris，pH6.7/20%乙醇)平衡的C4柱(Vydac Proteins C4;7×8cm)上。加樣后用1000ml緩沖液A洗柱。然后加以從緩沖液A到緩沖液B(10mM Tris，pH6.7/94%乙醇)的線性梯度(總體積6000ml)，并按30-50ml分段收集。在制備進(jìn)行生物學(xué)分析的制劑時，除0.5ml等分梯度洗脫部分外，C4柱起始樣品、過柱集合物和洗滌集合物均對磷酸鹽緩沖鹽水透析。用MC/9檢測法檢測上述各部分(5μl等份的梯度洗脫部份;cpm數(shù)示于圖37中)。圖38顯示了各部分之等分樣品的SDS-PAGE[Laemmli，Nature 227，680-685(1970);堆積膠含有4%(W/V)丙烯酰胺，分離膠含有12.5%(W/V)丙烯酰胺]結(jié)果。所示各凝膠均于真空下干燥等分樣品(100μl)，然后用20μl樣品處理緩沖液重新溶解(還原，即用2-巰基乙醇)并在加到凝膠上之前煮沸5分鐘。圖左側(cè)的編號標(biāo)志代表分子量標(biāo)志物(還原的)的遷移位置(同圖6)。編號泳道代表加最后一部分梯度洗脫液時收集的相應(yīng)部分。對凝膠進(jìn)行銀染色[Morrissey，Anal.Bioch，117，307-310(1981)]。
4.Q-Sepharose Fast How陰離子交換層析合并由圖37中所示C4柱上收集的第98-124部分(管)(1050ml)。用10mM Tris，pH6.7緩沖液按1∶1稀釋合并的洗脫物，以降低乙醇濃度。然后將稀釋的集合洗脫物加至已用10mM Tris-HCl(pH6.7)緩沖液平衡的Q-Sepharose Fast Flow陰離子交換柱(3.2×3cm，Phrmacia Q-Sepharose Fast Flow樹脂)上。流速為463ml/小時。上樣后用135ml柱緩沖液洗柱并用10mM Tris-HCl、350mM NaCl(pH6.7)洗脫結(jié)合的材料。倒轉(zhuǎn)柱內(nèi)的流動方向以減小被洗脫物的體積，并在洗脫時收集到7.8ml洗脫部分。
5.Sephacryl S-200HR凝膠過濾層析合并鹽洗脫Q-Sepharose Fast Flow陰離子交換柱得到的含被洗脫蛋白質(zhì)的各部分(31ml)。將30ml洗脫物加到在磷酸鹽緩沖鹽水中平衡的Sephacryl S-200HR(Pharmacia)凝膠過濾柱(5×55.5cm)上。以68ml/小時的流速收集6.8ml部分。合并相當(dāng)于280nm吸光率峰值的各部分，即為最后純化的材料。
該純化過程的總結(jié)示于表15中。
表15對哺乳動物細(xì)胞表達(dá)之大鼠SCF1-162純化過程的總結(jié)步驟體積(ml) 總蛋白(mg)＊條件培養(yǎng)基(濃縮的) 7，000 28，420Q-Sepharose Fast Flow 11，200 974C4樹脂 1，050 19Q-Sepharose Fast Flow 31 20Sephacryl S-200HR 82 19＊＊＊用Bradford方法(文獻(xiàn)同上，1976)測定。
＊＊使用與實(shí)施例2中所述者相似的方法，經(jīng)定量氨基酸分析測定為47.3mg。
用實(shí)施例2所述方法測定純大鼠SCF1-162之N末端氨基酸順序大約一半是Gln-Glu-Ile…，一半是pyroGlu-Glu-Ile…。這一結(jié)果表明大鼠SCF1-162是在圖14C中所示殘基(-1)(Thr)和(+1)(Gln)之間蛋白水解加工/裂解的產(chǎn)物。相似地，由轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞條件培養(yǎng)基純化者(下方)具有N末端氨基酸順序Glu-Gly-Ile，此表明其為在圖15C所示殘基序號(-1)(Thr)和(+1)(Glu)之間加工/裂解的產(chǎn)物。
使用上述方法，可產(chǎn)生在CHO細(xì)胞內(nèi)表達(dá)之重組形式的或天然衍生的純化人SCF蛋白。
適用于純化哺乳動物細(xì)胞衍生之重組SCF的其他純化方法包括實(shí)施例1和10中所述者，以及本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其他方法。
也可以在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)相當(dāng)于由圖42所示氨基酸1-248編碼的全部或部分開放讀碼，或相當(dāng)于由可能存在之裂接mRNA編碼之開放讀碼(如由圖44中cDNA順序代表者)的其他形式的人SCF，并可按與該實(shí)施例中所述相似的方法，或其他本領(lǐng)域已知的方法，以純化的形式回收之。
C.SDS-PAGE的糖苷酶處理圖39中顯示了合并的Sephacryl S-200HR凝膠過濾柱洗脫部分的SDS-PAGE結(jié)果。裝柱量為2.5μl集合物(泳道1)。該泳道是經(jīng)過銀染色的。分子量標(biāo)志物(泳道6)同圖6所示。上方不同的遷移材料和稍下方分子量31，000標(biāo)志物位置代表了生物學(xué)活性材料;這種靜觀異源性在很大程度上是由于糖基化作用的異源性。
為鑒定糖基化作用的特征，對純化的材料用各種糖苷酶處理、用SDS-PAGE法分析(還原條件)并經(jīng)銀染色作肉眼觀察。結(jié)果示于圖39中。泳道2，神經(jīng)氨酸酶;泳道3，神經(jīng)氨酸酶和O-聚糖酶;泳道4，神經(jīng)氨酸酶、O-聚糖酶和N-聚糖酶;泳道5，神經(jīng)氨酸酶和N-聚糖酶;泳道7，N-聚糖酶;泳道8，N-聚糖酶(沒有底物);泳道9，O-聚糖酶(沒有底物)。條件是加10mM3-[(3-乙醇氨基丙基)二甲基氨]-1-磺酸丙酯(CHAPS)、66.6mM2-巰基乙醇、0.04%(W/V)疊氮鈉、磷酸鹽緩沖鹽水，37℃保溫30分鐘，然后在糖苷酶存在下，加入所述濃度的一半37℃保溫18小時。所用神經(jīng)氨酸酶(得自Arthrobacter ureafaciens，由Calbiochem公司提供)濃度為0.5單位/ml，O-聚糖酶(Genzyme;內(nèi)-α-N-乙?；?氨基半乳糖苷酶)濃度為7.5毫單位/ml，N-聚糖酶(Genzyme;肽N-糖苷酶F;肽-N4[N-乙酰基-β-葡糖胺基]天冬酰胺酶)濃度為10單位/ml。
可根據(jù)需要進(jìn)行各種對照保溫?？杉犹擒彰副?，以證實(shí)所得結(jié)果系由于加入了糖苷酶制劑所加致;入已知為糖苷酶底物的糖基化蛋白質(zhì)(如糖基化重組人促紅細(xì)胞生成素)保溫，以證實(shí)所用糖苷酶是有活性的;加糖苷酶而不加底物保溫，以判定糖苷酶制劑呈現(xiàn)或掩敝可見的凝膠帶(圖39，泳道8和9)。
由上述實(shí)驗(yàn)可得出多個結(jié)論。用N-聚糖酶[其可除去復(fù)合物及高甘露糖N連接的碳水化合物(Tarentino et al.，Biochemistry 24，4665-4671(1988)]、神經(jīng)氨酸酶(其可可除去唾液酸殘留物)、及O-聚糖酶(其可除去某些O連接的碳水化合物(Lambin et al.，Biochem.，Soc.Trans.12，599-600(1984)]所作各種處理提示存在N連接的和O連接的碳水化合物，且存在唾液酸，同時至少有些是O連接之部分的一部分。事實(shí)上用N-聚糖酶處理可以將經(jīng)過SDS-PAGE分析顯現(xiàn)的異質(zhì)性材料轉(zhuǎn)化為較快速遷移的形式，后者同源性更好表明所有材料均代表同一種多肽，且這種異質(zhì)性主要是因糖基化作用的異質(zhì)性所致。
實(shí)施例12重組SCF1-164PEG的制備用按照實(shí)施例6A和10所述方法由重組大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)純化的大鼠SCF1-164作為進(jìn)行下述聚乙二醇修飾的起始材料。
將溶于0.327ml去離子水中的聚乙二醇-琥珀酰亞氨基-琥珀酸甲氧酯(18.1mg＝3.63μmol;SS-MPEG＝Sigma Chemical Co.no.M3152，分子量～5，000)加至溶于1.0ml138mM磷酸鈉、62mM NaCl、0.62mM乙酸鈉(pH8.0)中的13.3mg(0.727μmol)重組大鼠SCF1-164內(nèi)。室溫下將所得溶液輕輕搖動(100rpm)30分鐘。然后將1.0ml等分的最終反應(yīng)混合物(10mg蛋白質(zhì))加到Pharmacia Superdex 75凝膠過濾柱(1.6×50cm)上，并于室溫下用100mM磷酸鈉(pH6.9)以0.25ml/分鐘的速率洗脫。棄去前10ml柱洗脫物，然后以每管1.0ml收集。連續(xù)監(jiān)測柱洗脫物的UV吸光率(280nm)，結(jié)果如圖40A所示。合并第25至27管，通過0.2μ聚砜膜(Gelman Sciences no.4454)超濾除菌并將所得物定名為PEG-25。同樣地合并第28至32管內(nèi)容物，超濾除菌并定名為PEG-32。根據(jù)1.0mg/ml未修飾大鼠SCF1-164溶液的吸光率為0.66，由A280測定結(jié)果算出合并的PEG-25部分含有3.06mg蛋白質(zhì)，且合并的PEG-32部分含有3.55mg蛋白質(zhì)。在第34至37管中洗脫得到占反應(yīng)混合物內(nèi)總蛋白11.8%的未處理的大鼠SCF1-164。于相似的層析條件下，洗脫出未經(jīng)修飾的大鼠SCF1-164，其為一個滯留體積45.6ml的主峰(圖40B)。第77至80管(圖40A)含有N-羥基琥珀酰亞胺，其為大鼠SCF1-164與SS-MPEG反應(yīng)的付產(chǎn)物。
大鼠SCF1-164中的潛在反應(yīng)性氨基基團(tuán)包括12個賴氨酸殘基和N末端谷氨酰胺殘基的α氨基基團(tuán)。按Habeeb所述方法[Anal.Biochem.14∶328-336(1966)]，用三硝基苯磺酸(TNBS)作分光光度滴定，測得合并的PEG-25部分內(nèi)每摩爾蛋白質(zhì)含9.3mol反應(yīng)性氨基基團(tuán)。同樣，合并的PEG-32部分每摩爾蛋白質(zhì)含有10.4mol反應(yīng)性氨基基團(tuán)，且未修飾的大鼠SCF1-164含有13.7mol反應(yīng)性氨基基團(tuán)?？梢?，合并的PEG-32部分內(nèi)平均有3.3(13.7減10.4)個大鼠SCF1-164的氨基基團(tuán)經(jīng)與SS-MPEG反應(yīng)而受到修飾。相似地，合并的PEG-25部分中則平均有4.4個大鼠SCF1-164的氨基基團(tuán)被修飾。也使用上述方法對實(shí)施例10中產(chǎn)生的人SCF(hSCF1-164)作了修飾。具體地說是使714mg(38.5μmol)hSCF1-164與溶于75ml0.1M磷酸鈉緩沖液(pH8.0)的962.5mg(192.5μmol)SS-MPEG室溫下反應(yīng)30分鐘。將該反應(yīng)混合物加到Sephacryl S-200 HR柱(5×134cm)上并用PBS(沒有CaCl2和MgCl2的Gibco Dulbecco′s磷酸鹽緩沖鹽水)以102ml/小時的流率洗脫，然后以每管14.3ml收集。將相似于上述PEG-25集合物(圖40A)的第39-53管合并，發(fā)現(xiàn)其中共含有354mg蛋白質(zhì)。圖8C中顯示了該經(jīng)過修飾的靈長目動物SCF的體內(nèi)活性。
實(shí)施例13白血病母細(xì)胞上的SCF受體表達(dá)由混合譜系白血病病人的外周血中收獲白血病母細(xì)胞。用密度梯度離心法純化細(xì)胞并除去粘附。按實(shí)施例7中所述方法碘化人SCF1-164。按已述方法[Broudy，Blood，75，1622-1626(1990)]將細(xì)胞與不同濃度碘化的SCF一起保溫。該受體結(jié)合實(shí)驗(yàn)的結(jié)果示于圖41中。估計(jì)受體密度約為70，000個受體/細(xì)胞。
實(shí)施例14大鼠SCF對早期淋巴樣前體細(xì)胞的活性在小鼠骨髓的瓊脂膠培養(yǎng)物中研究了重組體大鼠SCF1-164(rrSCF1-164)與IL-7協(xié)同作用以提高淋巴樣細(xì)胞增殖的能力。該試驗(yàn)中，只加rrSCF1-164所形成的集落含有單核細(xì)胞、嗜中性白細(xì)胞和母細(xì)胞，而單用IL-7或與rrSCF1-164聯(lián)合刺激的集落則主要含有前B細(xì)胞。使用熒光標(biāo)記的抗B220抗原[Coffman，Immunol.Rev.，69，5(1982)〕和抗表面Ig(FITC-羊抗-K，Southern Biotechnology Assoc.，Birmingham，AL)抗體對合并的細(xì)胞進(jìn)行FACS分析，鑒定特征為B220+、sIg-、Cu+的前B細(xì)胞;并使用熒光標(biāo)記的抗體(TRITC-羊抗-μ，Southern Biotechnology Assoc.，)對胞漿μ表達(dá)進(jìn)行Cytospin玻片分析。重組人IL-7(rhIL-7)得自Biosource International(Westlake Village，CA)。當(dāng)將rrSCF1-164與前B細(xì)胞生長因子結(jié)合加入時，可觀察到其對集落形成有協(xié)同促進(jìn)作用(表16)，進(jìn)而表明rrSCF1-164對早期B細(xì)胞的祖細(xì)胞有刺激作用。
表16rrSCF1-164與hIL-7對前B細(xì)胞集落形成的刺激作用生長因子集落數(shù)1鹽水 0rrSCF1-164200ng 13±2100ng 7±450ng 4±2rhIL-7 200ng 21±6100ng 18±650ng 13±625ng 4±2rhIL-7 200ng+rrSCF1-164200ng 60±0100ng+200ng 48±850ng+200ng 24±1025ng+200ng 21±21 每5×104個鋪板的小鼠骨髓細(xì)胞形成的集落數(shù)。
各數(shù)值均為三份重復(fù)樣品的平均值±SD。
實(shí)施例15SCF受體的鑒定A.C-kit是SCF1-164的受體為試驗(yàn)SCF1-164是否為C-kit的配體，使用得自SCF1-164反應(yīng)性肥大細(xì)胞系MC/9[Nabel et al.，Nature 291，332-334(1981)的DNA與根據(jù)已公開之順序設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，以擴(kuò)增整個小鼠C-kit[Qiu et al，EMBO J.7，1003-1011(1988)〕的cDNA。使用相似技術(shù)克隆來自人紅白血病細(xì)胞系HEL[Martin and Papayannopoulou，Science，216，1233-1235(1982)]，由氨基酸1-549編碼的人c-kit的配基結(jié)合和跨膜區(qū)域[Yarden et al.，EMBO J.，6，3341-3351(1987)]。將c-kit cDNA插入轉(zhuǎn)染到COS-1細(xì)胞內(nèi)的哺乳動物表達(dá)載體V19.8中，并按照下文B和C部分所述的方法，制備使用大鼠或人125I-SCF1-164進(jìn)行結(jié)合試驗(yàn)的膜材料。表17顯示了典型結(jié)合試驗(yàn)的數(shù)據(jù)。其中未測知125I人SCF1-164能特異地結(jié)合到只用V19.8轉(zhuǎn)染的COS-1細(xì)胞上。但表達(dá)人重組C-kit配基結(jié)合加跨膜區(qū)(hckit-LTI)的COS-1細(xì)胞則結(jié)合了125I-hSCF1-164(表17)。加入200倍摩爾過量的未標(biāo)記人SCF1-164可降低結(jié)合至本底水平。相似地，用全長小鼠-c-kit(mckit-L1)轉(zhuǎn)染的COS-1細(xì)胞可與大鼠125I-SCF1-164結(jié)合。在只用V19.8轉(zhuǎn)染的COS-1細(xì)胞中可檢測到小量大鼠125I-SCF1-164結(jié)合，而且也已在未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中觀察到相似結(jié)果(未示出)，此表明COS-1細(xì)胞可表達(dá)內(nèi)源性c-kit。這一發(fā)現(xiàn)是與c-kit表達(dá)的廣泛細(xì)胞分布相一致的。大鼠125I-SCF1-164可相似地與人和小鼠c-kit結(jié)合，而人125I-SCF1-164則以較低活性與小鼠c-kit結(jié)合(表17)。這一數(shù)據(jù)符合于種間SCF1-164交叉反應(yīng)性的特征。大鼠SCF1-164可誘導(dǎo)人骨髓的增殖，其比活性相似于人SCF1-164;而人SCF1-164則可誘導(dǎo)小鼠肥大細(xì)胞的增殖，其比活性比大鼠蛋白質(zhì)小800倍。
總之，這些發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步證實(shí)由W或S1突變小鼠表達(dá)的表型異常是c-kit受體/配基相互作用之基本缺陷的結(jié)果，而這些對于各種各樣細(xì)胞型的發(fā)育都是很關(guān)鍵的。
表17SCF1-164與COS-1細(xì)胞內(nèi)表達(dá)之重組c-kit的結(jié)合轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒結(jié)合的CPMa人SCF1-164大鼠SCF1-164125I-SCFb125I-SCF+Coldc125I-SCFd125I-SCF+ColdeV19.8 2，160 2，150 1，100 550V19.8hckit-LT1 59，350 2，380 70，000 1，100V19.8mckit-L1 9，500 1，100 52，700 600a.顯示重復(fù)測定的平均值;已獨(dú)立完成實(shí)驗(yàn)，且三次結(jié)果均相似。
b.1.6nM人125I-SCF1-164c.1.6nM人125I-SCF1-164+320nM未標(biāo)記的人SCF1-164d.1.6nM大鼠125I-SCF1-164e.1.6nM大鼠125I-SCF1-164+320nM未標(biāo)記的大鼠SCF1-164B.COS-1細(xì)胞中重組c-kit的表達(dá)分別由人紅白血病細(xì)胞系HEL和MC/9細(xì)胞中經(jīng)酸性苯酚/氯仿提取法[Chomczynsky and Sacchi，Anal.Biochem.，162，156-159(1987)]分離總RNA，然后用PCR技術(shù)[Saiki et al.，Science，239，487-491(1988)]從中分別得到人和小鼠c-kitcDNA克隆。根據(jù)已公開的人和小鼠c-kit順序設(shè)計(jì)有獨(dú)特順序的寡核苷酸。使用c-kit反義寡核苷酸作引物，依照已述使用酶，Mo-MLV反向轉(zhuǎn)錄酶(Bethesda Research Laboratories，Bethesda，MD)的方法由總RNA合成第一股cDNA。使用適當(dāng)?shù)腸-kit引物對，擴(kuò)增c-kit配基結(jié)合區(qū)和酪氨酸激酶區(qū)的交迭區(qū)域。將這些區(qū)域克隆到適于在COS-1細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的哺乳動物表達(dá)載體V19.8中(圖17)。對幾個克隆的順序分析結(jié)果表明，RCR擴(kuò)增期間各克隆可能產(chǎn)生獨(dú)立突變。通過裝配來自分立之克隆的非突變限制片段，而構(gòu)建成一個沒有這些突變的克隆。在所有或大約一半的克隆中，出現(xiàn)了不同于已公開之順序的某些差異，這些可能是所用細(xì)胞系內(nèi)存在的真正順序差異，并可能代表了不同于已公開順序的等位基因差異。在V19.8中構(gòu)建了下列質(zhì)粒V19.8mckit-LT1，其為完整的小鼠c-kit;以及V19.8hckit-L1，其含有人c-kit的配基結(jié)合加跨膜區(qū)(氨基酸1-549)。
大致按實(shí)施例4中所述方法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到COS-1細(xì)胞中。
C.125I-SCF1-164與表達(dá)重組c-kit之COS-1細(xì)胞的結(jié)合轉(zhuǎn)染兩天后，從培養(yǎng)皿上刮下COS-1細(xì)胞，在PBS中洗滌并冷凍備用。熔融后，將細(xì)胞懸浮在含有1mM PMSF、100μg/ml aprotinin、25ug/ml抑酶醛肽、2μg/ml抑胃肽和200μg/ml TLCK-HCl的10mM Tris-HCl、1mM MgCl2中。用吸管吸入并滴下5次以使懸液分散均勻，在冰上保溫15分鐘，然后用Dounce勻漿器上下往復(fù)15-20次將細(xì)胞制成勻漿。向勻漿液內(nèi)加入蔗糖(250mM)，并離心(500g，5分鐘)沉淀出核和殘留未破碎的細(xì)胞。再以25，000g離心(4℃)30分鐘進(jìn)一步除去殘留的細(xì)胞碎片。使用氯胺T法[Hunter and Greenwood，Nature，194，495-496(1962)]以放射性碘標(biāo)記人和大鼠SCF1-164。在含有RPMI培養(yǎng)基并添加1%牛血清白蛋白和50mM HEPES(pH7.4)的結(jié)合緩沖液中，加或不加200倍過量(摩爾量)的未標(biāo)記SCF1-164，使COS-1細(xì)胞膜部分與人或大鼠125I-SCF1-164(1.6nM)于22℃下一起保溫1小時。在結(jié)合保溫終止時，將膜制劑輕輕鋪敷在150μl鄰苯二甲酸酯油上，并在Beckman微量離心管11中離心20分鐘，直到由游離125I-SCF1-164中分離出膜結(jié)合的125I-SCF1-164。剪除沉淀碎片并測定膜結(jié)合的125I-SCF1-164。
實(shí)施例16分離人SCF cDNAA.HT-1080 cDNA文庫的構(gòu)建用酸式硫氰酸鈲-苯酚-氯仿提取法[Chomczynski et al.，Anal.Biochem.162，156(1987)]由人纖維肉瘤細(xì)胞系HT-1080(ATCC CCL121)中分離總RNA，并使用購自Clontech公司的Oligo(dT)柱回收poly(A)RNA。在提供者推薦的條件下，用BRL(Bethesda Research Laboratory)cDNA合成試劑盒由2μg poly(A)RNA制備雙鏈cDNA。將大約100ng平均大小約2kb的柱分離之雙鏈cDNA連接到300ng SalI/NotI消化的載體pSPORT 1[D′Alessio et al.，F(xiàn)ocus，12，47-50(1990)]上，并用電穿孔法[Dower et al.，Nucl.Acids Res.，16，6127-6145(1988)]轉(zhuǎn)化到DH5α(BRL，Bethesda，MD)細(xì)胞中。
B.cDNA文庫的篩選將大約2.2×105個初級轉(zhuǎn)化體分成44份，各含有～5000個克隆。用已述的CTAB-DNA沉淀法[Del Sal et al.，Biotechniques，7，514-519(1989)]由各份集合物中制備質(zhì)粒DNA。由各質(zhì)粒DNA池中各取2μg用限制酶NotI消化并經(jīng)凝膠電泳分離之。將線性化DNA轉(zhuǎn)移到Gene Screen Plus膜(DuPont)上，在前述條件下[Lin et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，7580-7584(1985)]與32P標(biāo)記的PCR產(chǎn)生的人SCF cDNA(實(shí)施例3)雜交。根據(jù)雜交結(jié)果鑒定出三個含陽性信號的集合物。以集落雜交法[Lin et al.，Gene，44，201-209(1986)]再次篩選這些集落集合物，直至由其中各自得到單個集落。這三個分別克隆之cDNA的大小約在5.0到5.4kb之間。對5′末端所作限制酶消化和核苷酸順序測定的結(jié)果表明，其中有兩個克隆是相同的(10-1a和21-7a)。它們均含有編碼區(qū)和大約200bp的5′非翻譯區(qū)(5′UTR)。第三個克隆(26-1a)5′端約比另外兩個克隆短400bp。該人SCF cDNA的順序示于圖42中。應(yīng)特別提到的是，疏水跨膜區(qū)順序由氨基酸186-190的區(qū)域開始并終止在氨基酸212處。
C.pDSRα2 hSCF1-248的構(gòu)建按下述方法使用質(zhì)粒10-1a(見實(shí)施例16B)和pGEM3hSCF1-164制得pDSRα2 hSCF1-248將得自pGEM3hSCF1-164的HindⅢ插入段轉(zhuǎn)移到M13mp18上。使用反義寡核苷酸
5′-TCT TCT TCA TGG CGG CGG CAA GCT T 3′和購自Amersham公司的寡核苷酸指導(dǎo)的體外誘變系統(tǒng)試劑盒及操作程序，經(jīng)定點(diǎn)誘變將ATG起始密碼子相連的上游核苷酸由tttccttATG改變?yōu)間ccgccgccATG，以產(chǎn)生M13mp18hSCFK1-164。用HindⅢ消化該DNA并插入已用HindⅢ消化的pDSRα2中。該克隆被稱為pDSRα2hscFK1-164。用XbaI消化pDRα2hSCFK1-164的DNA并加入Klenow酶和四種dNTP將此DNA修成平頭。該反應(yīng)終止后，進(jìn)一步用SpeI酶消化之。用DraI消化克隆10-1a以在插入段內(nèi)產(chǎn)生3′端至開放讀碼的平頭，同時用可在pDSRα2 hSCFK1-164和10-1a之基因內(nèi)同一位點(diǎn)切割的SpeI酶消化之。將這些DNA連接在一起，以得到pDSRα2 hSCFK1-248。
D.用pDSRα2 hSCFK1-248DNA轉(zhuǎn)染并免疫沉淀COS細(xì)胞用如上構(gòu)建的DNA轉(zhuǎn)染COS-7(ATCC CRL1651)細(xì)胞。用10μg pDSRα2 hSCFK1-248DNA或10μg pDSRα2載體DNA(載體對照)以1600V對0.8mlDMEM+5%FBS中的4×106個細(xì)胞進(jìn)行電穿孔。電穿孔后，將細(xì)胞重新鋪敷在兩個60mm培養(yǎng)皿中。24小時后更換新鮮培養(yǎng)基。
轉(zhuǎn)染72小時后，按照改良的Yarden等人的方法(PNAS，87，2569-2573，1990)用35S-培養(yǎng)基標(biāo)記各培養(yǎng)皿。用PBS洗細(xì)胞(一次)，然后加入無蛋氨酸、無半胱氨酸DMEM(met-cys-DMEM)保溫30分鐘。除去培養(yǎng)基后向各平皿內(nèi)加入1ml含100μCi/ml Tran35S標(biāo)記(ICN)的met-cys-DMEM。于37℃下保溫8小時。收獲培養(yǎng)基，離心除去細(xì)胞碎片并于-20℃下冷凍保存。
按照Yarden等人改良的方法(EMBO，J.，6，3341-3351，1987)，將COS/pDSRα2 hSCFK1-248和COS/pDSRα2載體對照的標(biāo)記的條件培養(yǎng)基等分樣品與35S-標(biāo)記的CHO/pDSRα2 hSCF1-164克隆17細(xì)胞(見實(shí)施例5)一起進(jìn)行免疫沉淀。用10μl預(yù)免疫兔血清(＃1379P.I.)處理各1ml條件培養(yǎng)基樣品。樣品于4℃下保溫5小時。向各管內(nèi)加入100微升在0.15M NaCl、20mM Tris(pH7.5)、0.2%Triton X-100中的金黃色葡萄球菌(Pansor-bin，Calbiochem.)的10%懸浮液。樣品于4℃下繼續(xù)保溫1小時。以13，000g離心5分鐘以沉淀免疫復(fù)合物。將上清移入新的試管中，并與5μl實(shí)施例11中純化的、抗CHO衍生之hSCF1-162的兔多克隆抗血清4℃下保溫過夜。加入100μl Pansorbin保溫1小時，并按前述方法沉淀免疫復(fù)合物。沉淀物用溶解緩沖液(0.5%脫氧膽酸鈉、0.5%NP40、50mM NaCl、25mM Tris，pH8)洗1次，用洗滌緩沖液(0.5M NaCl、20mM Tris pH7.5、0.2% Triton X-100)洗3次，再用20mM Tris(pH7.5)洗1次。然后懸浮于50μl 10mM Tris pH7.5、0.1%SDS、0.1M β-巰基乙醇中。經(jīng)煮沸5分鐘洗提SCF蛋白。樣品以13，000g離心5分鐘，然后回收上清液。
按下述方法完成糖苷酶處理過程向25μl免疫復(fù)合物樣品中加入3微升含1.6mU O-聚糖酶、0.5U N-聚糖酶和0.02U神經(jīng)氨酸苷酶的75mM CHAPS，并于37℃下保溫3小時。加入等體積2×PAGE樣品緩沖液并將樣品煮沸3分鐘。經(jīng)消化和未經(jīng)消化的樣品均在15%SDS聚丙烯酰胺還原凝膠上以8mA電泳過夜。在甲醇-乙酸中固定凝膠，用Enlightening增強(qiáng)劑(NEN)處理30分鐘、干燥并于-70℃下與Kodok XAR-5膠片接觸曝光。
圖43顯示所得的放射自顯影圖譜。泳道1和2是對照COS/pDSRα2培養(yǎng)物樣品;泳道3和4得自COS/pSRα2hSCFK1-248;泳道5和6得自CHO/pDSRα2 hSCF1-164。泳道1、3和5是未經(jīng)消化的免疫沉淀物;泳道2、4和6是已用聚糖酶消化過的(見上述)。分子量標(biāo)志物的位置示于左側(cè)。SCF在pDSRα2 hSCFK1-248轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞內(nèi)的加工非常類似于由pDSRα2 hSCF1-164轉(zhuǎn)染之CHO細(xì)胞分泌的hSCF1-164(實(shí)施例11)。這一現(xiàn)象提示由細(xì)胞釋放的SCF天然蛋白水解加工位點(diǎn)是在氨基酸164附近。
實(shí)施例17人SCF的四級結(jié)構(gòu)分析校準(zhǔn)按實(shí)施例1所述用于由BRL細(xì)胞培養(yǎng)基中純化SCF的凝膠過濾柱(ACA 54)(加有分子量標(biāo)準(zhǔn)品)，并由其他校準(zhǔn)的凝膠過濾柱洗脫純化的SCF后，可以看出由BRL細(xì)胞培養(yǎng)基純化的SCF相對于分子量標(biāo)準(zhǔn)品，表觀分子量約為70，000-90，000。反之，經(jīng)SDS-PAGE分析測得的表觀分子量約為28，000-35，000。雖然可以了解到糖基化蛋白質(zhì)在此種分析中可能有異常行為，但這些結(jié)果卻提示，在非變性條件下，BRL衍生的大鼠SCF可以作為非共價結(jié)合的二聚體存在。重組SCF形式(如由大腸桿菌產(chǎn)生的大鼠和人SCF1-164和得自CHO細(xì)胞的大鼠和人SCF1-162)也顯示相似結(jié)果，其中在非變性條件下以凝膠過濾法估計(jì)的分子大小約為在變性條件下(如存在SDS)以凝膠過濾法或特殊情況時使用SDS-PAGE法估計(jì)的分子大小的兩倍。另外用沉降速度分析法(該方法可準(zhǔn)確地測定溶液中材料的分子量)測得大腸桿菌產(chǎn)生之重組人SCF1-164的分子量約為36，000。該值仍約為SDS-PAGE測得值(約18，000～19，000)的兩倍。因此，盡管存在多種寡聚態(tài)(包括一聚態(tài))，但在一定的溶解條件下顯然以二聚態(tài)占優(yōu)勢。
實(shí)施例18分離得自5637細(xì)胞系的人SCF cDNA克隆A.5637 cDNA文庫的構(gòu)建用酸性硫氰酸鈲-苯酚-氯仿提取法[Chomczynski et al.，Anal.Biochem.，162，156(1987)]由人膀胱癌細(xì)胞系5637(ATCCHTB-9)中分離總RNA，并使用購自Clontech的Oligo(dT)柱回收poly(A)RNA。在提供者推薦的條件下用BRL cDNA合成試劑盒由2μg poly(A)RNA制備雙鏈cDNA。將經(jīng)80ng約經(jīng)柱層析分離的、平均大小為2kb的雙鏈cDNA連接到300ng SalI/NotI消化的載體pSPORT1(D′Alessio et al.，F(xiàn)ocus，12，47-50(1990)]上并用電穿孔法[Dower et al.，Nucl.Acids Res.，16，6127-6145(1988)]轉(zhuǎn)化到DH5α細(xì)胞中。
B.cDNA文庫的篩選將大約1.5×105個初級轉(zhuǎn)化體分成30份集合物，其中各約含5，000個克隆。用已述的CTAB-DNA沉淀法[Del Salet al.，Biotechniques，7，517-519(1989)]由各集合體制備質(zhì)粒DNA。各取2微克質(zhì)粒DNA用限制酶NotI消化并以凝膠電泳法分離之。將線性化的DNA轉(zhuǎn)移到Gene Screen Plus膜(DuPont)上，并于前述條件[Lin et al.，PNAS USA，82，7580-7584(1985)]下與32P標(biāo)記的得自HT1080細(xì)胞系(實(shí)施例16)的全長人SCF cDNA雜交。根據(jù)雜交結(jié)果鑒定出七份含陽性信號的集合物。用32P標(biāo)記的PCR、經(jīng)集落雜交法[Lin et al.，Gene，44，201-209(1986)]產(chǎn)生的人SCF cDNA再次篩選集落池(集合物)，直到由四個集落池中得到單個集落。這四個分離的克隆之插入段的大小約為5.3kb。對克隆之5′端所作限制酶消化及核苷酸順序分析表明，這四個克隆都是相同的。圖44中顯示了該人cDNA的順序。圖44所示cDNA編碼的多肽中，圖42所示順序的氨基酸149-177被一個Gly殘基所取代。
實(shí)施例19致死量放射線照射后SCF提高存活期的作用A.致死放射線照射后，SCF對存活期的影響試驗(yàn)了致死量放射線照射后，SCF對小鼠存活期的影響。所用小鼠為10至12周令雌性Balb/c。所有實(shí)驗(yàn)中小鼠均按5只一組，各實(shí)驗(yàn)內(nèi)所用小鼠的體重均相近。以850或950拉得(rad)為一次劑量照射小鼠。單用因子或因子加正常Balb/c骨髓細(xì)胞注射。第一種情況下，于照射后24小時給小鼠靜脈內(nèi)注射由大腸桿菌中純化并按實(shí)施例12所述加聚乙二醇修飾的大鼠PEG-SCF1-164(20μg/Kg)，或注射鹽水作為對照組。對于骨髓移植模型，則于照射后4小時注射各種細(xì)胞劑量的正常Balb/c骨髓。為了用大鼠PEG-SCF1-164處理，于注射前向細(xì)胞懸浮液內(nèi)加入200μg/Kg大鼠PEG-SCF1-164，然后再以因子加細(xì)胞作一次靜脈注射。
850拉得照射后，給小鼠注射大鼠PEG-SCF1-164或鹽水。結(jié)果如圖45所示。與對照組動物相比，注射大鼠PEG-SCF1-164可顯著延長小鼠的存活時間(P＜0.0001)。注射鹽水小鼠的平均存活7.7天，而注射大鼠PEG-SCF1-164者則平均存活9.4天(圖45)。圖45所示結(jié)果代表了對每個處理組30只小鼠，共四次實(shí)驗(yàn)的總結(jié)。
用大鼠PEG-SCF1-164處理小鼠提高了存活期，此提示SCF對被照射小鼠之骨髓細(xì)胞的影響。對這些動物之血象參數(shù)的初步研究顯示，在照射后5天時血小板水平較對照組稍有增加，而在照射后7天時則與對照組無明顯差異。已測知RBC或WBC水平或骨髓細(xì)胞活力無差異。
B.用SCF處理之接受移植小鼠的存活期將10%劑量的正常Balb/c骨髓細(xì)胞移植到經(jīng)過850拉得射線照射的小鼠體內(nèi)，結(jié)果可挽救90%或更多的動物(數(shù)據(jù)未示出)。因此使用850拉得的照射劑量和5%的移植物劑量來研究大鼠PEG-SCF1-164對存活期的影響。這一細(xì)胞劑量是可行的，這樣較大比例未接受SCF的小鼠將不能存活;如大鼠PEG-SCF1-164能刺激被移植的細(xì)胞，存活期便可增加。如圖46所示，約30%的對照組動物于照射后存活了8天。用PEG-SCF1-164處理，則使這些小鼠中95%以上的存活期顯著提高到至少30天(圖46)。圖46所示結(jié)果代表對對照組和大鼠PEG-SCF1-164處理組各20只小鼠所作的4次實(shí)驗(yàn)的總結(jié)。在使用更高照射劑量時，用大鼠PEG-SCF1-164結(jié)合骨髓移植物處理動物，也可提高存活期(圖47)。以950拉得照射并移植10%骨髓的對照組小鼠在第8天死亡，而用大鼠PEG-SCF1-164處理的小鼠約有40%存活了20天或更長。只有20%移植了20%骨髓的對照組小鼠存活20天以上，而rSCF處理組則有80%存活20天以上(圖47)。
實(shí)施例20抗SCF單克隆抗體的生產(chǎn)8周令雌性Balb/c小鼠(Charles River，Wilmington，MA)皮下注射20μg由大腸桿菌表達(dá)的人SCF1-164[在完全弗氏佐劑(H37-Ra;Difco Labaratories，Detroit，MI)中]。于第14、38和57天時將50μg同一抗原加到不完全弗氏佐劑中經(jīng)皮下給藥作加強(qiáng)免疫。未次注射后3天，殺死兩只小鼠取其脾細(xì)胞，按Nowinski等人所述方法[Virology，93，111-116(1979)]與sp2/0骨髓瘤細(xì)胞融合。
用于培養(yǎng)sp2/0和雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)基是添加20%熱失活胎牛血清(Phibro Chem.，F(xiàn)ort Lee，NJ)、110mg/ml丙酮酸鈉、100U/ml青霉素和100mcg/ml鏈霉素(Gibco)的Dulbecco氏改良的Eagle氏培養(yǎng)基(DMEM)(Gibco，Chagrin Falls，Ohio)。融合后在含有10-4M次黃嘌呤、4×10-7M氨甲嘌呤和1.6×10-5M胸苷的HAT培養(yǎng)基中培養(yǎng)2周，然后在含有次黃嘌呤和胸苷的培養(yǎng)基中培養(yǎng)2周，以選擇雜交細(xì)胞。
按下述方法篩選雜交瘤室溫下用存在于50μl50mM碳酸氫鹽緩沖液(pH9.2)中的0.25μg人SCF1-164(E.coli)致敏聚乙烯小井(Coster，Cambridge，MA)2小時，然后4℃過夜。室溫下用5%BSA(在PBS中)將培養(yǎng)板封閉30分鐘，然后在37℃下與雜交瘤培養(yǎng)物上清液保溫1小時。棄去溶液并使結(jié)合的抗體與1∶500稀釋的、結(jié)合了辣根過氧化物酶(Boehringer Mannheim Biochemi-cals，Indianapolis，IN)的羊抗小鼠IgG于37℃下保溫1小時。用洗滌溶液(KPL，Gaithersburg，MD)洗培養(yǎng)板后加H2O2和ABTS(KPL)的混合物顯色。測405nm的吸光率(比色)。
同雜交瘤篩選法一樣，用ELISA法試驗(yàn)分泌抗人SCF1-164(E.coli)特異抗體的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)物，看是否其分泌產(chǎn)物與人SCF1-162(CHO)有交叉反應(yīng)。用有限稀釋法再次克隆雜交瘤細(xì)胞。所試驗(yàn)的55個小井的雜交瘤上清液與人SCF1-164(E.coli)呈強(qiáng)陽性反應(yīng);其中有9個與人SCF1-162(CHO)有交叉反應(yīng)。
已克隆的幾株雜交瘤細(xì)胞如下所示單克隆 IgG異型與人SCF1-162(CHO)的反應(yīng)性4G12-13 IgG1無6C9A IgG1無8H7A IgG1有雜交瘤4G12-13和8H7A已于1990年9月26日寄存在ATCC。
＊ ＊ ＊雖然本發(fā)明已描述了上述優(yōu)選實(shí)施方案，但應(yīng)明確是，任何改動和變更對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說都將是顯而易見的。因此，其待批權(quán)利要求傾向于復(fù)蓋這些等效變動，且后者亦應(yīng)屬本發(fā)明之范圍內(nèi)的。
權(quán)利要求
1.一種非天然存在的多肽，該多肽足夠地重復(fù)了天然存在之干細(xì)胞因子的氨基酸順序，從而使之具有天然存在之干細(xì)胞因子的造血生物學(xué)活性。
2.一種純化的含有天然存在之干細(xì)胞因子的多肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的多肽，其中所說的多肽是原核或真核細(xì)胞表達(dá)外源DNA順序的產(chǎn)物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的多肽，其中所說的多肽是CHO細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物。
5.根據(jù)權(quán)利要求3的多肽，其中外源DNA順序是cDNA順序。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2的多肽，其中所說的干細(xì)胞因子是人干細(xì)胞因子。
7.根據(jù)權(quán)利要求3的多肽，其中外源DNA順序是基因組DNA順序。
8.根據(jù)權(quán)利要求3的多肽，其中外源DNA順序是由自主復(fù)制的DNA質(zhì)?；虿《据d體攜帶的。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的多肽，其具有圖15B、圖15C、圖42或圖44中列出之人干細(xì)胞因子的部分或全部氨基酸順序，或其任何天然存在的等位變異體。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的多肽，其具有天然存在之干細(xì)胞因子的體內(nèi)生物學(xué)活性。
11.根據(jù)權(quán)利要求1的多肽，其具有天然存在之干細(xì)胞因子的體外生物學(xué)活性。
12.根據(jù)權(quán)利要求1或2的多肽，其進(jìn)一步的特征是與可檢測的標(biāo)記物質(zhì)共價結(jié)合。
13.一種用于確保在原核或真核寄主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)多肽產(chǎn)物的分離的DNA順序，其中所說的多肽產(chǎn)物足夠地重復(fù)了天然存在之干細(xì)胞因子的氨基酸順序，從而使之具有天然存在之干細(xì)胞因子的造血生物學(xué)活性，所說的順序選自于(a)圖14B、圖14C圖15B、圖15C、圖42、圖44中列出的DNA順序，或它們的互補(bǔ)鏈;(b)與(a)中限定的DNA順序雜交的DNA順序或其片段;以及(c)如果沒有遺傳密碼的簡并性，可與(a)和(b)中限定的DNA順序雜交的DNA順序。
14.用權(quán)利要求13的DNA順序轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的原核或真核寄主細(xì)胞，所說的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染是以一種允許寄主細(xì)胞表達(dá)所說多肽產(chǎn)生的方式進(jìn)行的。
15.在原核或真核宿主細(xì)胞中表達(dá)權(quán)利要求13的DNA順序所得到的多肽產(chǎn)物。
16.編碼原核或真核寄主表達(dá)之多肽的分離的DNA順序，所說的多肽足夠地重復(fù)了天然存在之干細(xì)胞因子的氨基酸順序，從而使之具有天然存在之干細(xì)胞因子的生物學(xué)活性。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的cDNA順序。
18.權(quán)利要求權(quán)利要求16的基因組DNA順序。
19.根據(jù)權(quán)利要求16的DNA順序，其中所說的DNA順序編碼人干細(xì)胞因子。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的DNA順序。其還包含一個或多個為在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)所優(yōu)選之密碼子。
21.根據(jù)權(quán)利要求16的DNA順序，其具有圖15B、圖15C、圖42和圖44中列出的順序。
22.根據(jù)權(quán)利要求16的順序，其還包含一個或多個為在酵母細(xì)胞內(nèi)表達(dá)所優(yōu)選的密碼子。
23.根據(jù)權(quán)利要求16的DNA順序，其與可檢測的標(biāo)記物質(zhì)共價結(jié)合。
24.編碼天然存在之干細(xì)胞因子的多肽片段或多肽類似物的DNA順序。
25.權(quán)利要求24所述的編碼甲硫氨酰干細(xì)胞因子的DNA順序。
26.包含根據(jù)權(quán)利要求16之DNA順序的生物學(xué)功能性質(zhì)?；虿《綝NA載體。
27.用根據(jù)權(quán)利要求26的DNA載體穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的原核或真核宿主細(xì)胞。
28.在原核或真核宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)根據(jù)權(quán)利要求16的DNA順序所得到的多肽產(chǎn)物。
29.具有圖15C、圖42或圖44所列出的部分或全部氨基酸順序，且具有天然存在之干細(xì)胞因子的一種或多種體外生物學(xué)活性的多肽。
30.具有天然存在之干細(xì)胞因子的部分或全部二級構(gòu)象，并具有圖15C、圖42或圖44中列出的部分或全部氨基酸順序，還具有天然存在之人干細(xì)胞因子之生物學(xué)特性的多肽。
31.生產(chǎn)干細(xì)胞因子的方法，其包括在適當(dāng)?shù)臓I養(yǎng)條件下，培養(yǎng)用根據(jù)權(quán)利要求13的DNA轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的原核或真核宿主細(xì)胞，并分離表達(dá)所說載體中的DNA順序而產(chǎn)生的所需多肽產(chǎn)物。
32.一種含有純化的和分離的人干細(xì)胞因子的組合物，所說的干細(xì)胞因子沒有結(jié)合任何糖基化或非糖基化形式的人蛋白質(zhì)。
33.一種包含有效量的根據(jù)權(quán)利要求1的多肽和醫(yī)藥上可接受的稀釋劑、佐劑或載體的醫(yī)藥組合物。
34.治療哺乳動物白細(xì)胞減少癥的方法，其包括給予治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求1的多肽。
35.治療哺乳動物血小板減少癥的方法，其包括給予治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求1的多肽。
36.治療哺乳動物貧血的方法，其包括給予治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求1的多肽。
37.增進(jìn)哺乳動物骨髓移植期間移植物生長的方法，其包括給予治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求1的多肽。
38.增進(jìn)放射、化學(xué)物質(zhì)處理、或化學(xué)治療誘發(fā)的骨髓發(fā)育不全或骨髓抑制中骨髓功能恢復(fù)的方法，其包括用治療有效量的干細(xì)胞因子治療病人。
39.編碼選自下列之人干細(xì)胞因子類似物的DNA順序a)[Met-1]干細(xì)胞因子，和b)其中一個或多個半胱氨酸被丙氨酸或絲氨酸取代的干細(xì)胞因子。
40.在原核或真核宿主細(xì)胞中表達(dá)根據(jù)權(quán)利要求39之DNA順序所得到的多肽產(chǎn)物。
41.包含重組干細(xì)胞因子及醫(yī)藥上可接受的稀釋劑、佐劑或載體的藥物組合物，其中所說的重組干細(xì)胞因子具有人氨基酸順序。
42.與干細(xì)胞因子特異結(jié)合的抗體。
43.根據(jù)權(quán)利要求42的抗體，其中所說的抗體是單克隆抗體。
44.由含SCF的材料中有效地回收干細(xì)胞因子的方法，該方法包括對含SCF的材料進(jìn)行離子交換層析分離。
45.根據(jù)權(quán)利要求44的方法，其中所說的離子交換層析分離是陰離子交換層析分離。
46.根據(jù)權(quán)利要求44的方法，其進(jìn)一步包括反相液相層析分離的步驟。
47.由含SCF的材料中有效地回收干細(xì)胞因子的方法，該方法包括對含SCF的材料進(jìn)行反相液相層析分離。
48.具有天然存在之干細(xì)胞因子的造血生物學(xué)活性的多肽，或其等位基因變異體、衍生物、缺失類似物、取代類似物或加合類似物，所說的多肽具有圖15C、圖42或圖44中列出的氨基酸順序，且其特征在于它是外源DNA順序在原核或真核細(xì)胞中表達(dá)的產(chǎn)物。
49.權(quán)利要求48的多肽選自于SCF1-148，SCF1-162，SCF1-164，SCF1-165，SCF1-183(圖15C);SCF185，SCF1-188，SCF1-189，和SCF1-248(圖42);以及SCF1-157，SCF1-160，SCF1-161和SCF1-220(圖44)。
50.包含共價結(jié)合到水溶性聚合物上之多肽的生物學(xué)活性組合物。
51.根據(jù)權(quán)利要求50的組合物，其中所說的聚合物選自聚乙二醇或聚乙二醇與聚丙二醇的共聚物，且所說的共聚物是一個末端未被烷基取代或被烷基取代的。
52.根據(jù)權(quán)利要求50的組合物，其中多肽是[Met-1]SCF1-164。
53.根據(jù)權(quán)利要求50的組合物，其中所說的共聚物平均分子量約為1，000至100，000道爾頓。
54.根據(jù)權(quán)利要求50的組合物，其中所說的共聚物平均分子量約為4，000至40，000道爾頓。
55.根據(jù)權(quán)利要求50的組合物，其中所說的聚合物是未被取代的聚乙二醇或單甲氧基聚乙二醇。
56.根據(jù)權(quán)利要求50的組合物，其中所說的聚合物通過與所說聚合物的羧酸活性酯或碳酸酯衍生物反應(yīng)而接到所說的多肽上。
57.根據(jù)權(quán)利要求50的組合物，其中所說的蛋白質(zhì)的一個或多個氨基基團(tuán)通過與該聚合物的N-羥基琥珀酰亞胺、對位硝基苯酚或1-羥基-2-硝基-苯-4-磺酸酯衍生物反應(yīng)而結(jié)合到所說的聚合物上。
58.根據(jù)權(quán)利要求50的組合物，其中一個或多個游離半胱氨酸巰基基團(tuán)通過與所說聚合物的馬來酰亞胺基或鹵乙酰衍生物反應(yīng)而結(jié)合到所說聚合物上。
59.根據(jù)權(quán)利要求50的組合物，其中多肽是糖基化的，且通過使聚合物的氨基、肼或酰肼衍生物與碳水化合物部分氧化所產(chǎn)生的一個或多個醛基反應(yīng)而結(jié)合到到聚合物上。
60.制備生物活性聚合物-多肽加合物的方法，其包括在允許聚合物與所說的多肽共價結(jié)合的條件下，使權(quán)利要求50的多肽與水溶性聚合物反應(yīng)，并回收如此產(chǎn)生的加合物。
61.治療人類獲得性免疫缺陷癥的方法，其包括給病人使用治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求1的多肽。
62.治療哺乳動物腫瘤形成的方法，其包括使用治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求1的多肽。
63.根據(jù)權(quán)利要求62的方法，其中在所說的給藥步驟之前，對所說的哺乳動物施以化學(xué)治療或射線照射。
64.用基因轉(zhuǎn)染早期造血祖細(xì)胞的方法，其包括(ⅰ)加SCF培養(yǎng)早期造血祖細(xì)胞;以及(ⅱ)用基因轉(zhuǎn)染步驟(ⅰ)培養(yǎng)的細(xì)胞。
65.向哺乳動物體內(nèi)轉(zhuǎn)移基因的方法，其包括(ⅰ)加SCF培養(yǎng)早期造血祖細(xì)胞;(ⅱ)用基因轉(zhuǎn)染步驟(ⅰ)培養(yǎng)的細(xì)胞;以及(ⅲ)給所說的哺乳動物施用轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。
66.治療哺乳動物神經(jīng)損傷的方法，其包括使用治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求1的多肽。
67.治療哺乳動物不育癥的方法，其包括使用治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求1的多肽。
68.治療哺乳動物腸道損傷的方法，其包括使用治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求1的多肽。
69.治療哺乳動物骨髓增殖功能異常的方法，其包括使用治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求1的多肽。
70.根據(jù)權(quán)利要求48的多肽，其選自于[Met-1]SCF1-148，[Met-1]SCF1-162，[Met-1]SCF1-164，[Met-1]SCF1-165，[Met-1]SCF1-183(圖15C);[Met-1]SCF1-185，[Met-1]SCF1-188，[Met-1]SCF1-189，和[Met-1]SCF1-248(圖42);以及[Met-1]SCF1-157，[Met-1]SCF1-160，[Met-1]SCF1-161和[Met-1]SCF1-220(圖44)。
全文摘要
本發(fā)明公開了新的干細(xì)胞因子、編碼這些因子的寡核苷酸，以及其生產(chǎn)方法。還公開了治療與血細(xì)胞有關(guān)之功能失常的醫(yī)藥組合物和治療方法。
文檔編號C12N15/19GK1051937SQ9010964
公開日1991年6月5日 申請日期1990年10月16日 優(yōu)先權(quán)日1989年10月16日
發(fā)明者克里茨汀娜·M·齊塞博, 羅伯特·A·博塞曼, 悉尼·沃恩·薩格斯, 弗朗西斯·霍爾·馬丁 申請人:安姆根有限公司