一種通過(guò)理性調(diào)控生產(chǎn)不同分子量透明質(zhì)酸的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種通過(guò)理性調(diào)控生產(chǎn)不同分子量透明質(zhì)酸的方法，屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明采用獸疫鏈球菌來(lái)源的透明質(zhì)酸合酶hasA整合于枯草芽孢桿菌基因組上表達(dá)，同時(shí)，對(duì)枯草芽孢桿菌中UDP-GlcA和UDP-GlcNAc合成途徑的基因，進(jìn)行模塊化組裝表達(dá)分析，通過(guò)控制不同的UDP-GlcA和UDP-GlcNAc濃度，實(shí)現(xiàn)枯草芽孢桿菌產(chǎn)不同分子量范圍的透明質(zhì)酸。本發(fā)明為高效制備特定分子量范圍的透明質(zhì)酸奠定了一定的基礎(chǔ)，適合于工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用。
【專利說(shuō)明】一種通過(guò)理性調(diào)控生產(chǎn)不同分子量透明質(zhì)酸的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種通過(guò)理性調(diào)控生產(chǎn)不同分子量透明質(zhì)酸的方法，屬于生物工程技 術(shù)領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，簡(jiǎn)稱HA)，又名玻璃酸，是Meyer和Palmer于1934年 首先從牛眼玻璃體中分離出的一種高粘性物質(zhì)，以其獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)，使其具 有良好的保濕性、粘彈性、滲透性和延展性，是目前發(fā)現(xiàn)的自然界中保濕性最好的物質(zhì)。HA 是由N-乙酰氨基葡萄糖和D-葡萄糖醛酸以β-(1-3)和β-(1-4)糖苷鍵連接的雙糖單位 重復(fù)連接組成。根據(jù)不同的生物學(xué)功能，HA按照分子量大小可分為三類：大分子HA(分子 量彡L OXlO6);中分子HA(〈L OX IO4?L OXlO6)以及小分子量HA(彡L OXlO4)。其中， 大分子量的HA和中分子量的HA已經(jīng)廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域和化妝品領(lǐng)域，而小分子量HA由 于能被人體吸收，用于人體自身HA等多糖合成的前體，因而在食品保健領(lǐng)域具有重要的應(yīng) 用前景。
[0003] HA廣泛地存在于各種動(dòng)物組織內(nèi)，如雞冠、關(guān)節(jié)滑液、軟骨、眼玻璃體等，同時(shí)發(fā)現(xiàn) HA也存在于產(chǎn)氣桿菌、綠膿桿菌和A、B、C溶血性鏈球菌等部分細(xì)菌中。由于動(dòng)物提取工 藝復(fù)雜、效率低以及存在病毒種間交叉感染和其它風(fēng)險(xiǎn)性的感染，近些年以來(lái)，透明質(zhì)酸的 獲取已經(jīng)普遍由傳統(tǒng)的動(dòng)物組織提法轉(zhuǎn)變?yōu)槲⑸锇l(fā)酵法，而應(yīng)用最廣的是致病性弱的溶 血性鏈球菌C族菌，如Streptococcus equi和S. zooepidemicus。隨著DNA重組技術(shù)、DNA 測(cè)序技術(shù)以及代謝工程的發(fā)展，構(gòu)建重組工程菌株合成HA也引起了廣泛關(guān)注。不同課題組 已經(jīng)在大腸桿菌（Escherichia coli)、乳酸乳球菌（Lactoccus Iactis)中進(jìn)行了 HA合成 途徑的構(gòu)建。然而，不管動(dòng)物組織提取還是微生物代謝合成HA所獲得的產(chǎn)物分子量范圍不 一，相差甚大，這給所需特定分子量范圍的HA使用帶了一定的困難，特別是給HA的產(chǎn)品質(zhì) 量帶來(lái)較大的影響。因此，如何構(gòu)建微生物重組菌株合成不同分子量HA、尤其是特定范圍分 子量的HA已經(jīng)成為迫切需要解決的問(wèn)題。
[0004] 基于食品安全和醫(yī)療衛(wèi)生越來(lái)越高的要求，本發(fā)明應(yīng)用食品安全級(jí)的枯草芽孢桿 菌發(fā)酵生產(chǎn)HA?？莶菅挎邨U菌（Bacillus subtilis)由于諸多優(yōu)勢(shì)（如安全、好氧生長(zhǎng)、 營(yíng)養(yǎng)條件低、遺傳操作工具完善等）也已被用于HA合成途徑的構(gòu)建。在過(guò)去幾年里，雖然 微生物發(fā)酵合成HA已經(jīng)獲得普遍的應(yīng)用，然而獲得的HA的分子量差別較大，而關(guān)于如何在 食品級(jí)工程菌株BaciIlus subtilis中通過(guò)基因工程技術(shù)直接發(fā)酵獲得不同分子量范圍的 HA尚無(wú)報(bào)道。同時(shí)，構(gòu)建合成不同分子量范圍HA的重組菌株的前提是對(duì)微生物HA分子量 調(diào)控機(jī)理的解析。
[0005] 在微生物體內(nèi)由6-磷酸葡萄糖途徑合成UDP-D-葡萄糖醛酸（UDP-GlcA)，由6-磷 酸葡萄糖變構(gòu)為6-磷酸果糖途徑合成UPD-N-乙酰氨基葡萄糖（UDP-GlcNAc)，再由這兩個(gè) 前體物質(zhì)m)P-GlcNAc和UDP-GlcA交替作為底物，通過(guò)透明質(zhì)酸合酶hasA合成透明質(zhì)酸并 分泌到胞外。本發(fā)明通過(guò)對(duì)HA的兩個(gè)前體物質(zhì)UPD-N-乙酰氨基葡萄糖（UDP-GlcNAc)和 UDP-D-葡萄糖醛酸（UDP-GlcA)的合成途徑進(jìn)行模塊化調(diào)控表達(dá)，進(jìn)而引起胞內(nèi)HA兩個(gè)前 體物濃度的變化，最終引起HA分子量及產(chǎn)量的變化。該發(fā)明操作過(guò)程簡(jiǎn)單，且產(chǎn)品分子量 較集中，易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)制備特定分子量范圍的透明質(zhì)酸。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明提供了一種產(chǎn)透明質(zhì)酸的重組枯草芽孢桿菌，是在重組表達(dá)透明質(zhì)酸合酶 的基礎(chǔ)上，強(qiáng)化透明質(zhì)酸前體物質(zhì)UPD-N-乙酰氨基葡萄糖（UDP-GlcNAc)或UDP-D-葡萄糖 醛酸（UDP-GlcA)的合成途徑。
[0007] 所述強(qiáng)化UPD-N-乙酰氨基葡萄糖（UDP-G1 cNAc)合成途徑，是重組表達(dá)編碼 UDP-N-乙酰氨基葡糖焦磷酸化酶的基因 glmU，或glmU與編碼變位酶的基因 glmM，或glmU 與glmM、編碼乙酰氨基轉(zhuǎn)移酶的基因 glmS，或glmU與glmM、glmS及編碼磷酸葡萄糖異構(gòu)酶 的基因 Pgi。
[0008] 所述強(qiáng)化UDP-D-葡萄糖醛酸（UDP-GlcA)的合成途徑，是重組表達(dá)編碼UDP-葡萄 糖脫氫酶的基因 tuaD，或tuaD與編碼尿苷二磷酸（UDP)-葡萄糖焦磷酸化酶的基因 gtaB， 或tuaD與gtaB、編碼葡萄糖磷酸變位酶的基因 pgcA。
[0009] 所述透明質(zhì)酸合酶編碼基因 hasA可以來(lái)源于獸疫鏈球菌（Streptococcus zooepidemicus)、馬鏈球菌(Streptococcus equi)或類馬鏈球菌(Streptococcus equissp)。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，編碼所述透明質(zhì)酸合酶的基因 hasA來(lái)源于獸疫鏈 球菌，核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0010] 所述葡萄糖磷酸變位酶、尿苷二磷酸（UDP)-葡萄糖焦磷酸化酶、UDP-葡萄糖 脫氫酶、磷酸葡萄糖異構(gòu)酶、乙酰氨基、變位酶和UDP-N-乙酰氨基葡糖焦磷酸化酶可以 來(lái)源于鏈球菌屬（Streptococcus species)、大腸桿菌（Escherichia coli)和芽抱桿菌 (Bacillus)。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，編碼上述所述途徑酶的基因來(lái)源于枯草芽孢桿 菌（Bacillus subtilis);編碼所述UDP-葡萄糖脫氫酶（tuaD)、尿苷二磷酸（UDP)-葡萄 糖焦磷酸化酶（gtaB)、葡萄糖磷酸變位酶（pgcA)、磷酸葡萄糖異構(gòu)酶（pgi)、乙酰氨基轉(zhuǎn)移 酶（glmS)、變位酶（glmM)和UDP-N-乙酰氨基葡糖焦磷酸化酶（glmU)的核苷酸序列分別為 SEQ ID NO. 2-8 所示。
[0011] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，重組表達(dá)基因時(shí)采用的載體可以為枯草芽孢桿菌游 離型表達(dá)載體或者整合基因組用載體。本發(fā)明的一種實(shí)施方式是將透明質(zhì)酸合酶基因 hasA 整合到枯草芽孢桿菌的基因組中進(jìn)行表達(dá)，采用游離型載體PP43NMK表達(dá)UDP-GlcNAc和 UDP-GlcA合成途徑的基因。
[0012] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，重組表達(dá)基因時(shí)，游離型表達(dá)載體上采用組成型啟 動(dòng)子P43(核苷酸序列如SEQ ID NO. 9所示），基因組重組表達(dá)時(shí)采用木糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子 Pxyl (核苷酸序列如SEQ ID NO. 10所示）。
[0013] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述枯草芽孢桿菌為Bacillus subtilis 168。
[0014] 本發(fā)明提供了一系列重組枯草芽孢桿菌，適用于生產(chǎn)不同分子量的HA :
[0015] 采用木糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Pxyl在枯草芽孢桿菌基因組上整合表達(dá)hasA，進(jìn)一步以 PP43NMK載體表達(dá)glmU，發(fā)酵培養(yǎng)重組菌ZHA168/pP43NMK/glmU可生產(chǎn)平均分子量約為150 萬(wàn)道爾頓的HA。
[0016] 采用木糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Pxyl在枯草芽孢桿菌基因組上整合表達(dá)hasA，進(jìn)一步以 PP43NMK載體串聯(lián)表達(dá)glmU、glmM，發(fā)酵培養(yǎng)重組菌株ZHA168/pP43NMK/glmU-glmM可以生 產(chǎn)平均分子量為200萬(wàn)道爾頓的HA。
[0017] 采用木糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Pxyl在枯草芽孢桿菌基因組上整合表達(dá)hasA，進(jìn)一 步以PP43NMK載體串聯(lián)表達(dá)glmU、glmM、glmS，發(fā)酵培養(yǎng)重組菌株ZHA168/pP43NMK/ glmU-glmM-glmS可以獲得平均分子量為235萬(wàn)道爾頓的HA。
[0018] 采用木糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Pxyl在枯草芽孢桿菌基因組上整合表達(dá)hasA，進(jìn)一步 以PP43NMK載體串聯(lián)表達(dá)glmU、glmM、glmS、pgi，發(fā)酵培養(yǎng)重組菌株ZHA168/pP43NMK/ glmU-glmM-glmS-pgi可以獲得平均分子量為260萬(wàn)道爾頓的HA。
[0019] 采用木糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Pxyl在枯草芽孢桿菌基因組上整合表達(dá)hasA，進(jìn)一步以 PP43NMK載體表達(dá)tuaD，發(fā)酵培養(yǎng)重組菌株ZHA168/pP43NMK/tuaD可以獲得平均分子量約 140萬(wàn)道爾頓的HA。
[0020] 采用木糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Pxyl在枯草芽孢桿菌基因組上整合表達(dá)hasA，進(jìn)一步以 PP43NMK載體串聯(lián)表達(dá)tuaD、gtaB，發(fā)酵培養(yǎng)重組菌株ZHA168/pP43NMK/tuaD-gtaB可以獲 得平均分子量約為97萬(wàn)道爾頓的HA。
[0021] 采用木糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Pxyl在枯草芽孢桿菌基因組上整合表達(dá)hasA，進(jìn)一 步以PP43NMK載體串聯(lián)表達(dá)tuaD、gtaB、pgcA，發(fā)酵培養(yǎng)重組菌株ZHA168/pP43NMK/ tuaD-gtaB-pgcA可以獲得平均分子量為89萬(wàn)道爾頓的HA。
[0022] 所述發(fā)酵培養(yǎng)采用的培養(yǎng)基：0.5-2 %酵母粉，1-7 %蔗糖/葡萄糖，磷酸二氫鈉 15. 6g/L，硫酸鉀 3. 9g/L，硫酸鎂(λ 5-2g/L ;在 30-37°C下，發(fā)酵 24-96h。
[0023] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，發(fā)酵溫度控制為37°C，發(fā)酵時(shí)間控制為48h。
[0024] 本發(fā)明還提供了一種理性調(diào)控透明質(zhì)酸合成途徑生產(chǎn)不同分子量透明質(zhì)酸 的方法，是在枯草芽孢桿菌中導(dǎo)入透明質(zhì)酸合酶基因 hasA，通過(guò)分別調(diào)控UDP-GlcA和 UDP-GlcNAc的合成途徑基因，實(shí)現(xiàn)不同分子量范圍的透明質(zhì)酸的生產(chǎn)。通過(guò)過(guò)表達(dá) UDP-GlcA合成途徑基因，提高UDP-GlcA的濃度以降低透明質(zhì)酸的分子量，實(shí)現(xiàn)平均分子 量范圍為89-140萬(wàn)Da的透明質(zhì)酸的合成。通過(guò)過(guò)表達(dá)UDP-GlcNAc合成途徑基因提高 UDP-GlcNAc的濃度，實(shí)現(xiàn)平均分子量為150-260萬(wàn)Da的透明質(zhì)酸的合成。
[0025] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述表達(dá)強(qiáng)化UPD-N-乙酰氨基葡萄糖 (UDP-GlcNAc)合成途徑，是重組表達(dá)編碼UDP-N-乙酰氨基葡糖焦磷酸化酶的基因 glmU，或 glmU與編碼變位酶的基因 glmM，或glmU與glmM、編碼乙酰氨基轉(zhuǎn)移酶的基因 glmS，或glmU 與glmM、glmS及編碼磷酸葡萄糖異構(gòu)酶的基因 pgi。
[0026] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述表達(dá)UDP-D-葡萄糖醛酸（UDP-GlcA)的合成途 徑，是重組表達(dá)編碼UDP-葡萄糖脫氫酶的基因 tuaD，或tuaD與編碼尿苷二磷酸（UDP)-葡 萄糖焦磷酸化酶的基因 gtaB，或tuaD與gtaB、編碼葡萄糖磷酸變位酶的基因 pgcA。
[0027] 本發(fā)明利用枯草芽孢桿菌產(chǎn)透明質(zhì)酸，與其他工程菌相比，該發(fā)明具有非常大的 應(yīng)用優(yōu)勢(shì)。首先，本發(fā)明過(guò)程中使用的宿主為食品級(jí)，完全滿足醫(yī)療衛(wèi)生和食品安全的要 求，無(wú)內(nèi)毒素和病原感染的風(fēng)險(xiǎn)，不會(huì)對(duì)產(chǎn)物的醫(yī)用食品安全帶來(lái)隱患；其次，通過(guò)分別調(diào) 控HA兩個(gè)前體物UDP-GlcNAc和UDP-GlcA濃度的變化，可以獲得產(chǎn)不同分子量范圍的HA 生產(chǎn)重組菌株。基于應(yīng)用分析，本發(fā)明方法在工業(yè)上用于制備特定分子量范圍的透明質(zhì)酸 具有潛在而非常廣泛的價(jià)值。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0028] 圖1所示為模塊化重組UDP-GlcA和UDP-GlcNAc合成途徑基因順序示意圖；
[0029] 圖2所示為含有不同組合基因重組質(zhì)粒的枯草芽孢桿菌對(duì)HA的產(chǎn)量影 響：1， ZHA168/pP43匪K/tuaD ;2, ZHA168/pP43匪K/tuaD-gtaB ;3, ZHA168/pP43匪K/ tuaD-gtaB-pgcA ;4, ZHA168/pP43NMK/glmU ;5, ZHA168/pP43NMK/glmU-glmM ;6, ZHA168/ pP43NMK/glmU-glmM-glmS ；7, ZHA168/pP43NMK/glmU-glmM-glmS-pgi〇 ；
[0030] 圖3所示為含有不同組合基因重組質(zhì)粒的枯草芽孢桿菌對(duì)HA的分子量影 響：1， ZHA168/pP43匪K/tuaD ;2, ZHA168/pP43匪K/tuaD-gtaB ;3, ZHA168/pP43匪K/ tuaD-gtaB-pgcA ；4, ZHA168/pP43NMK/glmU ；5, ZHA168/pP43NMK/glmU-glmM ；6, ZHA168/ pP43NMK/glmU-glmM-glmS ；7, ZHA168/pP43NMK/glmU-glmM-glmS-pgi〇

【具體實(shí)施方式】
[0031] 序列表所示為本發(fā)明所述核苷酸序列信息：
[0032] SEQ ID NO. 1序列信息為獸疫鏈球菌來(lái)源的透明質(zhì)酸合成酶編碼序列；SEQ ID NO. 2序列信息為枯草芽孢桿菌來(lái)源的UDP-葡萄糖脫氫酶基因 tuaD編碼序列；SEQ ID NO. 3序列信息為枯草芽孢桿菌來(lái)源的UDP-葡萄糖焦磷酸化酶的基因 gtaB編碼序列；SEQ ID NO. 4序列信息為枯草芽孢桿菌來(lái)源的葡萄糖磷酸變位酶的基因 pgcA的編碼序列；SEQ ID NO. 5序列信息為枯草芽孢桿菌來(lái)源的磷酸葡萄糖異構(gòu)酶基因 pgi的編碼序列；SEQ ID NO. 6序列信息為枯草芽孢桿菌來(lái)源的乙酰氨基轉(zhuǎn)移酶的基因 glmS的編碼序列；SEQ ID NO. 7序列信息為枯草芽孢桿菌來(lái)源的變位酶的基因 glmM的編碼序列；SEQ ID NO. 8序列信 息為枯草芽孢桿菌來(lái)源的UDP-N-乙酰氨基葡糖焦磷酸化酶的基因 glmU的編碼序列；SEQ ID NO. 9序列信息為枯草芽孢桿菌組成型啟動(dòng)子P43的基因序列；SEQ ID NO. 10序列信息 為枯草芽孢桿菌誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Pxyl的基因序列。
[0033] HA發(fā)酵產(chǎn)物分子量檢測(cè)分析方法：使用安捷倫公司的高效液相色譜儀1260進(jìn)行 分析，選擇示差檢測(cè)器RID,使用凝膠色譜柱Ultrahydrogel Linear進(jìn)行分析。流動(dòng)相選擇 0. IM硝酸鈉進(jìn)行洗脫，柱子溫度設(shè)定為40攝氏度，進(jìn)樣量40 μ L，每個(gè)樣品洗脫時(shí)間25min， 使用中國(guó)食品藥品檢定研究院出產(chǎn)的右旋糖酐作為標(biāo)準(zhǔn)品，利用GPC軟件進(jìn)行平均分子質(zhì) 量的計(jì)算。
[0034] 實(shí)施例1整合重組質(zhì)粒pAXOl-hasA的構(gòu)建
[0035] 本發(fā)明所用的透明質(zhì)酸合酶hasA基因來(lái)源于為獸疫鏈球菌Streptococcus zoo印idemicus ATCC 35246,獸疫鏈球菌接種于5ml M17液體培養(yǎng)基，在37°C 200rpm培養(yǎng) 16h。收集菌體，采用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取獸疫鏈球菌株的基因組DNA。
[0036] 根據(jù)已公布的基因組信息序列，分別設(shè)計(jì)引物hasA-F/hasA-R，以提取的基因組 DNA為模板，采用標(biāo)準(zhǔn)的PCR擴(kuò)增體系和程序，擴(kuò)增獲取hasA基因。
[0037] 引物序列信息：5' -3'方向
[0038] hasA-F ：CGCGGATCCATGAGAACATTAAAAAACCTCATAAC
[0039] hasA-R ： TGCATGCATTTATAATAATTTTTTACGTGTTCC
[0040] 在上下游引物兩端分別引入BamHI和SacII限制性酶切位點(diǎn)。PCR擴(kuò)增獲取的 hasA片段和質(zhì)粒pAXOl分別采用BamHI和SacII進(jìn)行雙酶切，采用瓊脂糖凝膠核酸電泳 進(jìn)行切膠回收，回收產(chǎn)物進(jìn)行連接，體系10 μ 1 :1 μ 1雙切的載體，4 μ 1雙切的目的片段， 5 μ I Solution連接酶，16°C連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落PCR驗(yàn)證，陽(yáng) 性重組子進(jìn)行測(cè)序，比對(duì)正確，重組質(zhì)粒pAXOl-hasA構(gòu)建成功。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Bacillus subtilisl68,以20 μ g/ml的紅霉素平板進(jìn)行篩選整合重組子，并對(duì)重組菌株進(jìn)行PCR驗(yàn)證 和測(cè)序驗(yàn)證，對(duì)成功整合Pxyl-hasA的枯草芽孢桿菌菌株命名為ZHA168?；蚪M整合位點(diǎn) 為IacA ( β -半乳糖苷酶基因）。
[0041] 實(shí)施例 2 重組質(zhì)粒 pP43NMK/tuaD，pP43NMK/tuaD_gtaB，pP43NMK/tuaD-gtaB_pgcA 的構(gòu)建
[0042] Bacillus subtilis 168 菌株接種于 5ml LB 培養(yǎng)基，37°C，200rpm 培養(yǎng) 16h。 收集菌體，采用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取獸疫鏈球菌株的基因組DNA。根據(jù)已公布的 Bacillus subtilisl68 基因組信息序列，分別設(shè)計(jì)引物 tuaD-F/tuaD-R、gtaB-F/gtaB-R 和pgcA-F/pgcA-R。在上游引物tuaD-F的5端引入KpnI限制性酶切位點(diǎn)和P43 RBS序列 (AAGAGAGGAATGTACAC)，在下游引物tuaD-R的5端引入XhoI和SacI限制性酶切位點(diǎn)；在 上游引物gtaB-F的5端引入SacI限制性酶切位點(diǎn)和P43 RBS序列，在下游引物gtaB-R的 5端引入XhoI和XbaI限制性酶切位點(diǎn)；在上游引物pgcA-F的5端引入SpeI (XbaI的同尾 酶）限制性酶切位點(diǎn)和P43 RBS序列，在下游引物pgcA-R的5端引入XhoI和XbaI限制性 酶切位點(diǎn)。引物信息如下：
[0043] tuaD-F ：CGGGGTACCAAGAGAGGAATGTACACATGAAAAAAATAGCTGTCATTGG
[0044] tuaD-R ： CCGCTCGAGCGGTACATTCGAGCTCTTATAAATTGACGCTTCCCAAG
[0045] gtaB-F ： CGGGGTACCGAGCTCAAGAGAGGAATGTACACATGAAAAAAGTACGTAAAGC
[0046] gtaB-R ：CCGCTCGAGCGGACTCTAGTCTAGATTAGATTTCTTCTTTGTTTAGTAAACC
[0047] pgcA-F ：GGACTAGTAAGAGAGGAATGTACACATGACTTGGAGAAAGAGCTATG
[0048] pgcA-R ：CCGCTCGAGCGGACTCTAGTCTAGATTATTTTGCTGTTGACTCAACAAT
[0049] 以提取的枯草芽孢桿菌基因組DNA為模板，采用標(biāo)準(zhǔn)的PCR擴(kuò)增體系和程序，分別 擴(kuò)增獲取tuaD、gtaB和pgcA基因。
[0050] 質(zhì)粒pP43NMK采用KpnI和XhoI雙酶切，同時(shí)PCR擴(kuò)增獲得的tuaD基因產(chǎn)物也 采用KpnI和XhoI雙酶切，經(jīng)1 %的瓊脂糖凝膠電泳后，切膠回收目標(biāo)條帶，回收產(chǎn)物進(jìn)行 連接，體系10 μ 1 :1 μ 1雙切的載體，4 μ 1雙切的目的片段，5 μ I Solution連接酶，16°C 連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落PCR驗(yàn)證，陽(yáng)性重組子進(jìn)行測(cè)序，比對(duì)正確， pP43NMK/tuaD質(zhì)粒構(gòu)建成功。
[0051] 同理，按上述操作將重組質(zhì)粒pP43NMK/tuaD進(jìn)行SacI和XhoI雙酶切，gtaB片段 PCR產(chǎn)物也進(jìn)行SacI和XhoI雙酶切?；厥盏膬蓚€(gè)片段進(jìn)行連接，體系10 μ 1 :1 μ 1雙切的 載體，4 μ 1雙切的目的片段，5 μ I Solution連接酶，16°C連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì) 胞，挑取單菌落PCR驗(yàn)證，陽(yáng)性重組子進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果比對(duì)正確，pP43NMK/tuaD-gtaB質(zhì)粒構(gòu) 建成功。
[0052] 在pP43NMK/tuaD_gtaB質(zhì)粒基礎(chǔ)上，按上述操作進(jìn)行pgcA基因的組裝：pP43NMK/ tuaD-gtaB質(zhì)粒采用XbaI和XhoI進(jìn)行雙酶切，而pgcA片段的PCR產(chǎn)物采用SpeI和XhoI 雙酶切，此步采用一對(duì)同尾酶進(jìn)行連接，體系1〇μ 1 :1μ 1雙切的載體，4μ 1雙切的目的片 段，5 μ I Solution連接酶，16°C連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落PCR驗(yàn)證，陽(yáng) 性重組子進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果比對(duì)正確，pP43NMK/tuaD-gtaB-pgcA質(zhì)粒構(gòu)建成功。
[0053] 上述構(gòu)建的三個(gè)重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化ZHA168宿主，獲得三個(gè)重組枯草芽孢 桿菌菌株：ZHA168/pP43NMK/tuaD ;ZHA168/pP43匪K/tuaD-gtaB ;ZHA168/pP43匪K/ tuaD-gtaB-pgcA〇
[0054] 實(shí)施例 3 重組質(zhì)粒 pP43NMK/glmU，pP43NMK/glmU-glmM，pP43NMK/ glmU-glmM-glmS，pP43NMK/glmU-glmM-glmS-pgi 的構(gòu)建
[0055] 根據(jù)已公布的Bacillus subtilis 168基因組信息序列，分別設(shè)計(jì)引物glmU-F/ glmU-R、glmM-F/glmM-R、glmS-F/glmS-R 和 pgi-F/pgi-R。在上游引物 glmU-F 的 5 端引入 KpnI限制性酶切位點(diǎn)和P43 RBS序列，在下游引物glmU-R的5端引入XhoI和XbaI限制性 酶切位點(diǎn)，后續(xù)幾個(gè)基因均采用SpeI和XbaI同尾酶進(jìn)行連接；在上游引物glmM-F的5端 引入SpeI限制性酶切位點(diǎn)和P43 RBS序列，在下游引物glmM-R的5端引入XhoI和XbaI 限制性酶切位點(diǎn)；在上游引物glmS-F的5端引入SpeI限制性酶切位點(diǎn)和P43 RBS序列，在 下游引物glmS-R的5端引入XhoI和XbaI限制性酶切位點(diǎn)。在上游引物pgi-F的5端引 入SpeI限制性酶切位點(diǎn)和P43 RBS序列，在下游引物pgi-R的5端引入XhoI和XbaI限制 性酶切位點(diǎn)。引物信息如下：
[0056] glmU-F ：CGGGGTACCAAGAGAGGAATGTACACATGGATAAGCGGTTTGCAGTTG
[0057] glmU-R ：CCGCTCGAGCGGACTCTAGTCTAGATTATTTTTTATGAATATTTTTCAC
[0058] glmM-F ：GGACTAGTAAGAGAGGAATGTACACATGGGCAAGTATTTTGGAACAGACGG
[0059] glmM-R ：CCGCTCGAGCGGACTCTAGTCTAGATTACTCTAATCCCATTTCTGACCGGAC
[0060] glmS-F ：CGGGGTACCAAGAGAGGAATGTACACATGTGTGGAATCGTAGGTTATATCGG
[0061] glmS-R ：CCGCTCGAGCGGACTCTAGTCTAGATTACTCCACAGTAACACTCTTCGC
[0062] pgi-F ：GGACTAGTAAGAGAGGAATGTACACATGACGCATGTACGCTTTGAC
[0063] pgi-R ：CCGCTCGAGCGGACTCTAGTCTAGATTAATCTTCCAGACGTTTTTCAAGC
[0064] 以提取的枯草芽孢桿菌基因組DNA為模板，采用標(biāo)準(zhǔn)的PCR擴(kuò)增體系和程序，分別 擴(kuò)增獲取glmU、glmM、glmS和pgi基因。
[0065] 質(zhì)粒PP43NMK采用KpnI和XhoI雙酶切，同時(shí)PCR擴(kuò)增獲得的glmU基因產(chǎn)物也 采用KpnI和XhoI雙酶切，經(jīng)1 %的瓊脂糖凝膠電泳后，切膠回收目標(biāo)條帶，回收產(chǎn)物進(jìn)行 連接，體系10 μ 1 :1 μ 1雙切的載體，4 μ 1雙切的目的片段，5 μ I Solution連接酶，16°C 連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落PCR驗(yàn)證，陽(yáng)性重組子進(jìn)行測(cè)序，比對(duì)正確， pP43NMK/glmU質(zhì)粒構(gòu)建成功。在pP43NMK/glmU質(zhì)?；A(chǔ)上，按上述操作分別進(jìn)行g(shù)lmM、 glmS和pgi基因的組裝：pP43NMK/glmU質(zhì)粒采用XbaI和XhoI進(jìn)行雙酶切，而glmM片段 的PCR產(chǎn)物采用SpeI和XhoI雙酶切，此步采用一對(duì)同尾酶進(jìn)行連接，體系10 μ 1 :1μ 1雙 切的載體，4 μ 1雙切的目的片段，5 μ I Solution連接酶，16°C連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化JM109感受 態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落PCR驗(yàn)證，陽(yáng)性重組子進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果比對(duì)正確，pP43NMK/glmU-glmM質(zhì) 粒構(gòu)建成功。按上述操作過(guò)程，成功構(gòu)建后續(xù)兩個(gè)重組質(zhì)粒pP43NMK/glmU-glmM-glmS和 pP43NMK/glmU-glmM-glmS-pgi。
[0066] 上述所有質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序比對(duì)，結(jié)果正確。分別轉(zhuǎn)化ZHA168菌株，獲得四個(gè)重組枯 草芽孢桿菌菌株：ZHA168/pP43NMK/glmU，ZHA168/pP43NMK/glmU-glmM，ZHA168/pP43NMK/ glmU-glmM-glmS，ZHA168/pP43NMK/glmU-glmM-glmS-pgi。
[0067] 實(shí)施例4重組枯草芽孢桿菌菌株的搖瓶發(fā)酵
[0068] 挑取上述構(gòu)建的 8 個(gè)重組菌株：ZHA168、ZHA168/pP43NMK/tuaD、ZHA168/pP43NMK/ tuaD-gtaB、ZHA168/pP43NMK/tuaD-gtaB-pgcA、ZHA168/pP43NMK/glmU、ZHA168/pP43NMK/ glmU-glmM、ZHA168/pP43NMK/glmU-glmM-glmS、ZHA168/pP43NMK/glmU-glmM-glmS-pgi,單 克隆接種于5ml LB培養(yǎng)基，置于200rpm37°C過(guò)夜培養(yǎng)。16h后接種于250ml三角搖瓶（裝 液量25ml)中，發(fā)酵培養(yǎng)基為無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基：2%酵母粉，7%蔗糖，磷酸二氫鈉15. 6g/L，硫 酸鉀3. 9g/L。按10%的接種量轉(zhuǎn)接于搖瓶，置于200rpm37°C培養(yǎng)，在接種后第2h添加2g/ L的木糖進(jìn)行誘導(dǎo)hasA基因表達(dá)，發(fā)酵培養(yǎng)48h。
[0069] 收集發(fā)酵液，IOOOOrpm下室溫離心lOmin。發(fā)酵液上清轉(zhuǎn)移置另一離心管中，加入 2倍體積的無(wú)水乙醇充分混勻沉淀發(fā)酵液中的透明質(zhì)酸。室溫下靜置lh，再IOOOOrpm下室 溫離心20min，去除干凈液體，白色沉淀加入發(fā)酵液等體積的IM NaCl溶液充分溶解，適當(dāng) 稀釋后，采用Bitter-Muir硫酸咔唑法檢測(cè)HA酸含量。從附圖2看出，表達(dá)UDP-GlcNAc途徑 的合成基因，HA的產(chǎn)量逐漸提高，說(shuō)明提高UDP-GlcNAc的濃度有助于HA的合成，重組菌株 ZHA168/pP43NMK/glmU-glmM-glmS 的產(chǎn)量最高，達(dá)到 3. 66g/L。而表達(dá)UDP-GlcA 途徑的合成 基因，隨著表達(dá)基因的增多，HA產(chǎn)量略有降低，重組菌株ZHA168/pP43NMK/tuaD-gtaB-pgcA 產(chǎn)量為2. 3g/L。
[0070] HA產(chǎn)物的分子量測(cè)定結(jié)果如圖3顯示，過(guò)表達(dá)UDP-GlcNAc途徑基因，提高 UDP-GlcNAc的濃度，HA的分子量逐步增大：表達(dá)重組菌株ZHA168/pP43NMK/glmU可以獲 得平均分子量約為150萬(wàn)道爾頓的HA，表達(dá)重組菌株ZHA168/pP43NMK/glmU-glmM可以獲 得平均分子量約為200萬(wàn)道爾頓的HA，表達(dá)重組菌株ZHA168/pP43NMK/glmU-glmM-glmS 可以獲得平均分子量約為235萬(wàn)道爾頓的HA，表達(dá)重組菌株ZHA168/pP43NMK/ glmU-glmM-glmS-pgi可以獲得平均分子量約為260萬(wàn)道爾頓的HA。而提高UDP-GlcA的濃 度，HA分子量降低：表達(dá)重組菌株ZHA168/pP43NMK/tuaD可以獲得平均分子量約為140萬(wàn) 道爾頓的HA，表達(dá)重組菌株ZHA168/pP43NMK/tuaD-gtaB可以獲得平均分子量約為97萬(wàn)道 爾頓的HA，表達(dá)重組菌株ZHA168/pP43NMK/tuaD-gtaB-pgcA可以獲得平均分子量約為89萬(wàn) 道爾頓的HA，相對(duì)于提高UDP-GlcNAc的分子量差別較大結(jié)果。
[0071] 雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開(kāi)如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技 術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范 圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。
【權(quán)利要求】
1. 一種產(chǎn)透明質(zhì)酸的重組枯草芽孢桿菌，是在重組表達(dá)透明質(zhì)酸合酶的基礎(chǔ)上，強(qiáng)化 透明質(zhì)酸前體物質(zhì)UPD-N-乙酰氨基葡萄糖或m)P-D-葡萄糖醛酸的合成途徑。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組枯草芽孢桿菌，其特征在于，所述UDP-D-葡萄糖醛酸合 成途徑包括編碼UDP-葡萄糖脫氫酶的基因tuaD，編碼尿苷二磷酸（UDP)-葡萄糖焦磷酸化 酶的基因gtaB，編碼葡萄糖磷酸變位酶的基因pgcA ;所述UPD-N-乙酰氨基葡萄糖的合成途 徑包括編碼M)P-N-乙酰氨基葡糖焦磷酸化酶的基因glmU，編碼變位酶的基因glmM，編碼乙 酰氨基轉(zhuǎn)移酶的基因glmS，編碼磷酸葡萄糖異構(gòu)酶的基因pgi。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組枯草芽孢桿菌，其特征在于，在重組表達(dá)編碼透明質(zhì)酸 合酶的基因的基礎(chǔ)上，重組表達(dá)編碼M)P-葡萄糖脫氫酶的基因tuaD，或tuaD與編碼尿苷二 磷酸⑴DP)-葡萄糖焦磷酸化酶的基因gtaB，或tuaD與gtaB、編碼葡萄糖磷酸變位酶的基 因 pgcA。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組枯草芽孢桿菌，其特征在于，在重組表達(dá)編碼透明質(zhì)酸 合酶的基因的基礎(chǔ)上，重組表達(dá)編碼M)P-N-乙酰氨基葡糖焦磷酸化酶的基因glmU，或glmU 與編碼變位酶的基因glmM，或glmU與glmM、編碼乙酰氨基轉(zhuǎn)移酶的基因glmS，或glmU與 glmM、glmS及編碼磷酸葡萄糖異構(gòu)酶的基因pgi。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的重組枯草芽孢桿菌，其特征在于，所述透明質(zhì)酸 合酶編碼基因hasA來(lái)源于獸疫鏈球菌（Streptococcus zooepidemicus)、馬鏈球菌 (Streptococcus equi)或類馬鏈球菌（Streptococcus equissp) ;UPD_N_ 乙醜氨基葡萄糖 和UDP-D-葡萄糖醒酸的合成途徑的基因來(lái)源于鏈球菌屬（Streptococcus species)、大腸 桿菌（Escherichia coli)或芽抱桿菌（Bacillus)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組枯草芽孢桿菌，其特征在于，將透明質(zhì)酸合酶基因hasA 整合到枯草芽孢桿菌的基因組中進(jìn)行表達(dá)，采用游離型載體PP43NMK表達(dá)UDP-GlcNAc和 UDP-GlcA合成途徑的基因。
7. -種理性調(diào)控透明質(zhì)酸合成途徑生產(chǎn)不同分子量透明質(zhì)酸的方法，是在枯草芽孢桿 菌中導(dǎo)入透明質(zhì)酸合酶基因hasA，通過(guò)分別調(diào)控UDP-GlcA和UDP-GlcNAc的合成途徑基因 表達(dá)，實(shí)現(xiàn)不同分子量范圍的透明質(zhì)酸的生產(chǎn)。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，通過(guò)過(guò)表達(dá)UDP-GlcA合成途徑基因，提高 UDP-GlcA的濃度以降低透明質(zhì)酸的分子量，實(shí)現(xiàn)平均分子量為89-140萬(wàn)Da的透明質(zhì)酸的 合成。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，通過(guò)過(guò)表達(dá)UDP-GlcNAc合成途徑基因提 高UDP-GlcNAc的濃度，實(shí)現(xiàn)平均分子量為150-260萬(wàn)Da的透明質(zhì)酸的合成。
10. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，以枯草芽孢桿菌為生產(chǎn)菌株，發(fā)酵培養(yǎng) 基：酵母粉5-20g/L，蔗糖/葡萄糖10-70g/L，磷酸二氫鈉15. 6g/L，硫酸鉀3. 9g/L，硫酸鎂 0? 5-2g/L，在 30-37°C 下，發(fā)酵 24-96h。
【文檔編號(hào)】C12P19/26GK104371965SQ201410555750
【公開(kāi)日】2015年2月25日 申請(qǐng)日期:2014年10月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月17日
【發(fā)明者】康振, 陳堅(jiān), 堵國(guó)成, 金鵬 申請(qǐng)人:江南大學(xué)