與華南型黃瓜全雌性狀緊密連鎖的indel分子標(biāo)記及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了與華南型黃瓜全雌性狀緊密連鎖的indel分子標(biāo)記B36-SEQ137，其定位于黃瓜第6號(hào)染色體上，大小為137bp，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。可利用其對華南型全雌黃瓜的育種后代進(jìn)行苗期全雌性檢測，有效地將含有全雌性狀的植株保留下來，淘汰非全雌性狀植株，其在苗期的檢測準(zhǔn)確率可達(dá)97%以上。本發(fā)明不僅能夠加快育種進(jìn)程，降低育種成本，提高育種效率，還能夠推進(jìn)傳統(tǒng)育種向分子育種的轉(zhuǎn)變。本發(fā)明技術(shù)方法具有快速、準(zhǔn)確、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，具有較大的應(yīng)用前景。
【專利說明】與華南型黃瓜全雌性狀緊密連鎖的indel分子標(biāo)記及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及與華南型黃瓜全雌性狀緊密連鎖的indel分子標(biāo)記及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]黃瓜(Cucumis sativus L.)是世界上的主要蔬菜之一。目前我國主要栽培品種有華北型和華南型兩大類型。華南型黃瓜新品種選育發(fā)展迅速，育成了一批新品種，在華南地區(qū)蔬菜生產(chǎn)中發(fā)揮了重要作用，并取得了顯著的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。
[0003]黃瓜性別分化類型豐富多樣，并與黃瓜產(chǎn)量直接相關(guān)。全雌黃瓜具有高產(chǎn)特性，因而在育種上具有較高的應(yīng)用價(jià)值，并得到廣泛的應(yīng)用。
[0004]先前報(bào)道的關(guān)于全雌性狀的分子標(biāo)記主要集中在歐美類型小黃瓜，如美國鮮食全雌黃瓜Marketmore76F，歐洲溫室類型的兩個(gè)全雌黃瓜材料“戴多星”和9110Gt。到目前為止，僅從Marketmore76F中克隆到一個(gè)全雌基因CsACSIG。
[0005]目前，關(guān)于華南型黃瓜全雌基因以及分子標(biāo)記的研究鮮有報(bào)道，而篩選到合適的與目標(biāo)性狀連鎖的分子標(biāo)記，有利于加速育種進(jìn)程，提高育種效率。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種與華南型黃瓜全雌性狀緊密連鎖的indel分子
己 O
[0007]本發(fā)明的另一個(gè)目的在提供與華南型黃瓜全雌性狀緊密連鎖的indel分子標(biāo)記在全雌黃瓜輔助選擇育種中的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是:
與華南型黃瓜全雌性狀緊密連鎖的indel分子標(biāo)記B36-SEQ137，其定位于黃瓜第6號(hào)染色體上，大小為137 bp，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0009]用于PCR擴(kuò)增權(quán)利要求1或2所述indel分子標(biāo)記B36-SEQ137的引物對。其序列如下所示:
Cs-gy-1ndel-F:5’ - GATTCGAAGAAGAAAGGCG -3’ (SEQ ID N0.2)；
Cs-gy-1ndel-R:5’- CATCGAACACATCCACTC-3’ (SEQ ID N0.3)。
[0010]所述的與華南型黃瓜全雌性狀緊密連鎖的indel分子標(biāo)記應(yīng)用于全雌黃瓜輔助選擇育種。
[0011]一種華南型全雌黃瓜的篩選方法，包括如下步驟:
(O以待檢黃瓜植株的基因組DNA為模板，使用權(quán)利要求4的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
(2)對電泳產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，如果產(chǎn)物中含有如SEQ ID N0.1所示的條帶，則該樣品為全雌黃瓜。
[0012]本發(fā)明的有益效果是: 本發(fā)明所提供一種與華南型黃瓜全雌性狀緊密連鎖的indel分子標(biāo)記B36-SEQ137，可利用其對華南型全雌黃瓜的育種后代進(jìn)行苗期全雌性檢測，有效地將含有全雌性狀的植株保留下來，淘汰非全雌性狀植株，其在苗期的檢測準(zhǔn)確率可達(dá)97%以上。本發(fā)明不僅能夠加快育種進(jìn)程，降低育種成本，提高育種效率，還能夠推進(jìn)傳統(tǒng)育種向分子育種的轉(zhuǎn)變。本發(fā)明技術(shù)方法具有快速、準(zhǔn)確、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，具有較大的應(yīng)用前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1為華南型全雌黃瓜的表型圖。
[0014]圖2為華南型全雌黃瓜B36和華南型弱雌黃瓜S6中的indel分子標(biāo)記序列比對。分別以B36和S6的DNA為模板，利用Cs-gy-1ndel-F和Cs-gy-1ndel-R引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將擴(kuò)增產(chǎn)物測序，隨后，將測序結(jié)果進(jìn)行比對。比對結(jié)果顯示全雌標(biāo)記比弱雌標(biāo)記長
12 bp ο
[0015]圖3為‘早青4號(hào)’自交Fl代中部分全雌性狀個(gè)體的indel分子標(biāo)記檢測:“早”為‘早青4號(hào)’，1-35單株個(gè)體為自交Fl代中具有全雌性狀的個(gè)體。
[0016]圖4為‘早青2號(hào)’自交Fl代的indel分子標(biāo)記檢測:“早”為‘早青2號(hào)’，1-38單株個(gè)體為Fl代，其中1-31為全雌表型，32-38為弱雌表型。

【具體實(shí)施方式】
[0017]下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但并不局限于此。
[0018]實(shí)施例1
篩選與華南型黃瓜全雌性狀緊密連鎖的indel分子標(biāo)記:
(1)以華南型全雌黃瓜B36作為母本，華南型弱雌黃瓜S6作為父本，構(gòu)建F2群體；
(2)采用CTAB法提取黃瓜親本、Fl代及F2代幼苗基因組DNA；
(3)以黃瓜基因組DNA為模板，使用引物Cs-gy-1ndel-F(5’ -GATTCGAAGAAGAAAGGCG-3’)(SEQ ID N0.2)和 Cs-gy-1ndel-R (5’-CATCGAACACATCCACTC-3’ ) (SEQ ID N0.3)對DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并進(jìn)行電泳分析；
(4)對黃瓜F2個(gè)體表型(全雌或弱雌)與基因型進(jìn)行比較分析；
(5)確定indel分子標(biāo)記B36-SEQ137為華南型黃瓜全雌性狀連鎖標(biāo)記，其核苷酸序列如下所示:
CATCGAACACATCCACTCCCACAACAATCCCCCGGCAACGGCTTCTCCGGCGGCGGTGGCAATTTCACCATCTCCTCTTTCTCTTTCTCTTTCTCTTTCTCTGCTTTCTCCTCCTCCACGCCTTTCTTCTTCGAATC (SEQ ID N0.1)圖2為華南型全雌黃瓜B36和華南型弱雌黃瓜S6中的indel分子標(biāo)記序列比對，兩者相差 12 bp (CTCTTTCTCTTT)。
[0019]實(shí)施例2
indel分子標(biāo)記B36-SEQ137在全雌黃瓜輔助選擇育種中的應(yīng)用利用引物Cs-gy-1ndel-F和Cs-gy-1ndel-R對‘早青4號(hào)’黃瓜的自交F2代帶有全雌表型的35個(gè)單株進(jìn)行基因型檢測:
(I)黃瓜幼苗DNA的提取
實(shí)驗(yàn)材料為‘早青4號(hào)’黃瓜的自交F2代帶有全雌表型的35個(gè)單株。步驟如下: ①用液氮在2ml的eppendorf管內(nèi)用研件研磨,在液氮快蒸發(fā)干時(shí)迅速加入1000 μ I2%CTAB提取緩沖液，混勻后置于65 °C水浴中溫浴50min (每隔5min搖動(dòng)一次)。
[0020]②靜置至室溫后在4°C下12000rpm離心lOmin，將上清(約800 μ I)轉(zhuǎn)移到新的2ml eppendorf 管。
[0021]③加入等體積的酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)，顛倒混勻，靜置3—5分鐘，在4°C下12000rpm離心1min,將上清液轉(zhuǎn)入新的1.5ml eppendorf管中。
[0022]④加2/3體積340 μ I預(yù)冷的異丙醇，緩慢混勻(緩慢顛倒20次)，置于-20 °〇下培養(yǎng)30min。
[0023]⑤在4°C下13000rpm離心1min,棄上清,加入200-300 μ I預(yù)冷的70%乙醇洗漆DNA沉淀(兩次)，微干。
[0024]⑥加入100 μ I無菌水溶解。
[0025](2) PCR 擴(kuò)增:
PCR 體系(20 μ I)
DNA 模板:5ng
引物正向:0.5μ I 引物反向:0.5μ I dNTP:2.0 μ I (使用濃度 2.0Mm)
Mg2+: 1.2 μ I (使用濃度 2.5mM)
10XPCR buffer:2.0μ I
Taq 酶:0.2μ I
ddH20:補(bǔ)足 20 μ I
PCR擴(kuò)增程序:
94°C預(yù)變性5min后，94°C變性30s，55°C退火30s，72 °C延伸40s，35個(gè)循環(huán)后，72 °C保持7min，然后置于4°C保存待檢測。
[0026](3)凝膠電泳
擴(kuò)增產(chǎn)物在雙垂直非變性濃度為8%的聚丙烯酰胺凝膠上電泳，120V穩(wěn)壓1.5個(gè)小時(shí)，電泳結(jié)束后進(jìn)行0.l%AgN03銀染15min ;銀染后用2%Na0H、0.4%甲醛、0.04%Na2C03顯色，顯色后在燈箱上拍照分析。
[0027](4)擴(kuò)增結(jié)果
如圖3所示，‘早青4號(hào)’黃瓜樣本擴(kuò)增出137 bp (SEQ ID N0.1)和125 bp兩條條帶，被檢測的35個(gè)F2個(gè)體中有34個(gè)含有這兩條條帶或只含有SEQ ID N0.1條帶，僅有第28號(hào)單株一株不含有SEQ ID N0.1條帶，全雌標(biāo)記有效率達(dá)97%以上。
[0028]35個(gè)單株繼續(xù)種植至花期，觀察花朵的雌雄類型，除28號(hào)單株有誤外，其它單株的結(jié)果與PCR擴(kuò)增結(jié)果相一致。
[0029]實(shí)施例3
采用實(shí)施例2的方法對‘早青2號(hào)’黃瓜的自交F2代進(jìn)行檢測，其中1-31為全雌表型，32-38為弱雌表型，檢測結(jié)果為‘早青2號(hào)’黃瓜樣本擴(kuò)增出137 bp (SEQ ID N0.1)和125 bp兩條條帶，弱雌表型單株均不含SEQ ID N0.1條帶，而全雌表型單株均擴(kuò)增出SEQ IDN0.1條帶，全雌標(biāo)記有效率為100%ο (見圖4)。
[0030]35個(gè)單株繼續(xù)種植至花期，觀察花朵的雌雄類型，其結(jié)果與PCR擴(kuò)增結(jié)果相一致。
[0031]以上實(shí)施例僅為介紹本發(fā)明的優(yōu)選案例，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，在不背離本發(fā)明精神的范圍內(nèi)所進(jìn)行的任何顯而易見的變化和改進(jìn)，都應(yīng)被視為本發(fā)明的一部分。
【權(quán)利要求】
1.與華南型黃瓜全雌性狀緊密連鎖的indel分子標(biāo)記B36-SEQ137，其定位于黃瓜第6號(hào)染色體上，大小為137 bp。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的與華南型黃瓜全雌性狀緊密連鎖的indel分子標(biāo)記B36-SEQ137，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
3.用于PCR擴(kuò)增權(quán)利要求1或2所述indel分子標(biāo)記B36-SEQ137的引物對。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所示的用于PCR擴(kuò)增indel分子標(biāo)記B36-SEQ137的引物對，其序列如下所示:
Cs-gy-1ndel-F:5’ - GATTCGAAGAAGAAAGGCG -3’ (SEQ ID N0.2)；
Cs-gy-1ndel-R:5’- CATCGAACACATCCACTC-3’ (SEQ ID N0.3)。
5.權(quán)利要求1或2所述的與華南型黃瓜全雌性狀緊密連鎖的indel分子標(biāo)記應(yīng)用于全雌黃瓜輔助選擇育種。
6.華南型全雌黃瓜的篩選方法，包括如下步驟: (O以待檢黃瓜植株的基因組DNA為模板，使用權(quán)利要求3或4的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增； (2)對電泳產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，如果產(chǎn)物中含有如SEQ ID N0.1所示的條帶，則該樣品為全雌黃瓜。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104313020SQ201410545774
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年10月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月15日
【發(fā)明者】吳廷全, 王瑞, 林毓娥, 金慶敏, 羅少波, 梁肇均, 徐曉美, 鐘玉娟, 孫保娟 申請人:廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所