耐熱堿性木聚糖酶基因xylGT優(yōu)化序列及其高效表達(dá)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種耐熱堿性木聚糖酶基因xylGT優(yōu)化序列及其高效表達(dá)方法，其序列如SEQ ID NO.1，在1140個堿基中，具有270個點(diǎn)突變，本發(fā)明在最優(yōu)條件下，木聚糖酶活達(dá)到82.24U/ml，比優(yōu)化前菌株發(fā)酵產(chǎn)量提高了1.25倍。并在發(fā)酵罐上對產(chǎn)酶條件進(jìn)行了試驗(yàn)，最大生產(chǎn)率為4.779U/(mL·h)，酶活為454U/mL，比改良前酶活提高了1.36倍，同時產(chǎn)酶時間延長了14h。
【專利說明】耐熱堿性木聚糖酶基因xyIGT優(yōu)化序列及其高效表達(dá)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，特別涉及耐熱堿性木聚糖酶基因xylGT優(yōu)化序列及其 高效表達(dá)方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 現(xiàn)今木聚糖酶的應(yīng)用領(lǐng)域不斷擴(kuò)大，已成功應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、造紙等工業(yè)中。在 造紙工業(yè)中有制漿這一工藝，在這步工藝中需要去除木質(zhì)素達(dá)到漂白的目地，傳統(tǒng)去除的 方法就是加強(qiáng)酸強(qiáng)堿，這對環(huán)境產(chǎn)生很大的污染。而用木聚糖酶進(jìn)行輔助漂白，不僅可以提 高紙漿的白度，還可減少后續(xù)化學(xué)漂白劑的添加量，這樣明顯的降低漂白廢水中有機(jī)污染 物氯代的產(chǎn)生；本研究發(fā)明涉及的耐熱堿性木聚糖酶在紙漿造紙行業(yè)有很好的運(yùn)用前景。
[0003] 在食品行業(yè)中，木聚糖酶不僅可以作為面包改良劑，可改善面團(tuán)的穩(wěn)定性和對過 度發(fā)酵的耐受性，聚糖酶還能夠降解果汁和啤酒中的多糖，因而有利于飲料的澄清，木聚糖 酶可降解多糖來生產(chǎn)低聚木糖，低聚木糖是一種具有低熱量和低糖度易吸收特性的重要的 食品添加劑。木聚糖酶在其它方面也具有很大的潛在價值，例如在果蔬制品的生產(chǎn)中，木聚 糖酶不僅能提高果蔬的汁浸出率及壓榨能力，也可以降低了生產(chǎn)成本；在飼料中添加木聚 糖酶可消除或降低低阿拉伯木聚糖抗?fàn)I養(yǎng)作用；在制藥工業(yè)中，木聚糖酶可用來制作緩釋 藥物的原料。
[0004] 鑒于木聚糖酶具有重要的實(shí)際應(yīng)用價值，人們希望能夠?qū)⒛揪厶敲竿度雽?shí)際應(yīng) 用，現(xiàn)階段必須克服的問題是怎樣降低它的生產(chǎn)成本提高它的產(chǎn)量。為解決這個問題，人們 嘗試通過誘變野生菌選育高產(chǎn)菌、利用基因工程手段構(gòu)建重組工程菌、培養(yǎng)條件的優(yōu)化等 等一些列手段來提高木聚糖酶的產(chǎn)量。
[0005] 在高產(chǎn)菌選育方面，人們一般通過過紫外（UV)，亞硝基胍（NTG)來誘變處理野生 菌以期得到產(chǎn)木聚糖酶最高的最佳突變菌株，該方法經(jīng)濟(jì)且快速。為了尋找適合工業(yè)應(yīng)用 的木聚糖酶，人們從嗜極性生物中尋找能產(chǎn)木聚糖酶的微生物，目前在嗜堿性微生物中發(fā) 現(xiàn)了一些微生物可產(chǎn)生木聚糖酶，但大多數(shù)是細(xì)菌；在嗜熱性微生物中發(fā)現(xiàn)細(xì)菌，真菌和放 線菌中都能產(chǎn)生木聚糖酶，這些酶在極端溫度和pH下仍然有很高的活性，因此更具有廣闊 的應(yīng)用前景；在基因克隆方面，目前已發(fā)現(xiàn)的木聚糖酶基因有xynA, xynB, xynC, xynZ等，最 初是將它們克隆轉(zhuǎn)到宿主大腸桿菌中，發(fā)現(xiàn)這些基因在大腸桿菌中雖然能夠表達(dá)但表達(dá)的 蛋白不能分泌到胞外，必須破碎細(xì)胞才能檢測到蛋白。人們將嗜熱細(xì)菌的木聚糖酶基因克 隆到畢氏酵母分泌表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化入宿主畢赤酵母中，將有活性的木聚糖酶分泌到胞外 來，便于后期分離純化。
[0006] 在選擇巴氏畢赤酵母為外源基因表達(dá)系統(tǒng)時，必須要考慮的問題就是該用什么樣 的方法實(shí)現(xiàn)外源目的蛋白在該系統(tǒng)的高效表達(dá)，從一些報道可總結(jié)出大致從以下方面來進(jìn) 行改進(jìn)：1)首先從基因水平對其改造。外源基因必須重組到巴氏畢赤酵母的染色體上才能 在甲醇的誘導(dǎo)下表達(dá)出來，因此它自身的結(jié)構(gòu)性質(zhì)在很大程度上影響其在系統(tǒng)中的高效表 達(dá)。一般來說外源基因AT與GC的含量都要適宜，AT太高會直接導(dǎo)致提前終止基因的翻譯 表達(dá)，有報道稱AT含量在30% -55 %之間最有利于外源基因在畢赤酵母中的高效表達(dá)；如 果外源基因的GC含量過高則容易造成翻譯能障過高，翻譯過程很難進(jìn)行下去，不利于外源 基因在畢赤酵母中的高效表達(dá)。另外在構(gòu)建外源基因時要充分考慮到巴氏畢赤酵母密碼子 的偏愛。所謂密碼子偏愛性就是某物種高表達(dá)的基因會使用特定的同義密碼子，這些密碼 子則是該物種的優(yōu)越密碼子。研究發(fā)現(xiàn)畢赤酵母的優(yōu)越密碼子大約有25個，因此為了增加 外源蛋白的表達(dá)量，在構(gòu)建外源基因的時候要盡量用到這25個密碼子且盡量避免用稀有 密碼子。2)適當(dāng)增加目的基因拷貝數(shù)。研究表明適當(dāng)增加拷貝數(shù)可以提高外源基因表達(dá) 量。但是，過多的外源基因的拷貝數(shù)也可能導(dǎo)致重組DNA不穩(wěn)定造成外源目的蛋白表達(dá)量 的降低。外源基因拷貝數(shù)與對G418或zeocin的抗性成正比，因此可利用不同濃度的G418 或zeocin來鑒別拷貝數(shù)的多少。3)外源基因整合到酵母染色體上的方式。在將重組載體 整合到酵母染色體之前，一般會選著不同的酶切位點(diǎn)把重組載體線性化，選擇不同的酶將 有不同的整合方式，挑選最有利于外源基因表達(dá)的整合方式。4)優(yōu)化培養(yǎng)條件。一種微生 物能否正常代謝生長產(chǎn)酶，需要合適的外界培養(yǎng)條件。不同的培養(yǎng)條件對于巴氏畢赤酵母 表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá)外源蛋白有著舉足輕重的影響例如溫度、pH、溶氧等，這些培養(yǎng)條件一方 面作用于菌體的生長狀況，另一方面也影響著外源蛋白的活性，最有利于菌體生長的條件 并不意味這是最有利于產(chǎn)酶的條件，在探究最優(yōu)條件時要綜合考慮這兩方面。例如畢赤酵 母的最佳生長溫度是30°C，但有研究表明15°C的誘導(dǎo)溫度可以顯著提高外源蛋白的表達(dá)； 畢赤酵母的最佳生長pH是3-7,假如培養(yǎng)基的pH不在這個范圍，菌體的生長量沒多大變化 但是對產(chǎn)生的蛋白質(zhì)有很大影響。另外，培養(yǎng)基中的碳氮比以及誘導(dǎo)劑的添加量也對蛋白 的表達(dá)起到至關(guān)重要的作用，在優(yōu)化培養(yǎng)條件時要充分考慮這兩點(diǎn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為解決上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供耐熱堿性木聚糖酶基因 xylGT優(yōu)化序列及其高效表達(dá)方法，使用DNAworks軟件以及mRNA的穩(wěn)定性分析軟件RNA Structure 4. 3,將來源于 Geobacillus thermoleovorans 的 xylGT 基因（GenBank 登錄號： JN680872)，按照畢赤酵母的密碼子偏愛性，對出發(fā)菌株的木聚糖酶基因進(jìn)行優(yōu)化改良，將 優(yōu)化后的xylGT基因序列進(jìn)行優(yōu)化而來。在其引物5'端添加了 EcoRI限制性酶切位點(diǎn)， 引物3'端引入了 Notl限制性酶切位點(diǎn)，經(jīng)PCR擴(kuò)增，連接轉(zhuǎn)化，測序驗(yàn)證，得到堿性木聚 糖酶xylGT的優(yōu)化基因序列。將優(yōu)化后的木聚糖酶基因克隆到畢赤酵母GS115的表達(dá)載 體PPIC9K上，得到重組表達(dá)載體pPIC9K-xylGT，再將重組表達(dá)載體電轉(zhuǎn)化到宿主畢赤酵母 中，通過在不含組氨酸的基礎(chǔ)培養(yǎng)基（MD)以及菌落PCR初步篩選出陽性克隆，結(jié)合G418抗 性和含木聚糖的平板上水解圈大小篩選高拷貝菌株，并從中成功地篩選了一株高產(chǎn)木聚糖 酶的重組菌P. pastoris GS115/xyl。在此基礎(chǔ)上，采用單因子實(shí)驗(yàn)、Plackett-Burman設(shè)計(jì)、 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)、響應(yīng)面設(shè)計(jì)相結(jié)合的方法，對重組菌株產(chǎn)xylanase在搖瓶水平上的發(fā)酵條 件進(jìn)行優(yōu)化，找到最優(yōu)發(fā)酵條件以期提高xylanase的表達(dá)量，降低xylanase的生產(chǎn)成本。 在最優(yōu)條件下，木聚糖酶活達(dá)到82. 24U/ml，比優(yōu)化前菌株發(fā)酵產(chǎn)量提高了 1. 25倍。并在發(fā) 酵罐上對產(chǎn)酶條件進(jìn)行了試驗(yàn)，最大生產(chǎn)率為4. 779UAmL ? h)，酶活為454U/mL，比改良前 酶活提高了 1.36倍，同時產(chǎn)酶時間延長了 14h。
[0008] 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為：
[0009] -種耐熱堿性木聚糖酶基因xylGT核苷酸優(yōu)化序列，其序列如SEQ ID NO. 1
[0010] 一種耐熱堿性木聚糖酶基因xylGT核苷酸優(yōu)化序列的高效表達(dá)方法，包括如下步 驟：
[0011] 步驟一、根據(jù)畢赤酵母密碼子偏愛將原始基因進(jìn)行優(yōu)化，PCR擴(kuò)增合成全長木聚糖 酶基因xylGT ;
[0012] 步驟二、將優(yōu)化的木聚糖酶基因xylGT與表達(dá)載體pPIC9K分別用酶EcoRI和 Not I進(jìn)行雙酶切，經(jīng)連接得到重組質(zhì)粒pPIC9K-xylGT ;
[0013] 步驟三、將經(jīng)SalI酶切線性化后的pPIC9K_xylGT重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化到畢赤酵母宿 主菌GS115中，在基本培養(yǎng)基（MD)平板上初步篩選到陽性菌落，通過PCR進(jìn)一步鑒定篩選 得到重組工程菌GS115/xyl ;根據(jù)G418抗性篩選出高拷貝的陽性轉(zhuǎn)化子，再將高拷貝的陽 性轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)移到含有0.05%木聚糖的緩沖甲醇培養(yǎng)基（BMMY)平板上，挑選產(chǎn)水解圈大的 陽性轉(zhuǎn)化子作為高產(chǎn)木聚糖酶的出發(fā)菌開展研究；
[0014] 步驟四、對篩選到的產(chǎn)酶高的重組菌產(chǎn)的木聚糖酶進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)的研究。該木 聚糖酶最適反應(yīng)pH為8. 8,最適反應(yīng)溫度為78°C ;為了研究該木聚糖酶的溫度穩(wěn)定性和pH 穩(wěn)定性將酶放在在高溫或者強(qiáng)堿條件下一個小時后測定殘留酶活性率較低，說明木聚糖酶 在強(qiáng)堿或者高溫下不穩(wěn)定；
[0015] 步驟五、在搖瓶培養(yǎng)基礎(chǔ)上采用單因子實(shí)驗(yàn)確定了初始最優(yōu)發(fā)酵產(chǎn)酶條件為： pH = 6. 9、大豆蛋白胨為1.5%、酵母浸膏為1.5 %、甲醇為1 %、硫酸鎂為0. 1 %、硫酸鈣 0. 05%、硫酸銨為0. 45%、28°C培養(yǎng)5天；利用Plackett-Burman設(shè)計(jì)篩選出影響產(chǎn)酶 的三個顯著因素：甲醇、酵母浸膏、硫酸鈣；用最陡爬坡路徑逼近最大響應(yīng)區(qū)域后，再結(jié)合 Box-Behnken設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析法對篩選到的顯著因素進(jìn)行優(yōu)化，得出顯著因素的最優(yōu)條 件為：甲醇12ml/L，酵母浸膏15g/L，硫酸鈣1. 049g/L。
[0016] 相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果為：
[0017] 本發(fā)明提高xylanase的表達(dá)量，降低xylanase的生產(chǎn)成本。在最優(yōu)條件下，木聚 糖酶活達(dá)到82. 24U/ml，比優(yōu)化前菌株發(fā)酵產(chǎn)量提高了 1. 25倍。并在發(fā)酵罐上對產(chǎn)酶條件 進(jìn)行了試驗(yàn)，最大生產(chǎn)率為4. 779UAmL *h)，酶活為454U/mL，比改良前酶活提高了 1. 36倍， 同時產(chǎn)酶時間延長了 14h。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018] 圖1是本發(fā)明根據(jù)密碼子偏好優(yōu)化后的序列與原始序列的比較圖；在1140個堿基 中，顯示270個點(diǎn)突變的位置。
[0019] 圖2為本發(fā)明RNA二級結(jié)果分析energy = -338. 3。
[0020] 圖3為木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0021] 圖4為木聚糖酶酶活性與pH關(guān)系圖。
[0022] 圖5為木聚糖酶酶活性與溫度關(guān)系圖。
[0023] 圖6為優(yōu)化前后菌株在發(fā)酵培養(yǎng)基中的生長曲線。
[0024] 圖7為6天取15 L電泳檢測每天木聚糖酶的表達(dá)情況。
[0025] 圖8為不同時間段木聚糖酶的活性性。

【具體實(shí)施方式】
[0026] 下面結(jié)合附圖及【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明技術(shù)方案做進(jìn)一步詳細(xì)描述：
[0027] 試驗(yàn)例：
[0028] 一利用overlap PCR合成全基因
[0029] 根據(jù)畢赤酵母密碼子偏愛性以及通過RNA structure 4. 3軟件預(yù)測mRNA的穩(wěn)定 性來設(shè)計(jì)優(yōu)化的木聚糖酶基因，在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)32條引物，通過overlap PCR合成全長木 聚糖酶基因：
[0030] (1)在50 i! L PCR反應(yīng)體系中對全長木聚糖酶基因序列的5'上游部分序列進(jìn)行克 隆

【權(quán)利要求】
1. 一種耐熱堿性木聚糖酶基因 xylGT核苷酸優(yōu)化序列，其特征在于，其序列如SEQ ID NO. 1，在1140個堿基中，具有270個點(diǎn)突變。
2. -種耐熱堿性木聚糖酶基因 xylGT核苷酸優(yōu)化序列的高效表達(dá)方法，其特征在于， 包括如下步驟： 步驟一、根據(jù)畢赤酵母密碼子偏愛將原始基因進(jìn)行優(yōu)化，PCR擴(kuò)增合成全長木聚糖酶基 因 xylGT ; 步驟二、將優(yōu)化的木聚糖酶基因 xylGT與表達(dá)載體pPIC9K分別進(jìn)行雙酶切，經(jīng)連接得 到重組質(zhì)粒pPIC9K-xylGT ; 步驟三、將經(jīng)Sal I酶切線性化后的pPIC9K_xylGT重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化到畢赤酵母宿主菌 GS115中，在基本培養(yǎng)基平板上初步篩選到陽性菌落，通過PCR進(jìn)一步鑒定篩選得到重組工 程菌GS115/xyl ;根據(jù)G418抗性篩選出高拷貝的陽性轉(zhuǎn)化子，再將高拷貝的陽性轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn) 移到含有〇. 05%木聚糖的緩沖甲醇培養(yǎng)基平板上，挑選產(chǎn)水解圈大的陽性轉(zhuǎn)化子作為高 產(chǎn)木聚糖酶的出發(fā)菌； 步驟四、在pH為8. 8,反應(yīng)溫度為78°C條件下對篩選到的產(chǎn)酶高的重組菌繼續(xù)搖瓶培 養(yǎng)培養(yǎng)； 步驟五、在搖瓶培養(yǎng)基礎(chǔ)上，發(fā)酵產(chǎn)酶條件選?。簆H = 6. 9、大豆蛋白胨為1. 5%、酵母 浸膏為1.5%、甲醇為1 %、硫酸鎂為0. 1 %、硫酸鈣0.05%、硫酸銨為0.45%，于28°C培養(yǎng) 5天。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟二中，用酶EcoR I和Not I進(jìn)行 雙酶切。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟五中，利用Plackett-Burman設(shè) 計(jì)篩選出影響產(chǎn)酶的三個顯著因素：甲醇、酵母浸膏、硫酸鈣；用最陡爬坡路徑逼近最大響 應(yīng)區(qū)域后，再結(jié)合Box-Behnken設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析法對篩選到的顯著因素進(jìn)行優(yōu)化，選取 顯著因素的最優(yōu)條件為：甲醇12ml/L，酵母浸膏15g/L，硫酸鈣1. 049g/L。
【文檔編號】C12N15/56GK104450758SQ201410679215
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年11月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月24日
【發(fā)明者】閆達(dá)中 申請人:武漢輕工大學(xué), 桂林精成生物科技有限公司