一種前交叉韌帶殘端來源的間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種前交叉韌帶殘端組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞的分離方法，包括如下步驟：(1)取前交叉韌帶殘端組織，剪成組織碎塊，采用濃度為0.2～0.6％(w/v)的I型膠原酶溶液消化4～6h；(2)終止消化，用100～400目篩網(wǎng)過濾，1000～2000rpm離心4～10min，棄上清，PBS洗滌3次，重懸于間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基中，置于37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)，2～3天后棄去非貼壁細(xì)胞和碎片，換液，此后每3～4天換液一次，在細(xì)胞融合度為80％～90％時收獲細(xì)胞，即可。本發(fā)明前交叉韌帶殘端來源的間充質(zhì)干細(xì)胞綜合韌帶細(xì)胞的穩(wěn)定表型和MSC“干性”特征兩者的優(yōu)點，其分化確切，生物活性優(yōu)良，是未來韌帶再生及其轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中較為理想的一種種子細(xì)胞來源，臨床應(yīng)用前景良好。
【專利說明】一種前交叉韌帶殘端來源的間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種韌帶殘端來源的間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002]前交叉韌帶損傷在臨床骨科及運(yùn)動醫(yī)學(xué)領(lǐng)域非常常見，尤其是對于高水平的專業(yè)運(yùn)動員。關(guān)節(jié)鏡下前交叉韌帶重建目前被認(rèn)為是廣泛接受的治療前交叉韌帶斷裂的“金標(biāo)準(zhǔn)”，用于前交叉韌帶重建的肌腱移植物(包括自體、異體和人工合成的韌帶)在體內(nèi)經(jīng)歷急性炎性反應(yīng)、再血管化、基質(zhì)合成、膠原重塑4個“韌帶化”整合階段。前交叉韌帶重建的目標(biāo)是恢復(fù)膝關(guān)節(jié)穩(wěn)定的功能，但是很多接受前交叉韌帶重建的患者依然發(fā)生關(guān)節(jié)退變。成功的前交叉韌帶重建的前提條件是移植物與宿主組織的生物學(xué)整合。一些研究發(fā)現(xiàn)前交叉韌帶/后交叉韌帶的保留殘端組織的生物增強(qiáng)重建有利于韌帶的愈合。
[0003]種子細(xì)胞為基礎(chǔ)的組織工程及再生醫(yī)學(xué)策略為韌帶的生物學(xué)再生帶來新的希望。目前用于韌帶再生的種子細(xì)胞主要為成體間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSC)。
[0004]MSC因其來源廣泛、優(yōu)良的自我更新、多向分化潛能、免疫調(diào)節(jié)、定向歸巢以及無倫理道德方面爭議等優(yōu)點。在體內(nèi)外適當(dāng)?shù)臈l件下，MSC能分化為中胚層、甚至內(nèi)外胚層的組織細(xì)胞。但是，另一方面，MSC在體外培養(yǎng)擴(kuò)增過程中可能出現(xiàn)轉(zhuǎn)化、衰老或凋亡現(xiàn)象，常伴隨細(xì)胞增殖能力和分化潛能的下降，逐漸失去其“干性”特點。再者，MSC最傳統(tǒng)經(jīng)典主要來源是骨髓，但其MSC的含量非常低(僅占有核細(xì)胞的0.01%?0.001% )，且存在供區(qū)并發(fā)癥等缺點。因此開發(fā)其他來源的MSC用于韌帶的修復(fù)重建非常有意義。盡管還可以從其他組織，如脂肪或滑膜組織分離間充質(zhì)干細(xì)胞，但是這些間充質(zhì)干細(xì)胞相對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的干性較弱，用于韌帶修復(fù)時，不能確切的分化為韌帶細(xì)胞，導(dǎo)致修復(fù)效果不佳。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種前交叉韌帶殘端來源的間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法和鑒定。
[0006]本發(fā)明前交叉韌帶殘端組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞的分離方法，其包括如下步驟:
[0007](I)取前交叉韌帶殘端組織，剪成組織碎塊，采用濃度為0.2?0.6% (w/v)的I型膠原酶溶液消化4?6h ;
[0008](2)終止消化，用100?400目篩網(wǎng)過濾，1000?2000rpm離心4?lOmin，棄上清，PBS洗滌3次，重懸于間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基中，置于37°C、5% CO2條件下培養(yǎng)，2?3天后棄去非貼壁細(xì)胞和碎片，換液，此后每3?4天換液一次，在細(xì)胞融合度為80 %?90 %時收獲細(xì)胞，即可。
[0009]前交叉韌帶殘端:前交叉韌帶損傷后斷端的殘留組織。
[0010]步驟(I)中，所述組織碎塊的體積為I?5mm3。
[0011]步驟(I)中，所述消化是在37°C、30?300轉(zhuǎn)/分條件下振蕩消化。
[0012]步驟⑴中，所述I型膠原酶溶液的濃度為0.2% (w/v);所述I型膠原酶溶液是包含膠原酶的低糖DMEM培養(yǎng)基。
[0013]步驟(2)中，所述終止消化的方法是:加入細(xì)胞懸液1/2?3倍體積的含10% FBS的低糖DMEM培養(yǎng)基。
[0014]步驟(2)中，所述篩網(wǎng)為200目篩。
[0015]步驟(2)中，所述離心的轉(zhuǎn)速為1200rpm,離心時間為5min。
[0016]步驟⑵中，細(xì)胞培養(yǎng)時，環(huán)境的相對濕度為95%。
[0017]步驟⑵中，所述間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基是添加有10% FBS, 3.7g/LNaHC03,100U/ml青霉素，100 μ g/ml鏈霉素，25ng/ml兩性霉素B，2mM L-谷氨酰胺的低糖DMEM培養(yǎng)基。
[0018]本發(fā)明還提供了前述方法分離得到的間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0019]FBS:胎牛血清。
[0020]目前，通常認(rèn)為間充質(zhì)干細(xì)胞存在于骨髓、外周血、臍血、松質(zhì)骨、脂肪組織、滑膜和臍帶中，但是用這些來源的間充質(zhì)干細(xì)胞用于半月板修復(fù)均存在缺陷，如，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞含量非常低(僅占有核細(xì)胞的0.01%?0.001% )，且存在供區(qū)并發(fā)癥等缺點，而其他組織來源的干細(xì)胞又不能確切分化為半月板細(xì)胞，導(dǎo)致修復(fù)效果不好。
[0021]然而，發(fā)明人卻從前交叉韌帶殘端組織分離得到的間充質(zhì)干細(xì)胞，綜合前交叉韌帶殘細(xì)胞的穩(wěn)定表型和間充質(zhì)干細(xì)胞“干性”特征兩者的優(yōu)點，可以克服前述其他來源間充質(zhì)干細(xì)胞用于修復(fù)前交叉韌帶殘存在的問題。
[0022]本發(fā)明前交叉韌帶殘端間充質(zhì)干細(xì)胞，既具有間充質(zhì)干細(xì)胞通常都具有的干性，又來源于韌帶組織，可以制備成為韌帶組織修復(fù)用種子細(xì)胞，修復(fù)韌帶組織，臨床應(yīng)用前景良好。
[0023]以下通過實施例形式的【具體實施方式】，對本發(fā)明的上述內(nèi)容作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實施例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1前交叉韌帶損傷的MR1、關(guān)節(jié)鏡下發(fā)現(xiàn)、大體觀察；
[0025]圖2前交叉韌帶殘端原位MSC顯微鏡下的形態(tài)；
[0026]圖3前交叉韌帶殘端原位MSC的表面標(biāo)記；
[0027]圖4前交叉韌帶殘端原位MSC的成骨分化；
[0028]圖5前交叉韌帶殘端原位MSC的成脂分化；
[0029]圖6前交叉韌帶殘端原位MSC的成軟骨分化。

【具體實施方式】
[0030]實驗材料和試劑:
[0031]磷酸緩沖鹽溶液(PBS)，I型膠原酶，低糖DMEM (含lg/L葡萄糖，購自Gibco)，高糖DMEM (含4.5g/L葡萄糖)，胰酶消化液(0.25%胰酶/0.1 % EDTA)，CD29抗體，CD44抗體，CD90抗體，CD105抗體，CD34抗體，CD45抗體，II型膠原抗體，成骨誘導(dǎo)液，成脂誘導(dǎo)液，成脂誘導(dǎo)維持液，成軟骨誘導(dǎo)液，茜素紅染液，油紅O染液，甲苯胺藍(lán)染液，。
[0032]實施例1本發(fā)明前交叉韌帶殘端組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞的分離及檢測
[0033]一、分離及檢測方法
[0034]1、前交叉韌帶殘端的取材
[0035]通過患者的臨床表現(xiàn)、MRI和關(guān)節(jié)鏡下的陽性發(fā)現(xiàn)綜合判斷確診為ACL損傷(詳見圖1)。在關(guān)節(jié)鏡下用髓核鉗取出韌帶殘端(詳見圖1)。在顯微鏡下剔除周圍的滑膜和增生的纖維組織,置于含有雙抗的PBS中漂洗3次。
[0036]2、前交叉韌帶殘端特異MSC的分離培養(yǎng)
[0037]用眼科剪將取材的韌帶殘端剪成約Imm3大小的組織碎塊，然后在0.2% I型膠原酶(低糖DMEM配置)中37°C恒溫水浴搖床振蕩(150轉(zhuǎn)/分)消化4?6h。經(jīng)顯微鏡觀察，大部分細(xì)胞消化下來后用巴氏吸管吹打3min，加入細(xì)胞懸液等體積的含10% FBS的低糖DMEM新鮮培養(yǎng)基終止消化，用200目篩網(wǎng)過濾消化后的細(xì)胞懸液，1200rpm離心5min，棄上清，PBS洗滌3次，顯微鏡下細(xì)胞計數(shù)后細(xì)胞按I X 16/瓶(25cm2培養(yǎng)瓶)重懸于完全培養(yǎng)基(低糖 DMEM，10% FBS, 3.7g/L NaHCO3,100U/ml 青霉素，100 μ g/ml 鏈霉素，25ng/ml 兩性霉素B，2mM L-谷氨酰胺)中，置于37°C含5% CO2和95%濕度的培養(yǎng)箱中孵育。隔日倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化和生長情況。2?3天后棄去非貼壁細(xì)胞和細(xì)胞碎片，更換新的完全培養(yǎng)基。此后每3?4天換液一次。原代細(xì)胞培養(yǎng)大約10?15天，細(xì)胞達(dá)到80 %?90 %融合，用0.25 %胰酶/0.1 % EDTA按1:2或1:3的比例消化傳代。收集第3代細(xì)胞用于后面的實驗。
[0038]實施例2本發(fā)明前交叉韌帶殘端組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞的分離及檢測
[0039]一、分離及檢測方法
[0040]1、前交叉韌帶殘端的取材
[0041]通過患者的臨床表現(xiàn)、MRI和關(guān)節(jié)鏡下的陽性發(fā)現(xiàn)綜合判斷確診為ACL損傷(詳見圖1)。在關(guān)節(jié)鏡下用髓核鉗取出韌帶殘端(詳見圖1)。在顯微鏡下剔除周圍的滑膜和增生的纖維組織,置于含有雙抗的PBS中漂洗3次。
[0042]2、前交叉韌帶殘端特異MSC的分離培養(yǎng)
[0043]用眼科剪將取材的韌帶殘端剪成約Imm3大小的組織碎塊，然后在0.4% I型膠原酶(低糖DMEM配置)中37°C恒溫水浴搖床振蕩(30轉(zhuǎn)/分)消化4?6h。經(jīng)顯微鏡觀察，大部分細(xì)胞消化下來后用巴氏吸管吹打3min，加入細(xì)胞懸液1/2體積的含10% FBS的低糖DMEM新鮮培養(yǎng)基終止消化，用100目篩網(wǎng)過濾消化后的細(xì)胞懸液，100rpm離心lOmin，棄上清，PBS洗滌3次，顯微鏡下細(xì)胞計數(shù)后細(xì)胞按I X 16/瓶(25cm2培養(yǎng)瓶)重懸于完全培養(yǎng)基(低糖 DMEM，10% FBS, 3.7g/L NaHCO3,100U/ml 青霉素，100 μ g/ml 鏈霉素，25ng/ml 兩性霉素B，2mM L-谷氨酰胺)中，置于37°C含5% CO2和95%濕度的培養(yǎng)箱中孵育。隔日倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化和生長情況。2?3天后棄去非貼壁細(xì)胞和細(xì)胞碎片，更換新的完全培養(yǎng)基。此后每3?4天換液一次。原代細(xì)胞培養(yǎng)大約10?15天，細(xì)胞達(dá)到80 %?90 %融合，用0.25 %胰酶/0.1 % EDTA按1:2或1:3的比例消化傳代。收集第3代細(xì)胞用于以下實驗。
[0044](I)取前交叉韌帶殘端組織，剪成組織碎塊，采用濃度為0.2?0.6% (w/v)的I型膠原酶溶液消化4?6h ;
[0045](2)終止消化，將細(xì)胞懸液用100?400目篩網(wǎng)過濾，1000?2000rpm離心4?lOmin，棄上清，PBS洗滌3次，重懸于間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基中，置于37°C、5% C02、95%濕度條件下培養(yǎng)，2?3天后棄去非貼壁細(xì)胞和碎片，換液，此后每3?4天換液一次，在細(xì)胞融合度為80%?90%時收獲細(xì)胞，即可。
[0046]實施例3本發(fā)明前交叉韌帶殘端組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞的分離及檢測
[0047]一、分離及檢測方法
[0048]1、前交叉韌帶殘端的取材
[0049]通過患者的臨床表現(xiàn)、MRI和關(guān)節(jié)鏡下的陽性發(fā)現(xiàn)綜合判斷確診為ACL損傷(詳見圖1)。在關(guān)節(jié)鏡下用髓核鉗取出韌帶殘端(詳見圖1)。在顯微鏡下剔除周圍的滑膜和增生的纖維組織,置于含有雙抗的PBS中漂洗3次。
[0050]2、前交叉韌帶殘端特異MSC的分離培養(yǎng)
[0051]用眼科剪將取材的韌帶殘端剪成約Imm3大小的組織碎塊，然后在0.6% I型膠原酶(低糖DMEM配置)中37°C恒溫水浴搖床振蕩(300轉(zhuǎn)/分)消化4?6h。經(jīng)顯微鏡觀察，大部分細(xì)胞消化下來后用巴氏吸管吹打3min，加入細(xì)胞懸液3倍體積的含10% FBS的低糖DMEM新鮮培養(yǎng)基終止消化，用400目篩網(wǎng)過濾消化后的細(xì)胞懸液，2000rpm離心4min，棄上清，PBS洗滌3次，顯微鏡下細(xì)胞計數(shù)后細(xì)胞按I X 16/瓶(25cm2培養(yǎng)瓶)重懸于完全培養(yǎng)基(低糖 DMEM，10% FBS, 3.7g/L NaHCO3,100U/ml 青霉素，100 μ g/ml 鏈霉素，25ng/ml兩性霉素B，2mM L-谷氨酰胺)中，置于37°C含5% CO2和95%濕度的培養(yǎng)箱中孵育。隔日倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化和生長情況。2?3天后棄去非貼壁細(xì)胞和細(xì)胞碎片，更換新的完全培養(yǎng)基。此后每3?4天換液一次。原代細(xì)胞培養(yǎng)大約10?15天，細(xì)胞達(dá)到80%?90%融合，用0.25%胰酶/0.1% EDTA按1:2或1:3的比例消化傳代。
[0052]以下用實驗例的方式說明本發(fā)明的有益效果:
[0053]實驗例I前交叉韌帶殘端來源的間充質(zhì)干細(xì)胞的特性檢測
[0054]一、實驗方法
[0055]1、前交叉韌帶殘端特異MSC的表面標(biāo)記
[0056]通過FCM和激光共聚焦顯微鏡分析第3代韌帶殘端來源的MSC的免疫表型。選擇⑶29、⑶44、⑶90和⑶105作為陽性標(biāo)記，⑶34和⑶45作為陰性標(biāo)記。收集生長良好的第3代細(xì)胞，以I X 16細(xì)胞/ml的細(xì)胞密度重懸于PBS中，于FITC標(biāo)記的⑶29、⑶44或純化⑶90、⑶105、⑶34、⑶45抗體溶液中孵育lh，加入一定體積FITC標(biāo)記的二抗孵育30min。每管檢測都設(shè)計同型抗體IgG對照以消除非特異染色。經(jīng)洗滌后于流式固定液中固定30min。至少10000個細(xì)胞通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析，上機(jī)檢測。
[0057]2、前交叉韌帶殘端特異MSC的多向分化潛能
[0058]通過成骨、成脂和成軟骨三系分化來評價MSC的多向分化潛能
[0059]成骨分化:取生長良好的第3代韌帶殘端來源的MSC，以3 X 1Vcm2的密度接種于6孔板中，24小時后棄去培養(yǎng)基，加入2ml成骨誘導(dǎo)液(高糖DMEM，10% FBS, 0.1 μ M地塞米松，1mM β-甘油磷酸鈉，50 μ M抗壞血酸，2mM L-谷氨酰胺，I %雙抗)。每3天換液一次，誘導(dǎo)2周。采用茜素紅染色和ALP染色評估成骨礦化和早期特異成骨基質(zhì)的分泌情況。并通過Real-tine PCR檢測成骨特異基因的表達(dá)。
[0060]成脂分化:取生長良好的第3代韌帶殘端來源的MSC，以3X 103/cm2的密度接種于6孔板中，24小時后棄去培養(yǎng)基，加入2ml成脂誘導(dǎo)液(高糖DMEM，10% FBS, I μ M地塞米松，0.5mMIBMX, 10g/ml胰島素，10mM吲哚美辛，2mM L-谷氨酰胺，I %雙抗)，3天后換成成脂維持液(高糖01^，10%?83，1(^/1111胰島素，21111 L-谷氨酰胺，I %雙抗)，24h后再換成成脂誘導(dǎo)液，如此循環(huán)，至到2周。采用油紅O染色評估細(xì)胞質(zhì)內(nèi)脂滴形成情況。并通過Real-tine PCR檢測成脂特異基因的表達(dá)。
[0061]成軟骨分化:采用三維細(xì)胞微團(tuán)和無血清培養(yǎng)體系評價韌帶殘端來源的MSC的成軟骨能力。收集I X 16生長良好的第3代韌帶碎片來源的MSC，在15毫升的聚丙烯錐形離心管中懸于Iml成軟骨誘導(dǎo)液[100X IT (6.25 μ g/ml胰島素，6.25 μ g/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白，5.35 μ g/ml亞麻酸，6.25ng/ml牛血清白蛋白，6.25 μ g/ml亞硒酸)，lmmol/L丙酮酸鈉，0.17mmol/L抗壞血酸，0.1 μ M地塞米松,0.35mmol/L腦氨酸，10ng/ml TGF β 3]中，1500rpm/min 離心 10分鐘，置于37°C含5% C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天換液一次，至到3周。行HE、甲苯胺藍(lán)、II型膠原免疫組化染色評估微球大體及軟骨特異細(xì)胞外基質(zhì)的分泌情況。并通過Real-tinePCR檢測成軟骨特異基因的表達(dá)。
[0062]二、檢測結(jié)果
[0063]1、形態(tài)特征
[0064]如圖2所示，原代接種4?7天后分離獲得的細(xì)胞呈典型的長梭形的成纖維細(xì)胞樣形態(tài)㈧；10?15天后培養(yǎng)的細(xì)胞達(dá)到80%?90%融合，呈旋渦狀生長⑶；傳代至第3代后細(xì)胞較均一(C)。
[0065]結(jié)果證明，本發(fā)明分離獲得的細(xì)胞呈間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)。
[0066]2、分離細(xì)胞的表面標(biāo)記
[0067]如圖3所示，本發(fā)明分離獲得的細(xì)胞，表達(dá)典型的間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記⑶29、⑶44、⑶90和⑶105 (95 %以上)，而不表達(dá)造血系細(xì)胞標(biāo)記⑶34和⑶45 (5 %以下)。
[0068]結(jié)果證明，本發(fā)明分離獲得的細(xì)胞表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記。
[0069]3、細(xì)胞分化
[0070]如圖4所示，本發(fā)明分離獲得的細(xì)胞經(jīng)成骨誘導(dǎo)14天后茜素紅和ALP染色陽性，Real-tine PCR檢測顯示表達(dá)成骨特異基因Runx2，ALP和I型膠原。
[0071]如圖5所示，本發(fā)明分離獲得的細(xì)胞經(jīng)成脂誘導(dǎo)14天后光鏡下可見透亮的脂滴形成，油紅O染色陽性，Real-tine PCR檢測顯示表達(dá)成脂特異基因PPAR- y ,LPL, PAS和aP2。
[0072]如圖6所示，本發(fā)明分離獲得的細(xì)胞經(jīng)在三維細(xì)胞微團(tuán)和無血清條件下成軟骨誘導(dǎo)21天后，HE染色顯示細(xì)胞圓形位于微團(tuán)里面，甲苯胺藍(lán)和免疫組化染色陽性顯示軟骨特異細(xì)胞外基質(zhì)GAG和II型膠原表達(dá)，Real-tine PCR檢測顯示表達(dá)成軟骨特異基因II型膠原和GAG。
[0073]結(jié)果證明，本發(fā)明分離獲得的細(xì)胞具有分化成骨、成脂、成軟骨的能力。
[0074]實驗結(jié)果說明，本發(fā)明分離獲得的細(xì)胞貼壁生長，呈典型的長梭形的成纖維細(xì)胞樣形態(tài)，表達(dá)典型的間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記⑶29、⑶44、⑶90和⑶105，而不表達(dá)造血系細(xì)胞標(biāo)記⑶34和⑶45，在適當(dāng)?shù)臈l件下具有分化成骨、成脂、成軟骨的能力，經(jīng)鑒定為間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0075]本發(fā)明前交叉韌帶殘端來源的間充質(zhì)干細(xì)胞綜合韌帶細(xì)胞的穩(wěn)定表型和MSC “干性”特征兩者的優(yōu)點，其分化確切，生物活性優(yōu)良，是未來韌帶/肌腱再生及其轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中較為理想的一種種子細(xì)胞來源，臨床應(yīng)用前景良好。
【權(quán)利要求】
1.一種前交叉韌帶殘端組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞的分離方法，其特征在于:包括如下步驟: (1)取前交叉韌帶殘端組織，剪成組織碎塊，采用濃度為0.2?0.6% (w/v)的I型膠原酶溶液消化4?6h ; (2)終止消化，用100?400目篩網(wǎng)過濾，1000?2000rpm離心4?lOmin，棄上清，PBS洗滌3次，重懸于間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基中，置于37°C、5% CO2條件下培養(yǎng)，2?3天后棄去非貼壁細(xì)胞和碎片，換液，此后每3?4天換液一次，在細(xì)胞融合度為80 %?90 %時收獲細(xì)胞，即可。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離方法，其特征在于:步驟(I)中，所述組織碎塊的體積為I ?5mm3 ο
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離方法，其特征在于:步驟(I)中，所述消化是在37°C、30?300轉(zhuǎn)/分條件下振蕩消化。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離方法，其特征在于:步驟(I)中，所述I型膠原酶溶液的濃度為0.2% (w/v);所述I型膠原酶溶液是包含膠原酶的低糖DMEM培養(yǎng)基。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離方法，其特征在于:步驟(2)中，所述終止消化的方法是:加入細(xì)胞懸液1/2?3倍體積的含10% FBS的低糖DMEM培養(yǎng)基。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離方法，其特征在于:步驟(2)中，所述篩網(wǎng)為200目篩。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離方法，其特征在于:步驟(2)中，所述離心的轉(zhuǎn)速為1200rpm,離心時間為5min。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離方法，其特征在于:步驟(2)中，細(xì)胞培養(yǎng)時，環(huán)境的相對濕度為95%。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離方法，其特征在于:步驟(2)中，所述間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基是添加有 10% FBS, 3.7g/L NaHCO3,100U/ml 青霉素，100 μ g/ml 鏈霉素，25ng/ml 兩性霉素B，2mM L-谷氨酰胺的低糖DMEM培養(yǎng)基。
10.權(quán)利要求1?9任意一項方法分離得到的間充質(zhì)干細(xì)胞。
【文檔編號】C12N5/0775GK104357386SQ201410654515
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年11月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月17日
【發(fā)明者】付維力 申請人:四川大學(xué)華西醫(yī)院