一種鑒別飼料中羊乳成分和羊肉骨粉成分的核苷酸序列和方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于鑒別飼料中羊肉骨粉成分的試劑盒和寡核苷酸，具體涉及一組鑒別羊肉骨粉成分的寡核苷酸，見序列表SEQ ID No.3至SEQ ID No.4所示的寡核苷酸序列，及含有這些寡核苷酸的試劑盒及其檢測(cè)方法，本發(fā)明所述的試劑盒靈敏度高、特異性強(qiáng)、成本低、操作簡(jiǎn)便。
【專利說明】-種鑒別飼料中羊乳成分和羊肉骨粉成分的核苷酸序列和 方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及檢驗(yàn)檢疫和生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地說，涉及一種鑒別飼料中羊乳成分 和羊肉骨粉成分的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 羊癢病是與瘋牛病密切相關(guān)的一類動(dòng)物傳染病。為防止羊癢病通過相關(guān)產(chǎn)品的貿(mào) 易傳入我國(guó)，我國(guó)頒布了貿(mào)易禁令對(duì)該病進(jìn)行防控。1996年7月，我國(guó)農(nóng)業(yè)部就發(fā)布了《關(guān) 于嚴(yán)防癢病傳入我國(guó)的通知（農(nóng)檢疫發(fā)〔1996〕7號(hào)）》，規(guī)定"禁止從上述有癢病的國(guó)家口 (包括直接進(jìn)口和轉(zhuǎn)口）羊、羊胚胎、羊精液、羊內(nèi)臟（含腸衣）及其制品、肉骨粉、骨粉、羊 月旨（油）以及含有羊蛋白的動(dòng)物飼料等"。
[0003] 飼料和飼料添加劑生產(chǎn)中可能添加的來源于牛羊的原料包括：肉粉、骨粉、血液及 其制品、內(nèi)臟及其制品、奶及其制品。在這些可能原料中，除奶及其制品是允許在進(jìn)口飼料 及添加劑中存在的之外，其它成分都是不允許添加的。
[0004] 目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于同一種屬不同組織成分來源的鑒別研究還比較少，主要有酶聯(lián)免 疫吸附法（ELISA)、氯仿分離后PCR檢測(cè)法、水和次氯酸鈉洗滌后PCR檢測(cè)法，這些方法的使 用范圍很窄，且特異性不高，因此也很少在實(shí)際中應(yīng)用。目前我國(guó)對(duì)進(jìn)口動(dòng)物飼料和飼料添 加劑的把關(guān)主要采用普通PCR方法或?qū)崟r(shí)熒光PCR方法對(duì)飼料中是否含有羊源性成分進(jìn)行 檢測(cè)，但這類方法是對(duì)種屬來源進(jìn)行鑒別，無法對(duì)成分的組織來源進(jìn)行鑒別和區(qū)分，即無法 區(qū)分其中添加的是允許添加的乳源性成分，還是加入了貿(mào)易禁令范圍內(nèi)的組織成分。本技 術(shù)建立的是一種可以對(duì)飼料中的羊源性成分進(jìn)行組織來源鑒別的檢測(cè)方法，對(duì)飼料中貿(mào)易 禁令范圍內(nèi)和范圍外的羊源性組織成分進(jìn)行鑒別，滿足進(jìn)境飼料和飼料添加劑中羊癢病危 險(xiǎn)物質(zhì)檢測(cè)的需要，以實(shí)現(xiàn)科學(xué)、有效的執(zhí)法把關(guān)，同時(shí)也可用來規(guī)范我國(guó)的飼料生產(chǎn)，保 障畜產(chǎn)品安全和人民生命健康。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的第一個(gè)技術(shù)問題是提供一種用于鑒別羊肉骨粉成分的寡核苷酸。
[0006] 本發(fā)明要解決的第二個(gè)技術(shù)問題是提供一種靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便的用 于鑒別羊肉骨粉成分的試劑盒。
[0007] 本發(fā)明要解決的第三個(gè)技術(shù)問題是提供一種鑒別飼料中羊肉骨粉成分的方法。
[0008] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0009] 本發(fā)明提供了用于鑒別羊肉骨粉成分的組織標(biāo)的物：羊骨粘連蛋白mRNA的一段 117bp的核糖核酸序列（第309位-第425位），其具有如序列表SEQ ID No. 1所示的堿基 序列。
[0010] 5 ' -CCCCAUCGGCGA⑶UUGAGAAGGUGUGCAGCAAUGACAACAAGACCUUCGACUCUUCCUGCCACUU CUUUGCCACCAAGUGCACACUGGAGGGCACCAAGAAGGGCCACAAGCUCCA-3，
[0011] 其中，羊骨粘連蛋白對(duì)應(yīng)的堿基序列如SEQ ID No. 2所示。
[0012] 根據(jù)上述選取的羊骨粘連蛋白的mRNA序列，本發(fā)明提供了一組用于鑒別羊肉骨 粉成分的寡核苷酸，其具有SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示的堿基序列，具體序列如下：
[0013] 上游引物序列：5' -CCCCATCGGCGAGTTTGA-3'（SEQ ID No. 3)
[0014] 下游引物序列：5' -TGGAGCTTGTGGCCCTTC-3'（SEQ ID No. 4)
[0015] 本發(fā)明還提供了一種靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便的鑒別羊肉骨粉成分的試劑 盒，包括以下試劑：
[0016] I) RT-PCR反應(yīng)液，其包括：
[0017] 上游引物、下游引物、逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq聚合酶和RT-PCR buffer ;
[0018] 其中，上游引物和下游引物分別是SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示的核苷酸序 列；
[0019] 進(jìn)一步地，本發(fā)明所用的逆轉(zhuǎn)錄酶通常為商品化試劑，例如PrimeScript? RT Enzyme Mix II，購(gòu)自Takara公司；本發(fā)明所用的Taq聚合酶通常為商品化試劑，例如 TaKaRa Ex Taq? HS (5U/ μ 1)，購(gòu)自 Takara 公司；本發(fā)明所用的 RT-PCR buffer 通常為 商品化試劑，例如 2 X One Step SYBR? RT-PCR Buffer III，購(gòu)自 Takara 公司。
[0020] 2) RNase Free dH20 ；
[0021] 3)陰性對(duì)照，所述陰性對(duì)照為從羊乳中提取的總RNA ;
[0022] 4)陽(yáng)性對(duì)照，所述陽(yáng)性對(duì)照為從羊肉骨粉中提取的總RNA。
[0023] 本發(fā)明還提供了一種鑒別羊肉骨粉成分的試劑盒的使用方法，該方法基于羊骨粘 連蛋白的mRNA片段序列，并以其作為目標(biāo)片段設(shè)計(jì)特異性引物、通過實(shí)時(shí)熒光RT-PCR鑒別 飼料中羊肉骨粉成分，包括以下步驟：
[0024] 1)取待測(cè)樣品研磨，提取總RNA ;
[0025] 其中，提取總RNA是按照Trizol法或商品化試劑方法等總RNA提取方法來進(jìn)行提 取的；
[0026] 2)進(jìn)行熒光RT-PCR擴(kuò)增，其中使用的引物為序列表SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4 所示的上、下游引物；該反應(yīng)體系按照一步法反應(yīng)體系配制，具體組分及配比見表1 :
[0027] 表1實(shí)時(shí)熒光RT_PCR反應(yīng)體系組分及配比（總體積20 μ 1)
[0028]

【權(quán)利要求】
1. 一組用于鑒別飼料中羊肉骨粉成分的寡核苷酸，其特征在于，其核苷酸序列由SEQ ID No. 3 和 SEQ ID No. 4 所示。
2. 如權(quán)利要求1所述的寡核苷酸在制備用于鑒別飼料中羊肉骨粉成分的試劑盒中的 應(yīng)用。
3. -種用于鑒別飼料中羊肉骨粉成分的試劑盒，其特征在于，由以下組分組成： 1. RT-PCR反應(yīng)液，其包括：上游引物、下游引物、逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq聚合酶和RT-PCR buffer ； 其中，上游引物和下游引物分別是SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示的核苷酸序列； 2. RNase Free dH20 ； 3) 陰性對(duì)照； 4) 陽(yáng)性對(duì)照。
4. 一種鑒別飼料中羊肉骨粉成分的方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 取待測(cè)樣品，提取總RNA ; 2) 進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RT-PCR擴(kuò)增，并繪制擴(kuò)增曲線和溶解曲線，其中使用的引物為序列表 SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示的上、下游引物； 3) 結(jié)果判定： 陰性檢測(cè)結(jié)果：樣品在82°C處未出現(xiàn)溶解峰，則判定樣品中不含有羊肉骨粉成分。 陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果：樣品在82°C處出現(xiàn)溶解峰，則判定樣品中含有羊肉骨粉成分。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104313022SQ201410592070
【公開日】2015年1月28日 申請(qǐng)日期:2014年10月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月29日
【發(fā)明者】李冰玲, 馬貴平, 高志強(qiáng), 劉全國(guó), 李炎鑫, 蒲靜, 史喜菊 申請(qǐng)人:中華人民共和國(guó)北京出入境檢驗(yàn)檢疫局