一株產(chǎn)acc脫氨酶活性的植生拉烏爾菌株srpg-4的篩選方法與用途
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供一株產(chǎn)1，-氨基環(huán)丙烷-羧酸(ACC)脫氨酶活性的植生拉烏爾菌株SRPG-4及篩選方法(富集、初步篩選、再次篩選和鑒定四個(gè)步驟)與用途，該菌株經(jīng)鑒定為植生拉烏爾菌SRPG-4，保藏號(hào)：CGMCC No.9392。本發(fā)明獲得的菌株SRPG-4在ADF培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好，其ACC比酶活力高達(dá)0.832±0.032U/mg。鹽漬化條件下施用SRPG-4菌液對(duì)棉花的發(fā)芽率、成苗率及生物量的積累都有明顯的提高作用，并且可以調(diào)節(jié)生長(zhǎng)素(IAA)的產(chǎn)生量，緩解乙烯(Eth)和細(xì)胞分裂素(ABA)的產(chǎn)生，從而緩解鹽脅迫。本發(fā)明篩選的菌株來(lái)源于西北干旱地區(qū)，對(duì)環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)，應(yīng)用效果穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，因此，利用該菌株開(kāi)發(fā)微生物菌劑，對(duì)解決土壤鹽漬化問(wèn)題具有廣闊的應(yīng)用前景。
CGMCC No9392
20140630
【專(zhuān)利說(shuō)明】-株產(chǎn)ACC脫氨酶活性的植生拉烏爾菌株SRPG-4的篩選方 法與用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物【技術(shù)領(lǐng)域】。更具體的，本發(fā)明涉及一株產(chǎn)ACC脫氨酶活性 的植生拉烏爾菌株SRPG-4的篩選方法與用途及該菌株的解鹽促生作用，該菌株已于2014 年6月30日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC No. 9392,保藏地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)。

【背景技術(shù)】
[0002] 西北地區(qū)是中國(guó)最大的棉花生產(chǎn)區(qū)和優(yōu)質(zhì)商品棉基地，但是為了解決在干旱半干 旱地區(qū)棉花栽培長(zhǎng)期采用膜下滴灌栽培模式所引起的土壤次生鹽堿化造成作物缺苗、斷 壟、產(chǎn)量下降，嚴(yán)重制約了新疆棉花生產(chǎn)與農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展。隨著生活水平的提高，人們對(duì)有 毒化學(xué)品造成農(nóng)副產(chǎn)品污染所導(dǎo)致的直接或間接的危險(xiǎn)和潛在的危害越來(lái)越重視，因此化 學(xué)藥劑與當(dāng)今綠色、有機(jī)農(nóng)業(yè)發(fā)展需求不一致。生物法避免化學(xué)農(nóng)藥造成的弊端，且安全、 有效、持久，稱(chēng)為世界研究的主題。
[0003] 近年來(lái)研究表明，植物根際有益微生物可以促進(jìn)作物的生長(zhǎng)發(fā)育，提高產(chǎn)量，更 可以幫助作物耐受一些逆境條件。因此，利用植物根際促生菌（Plant growth promoting rhizobacteria，PGPR)開(kāi)發(fā)可幫助作物提高對(duì)鹽漬化等逆境的耐受性，并具有良好促生作 用的微生物肥料已日益受到人們的關(guān)注，是一個(gè)重要的發(fā)展方向。
[0004] 以色列希伯來(lái)大學(xué)的Mayaka S等人在以色列南部Arava地區(qū)的干旱鹽漬化土壤 中分離出7株具有ACC脫氨酶活性的根際微生物（Mayaka S，Tirosh T，Glick BR.Plant growth-promoting bacteria that confer resistance to water stress in tomatoes and peppers [J]. Plant Science 2004,166 :525-530)，DNA 分析表明是無(wú)色細(xì)菌。這些微 生物能夠增強(qiáng)番茄耐鹽脅迫的能力，顯著提高番茄幼苗在高鹽環(huán)境中（172mM NaCl)的生長(zhǎng) 量，但其作用機(jī)制可能與其具有的減少幼苗在鹽脅迫下的乙烯釋放量、增加土壤溶液中鉀 離子與磷酸根離子的離子濃度、提高水分有效利用率、減輕鹽脅迫的光合抑制作用等相關(guān)。 另外，加拿大學(xué)者G1 ick BR等對(duì)具有ACC脫氨酶活性的PGPR進(jìn)行研究，認(rèn)為這類(lèi)PGPR能水 解植物體內(nèi)生物合成乙烯的直接前體ACC，產(chǎn)生羥基丁酸和氨，阻止乙烯的釋放。當(dāng)PGPR附 著在種子表皮時(shí)，它能水解ACC，降低種子內(nèi)的乙烯水平，從而促進(jìn)根伸長(zhǎng)解除鹽漬化對(duì)植 物的脅迫。但他也承認(rèn)，此類(lèi)PGPR幫助植物減輕鹽脅迫的作用機(jī)理還包括有其它的一些途 徑，如對(duì)植物內(nèi)源 ABA 的調(diào)控等（Glick BR，Penrose DM，Li J.A model for the lowering of plant ethylene concentrations by plant growth-promoting bacteria[J]. Journal of theoretical biology，1998,190 :63-68)。2012 年烏茲別克斯坦 Dilfuza E 課題組 研究報(bào)道，篩選獲得的綠針假單胞菌TSAU13在鹽漬化土壤中能夠促進(jìn)黃瓜和番茄的生長(zhǎng) 和提高果實(shí)產(chǎn)量，該菌株能夠在植物根際存活2個(gè)月（Dilfuza. E，Gisela H. Effect of plant growth-promoting bacteria on growth and nutrient uptake of cotton and pea in a semi-arid region of Uzbekistan[J]. Journal of Arid Environments,2004, 56 :293-301)。印度Saravanakumar等人研究表明具有ACC脫氨酶活性的熒光假單胞菌 TDK1能夠顯著提高花生的耐鹽性并增加了花生的產(chǎn)量（Saravanakumar D，Samiyappan R. ACC deaminase from Pseudomonas fluorescens mediated saline resistance in groundnut(Arachis hypogea)plants[J]. Journal of applied microbiology. 2007,102 ： 1283-1292.)。另外PGPR也可以通過(guò)調(diào)控一些植物內(nèi)源激素，如生長(zhǎng)素、乙烯和細(xì)胞分離 素來(lái)促進(jìn)作物生長(zhǎng)（Raupach GS，Kolepper JW. Mixtures of plant growth-promoting rhizobacteria enhance biological control of multiple Cucumber pathogens[J]. Phtopathology，1998,88 :1158-1164)，從而緩解鹽脅迫，達(dá)到促生的效果。
[0005] 西北地區(qū)有著獨(dú)特的地理、氣候特征，孕育著獨(dú)特而豐富的微生物資源，基于PGPR 提高作物耐鹽抗逆性的巨大應(yīng)用潛力。選擇可以高效促進(jìn)植物生長(zhǎng)，開(kāi)發(fā)適宜于西北地 區(qū)特殊地理氣候條件的專(zhuān)屬菌種，不但可以豐富生物種質(zhì)資源，還會(huì)為研制菌肥提供物質(zhì) 基礎(chǔ)，同時(shí)降低化學(xué)肥料的使用量，提高化學(xué)肥料的使用率，提高植物抗逆性。然而，目前 還未見(jiàn)報(bào)道一種快捷、可操作的具有解鹽促生特性菌株的篩選方法。本專(zhuān)利從植物-- PGPR--鹽漬化逆境三者間的相互作用關(guān)系入手，從新疆不同鹽漬化區(qū)域土壤中采集土 樣，發(fā)明一種分離篩選具有ACC脫氨酶活性的PGPR的方法及解鹽促生菌株的用途。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種能夠緩解鹽脅迫促進(jìn)作物生長(zhǎng)的功能菌株的篩選方法 及用途，為開(kāi)發(fā)提高鹽漬化耕地土壤中的作物產(chǎn)量和品質(zhì)的微生物菌劑提供技術(shù)保障。
[0007] 本發(fā)明更具體的是提供一種產(chǎn)ACC脫氨酶活性的植生拉烏爾菌株SRPG-4的篩選 方法。
[0008] 本發(fā)明所述的SRPG-4菌為植生拉烏爾菌。其特點(diǎn)在于該菌株以ACC為唯一氮源 的條件下能正常生長(zhǎng)，與無(wú)鹽條件相比，該菌株在鹽漬化環(huán)境條件下能夠更明顯的提高作 物的發(fā)芽率、成苗率和促進(jìn)作物生物量積累的作用。
[0009] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)措施：
[0010] 一種具有ACC脫氨酶活性菌株，其篩選過(guò)程如下：
[0011] 本發(fā)明所述的植生拉烏爾菌株SRPG-4菌株分離自鹽漬化嚴(yán)重的棉田中生長(zhǎng)較好 的棉花根圍，利用初篩培養(yǎng)基DF和ADF培養(yǎng)基富集到具有ACC脫氨酶活性的菌株，再以珍 珠巖為種植基質(zhì)做ACC脫氨酶活性菌株的初步篩選，最后以天然鹽漬化土為種植基質(zhì)做 ACC脫氨酶活性菌株的再次篩選獲得產(chǎn)ACC脫氨酶活性的SRPG-4,經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化和 16Sr DNA鑒定，并與數(shù)據(jù)庫(kù)中已知菌株相應(yīng)序列信息比較，其與菌株R.planticola ACTT 33531的相似度為99%，確定為植生拉烏爾菌。根據(jù)菌株SRPG-4的解鹽促生特性，又在鹽 脅迫條件下接種植生拉烏爾菌SRPG-4,測(cè)定對(duì)棉花生物量的影響。結(jié)果表明SRPG-4菌株對(duì) 鹽漬化土壤中棉花的發(fā)芽率、干重、鮮重和株高都有明顯的提高作用，進(jìn)一步說(shuō)明該菌株具 有緩解鹽脅迫和促進(jìn)作物生長(zhǎng)的功效?？捎糜谥苽滢r(nóng)業(yè)生物肥菌劑，具有生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、周 期短、產(chǎn)品成本低及環(huán)境友好等特點(diǎn)，具有較好開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。
[0012] 本發(fā)明的棉花田間使用方法具體如下：
[0013] 將適量作物種子在菌懸液中浸泡接種4小時(shí)，或者播種后結(jié)合滴灌應(yīng)用。
[0014] 本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn)：
[0015] 利用本發(fā)明篩選的解鹽促生菌株植生拉烏爾菌株SRPG-4(CGMCC No. 9392)，在鹽 脅迫條件下能夠提高作物種子的發(fā)芽率29. 5%、成株率61. 6%，并提高作物鮮重33. 7%、 干重33. 3%、株高15.0%。該菌株促生應(yīng)用效果穩(wěn)定，環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)，可作為生物制劑使 用，不僅可以減少化學(xué)肥料的用量，還可以節(jié)省農(nóng)民開(kāi)支，增加經(jīng)濟(jì)收入，還具有良好的生 態(tài)效益和社會(huì)效益。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】：
[0016] 圖1菌株SRPG-4在DF和ADF培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線(xiàn)
[0017] 圖2不同鹽濃度對(duì)菌株SRPG-4生長(zhǎng)的影響
[0018] 圖3菌株SRPG-4對(duì)棉花幼苗中三種激素含量的影響

【具體實(shí)施方式】
[0019] 下面通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)發(fā)明作進(jìn)一步詳述，以下實(shí)施例只是描述性的，不是限定 性的，不能以此限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0020] 實(shí)施例1 :具有ACC脫氨酶菌株的篩選和鑒定
[0021] 1、DF液體培養(yǎng)基：
[0022] 組分一 ：H3B03 10mg，MnS04 ? H20 11. 19mg，ZnS04 ? 7H20 124. 6mg，CuS04 ? 5H20 78. 22mg，Mo03 lOmg以上溶解于lOOmL滅菌蒸餾水中，-4°C保存；
[0023] 組分二：FeS04 ? 7H20(100mg)溶于10ml滅菌蒸餾水中，-4°C保存；
[0024] 將上述組分一與組分二溶液各取0. lmL，再加入KH2P04 4. 0g，Na2HP04 6 . 0g， MgS04 ? 7H20 0? 2g，葡萄糖 2. 0g，葡糖酸 2. 0g，檸檬酸 2. 0g，（NH4) 2S04 2. 0g，H20 1000ml。
[0025] 2、ADF 培養(yǎng)基：
[0026] 將DF液體培養(yǎng)基中所含（NH4) 2S04替換成ACC，ACC不可高溫滅菌，使用時(shí)先將ACC 配成0. 5M濃度的母液，通過(guò)0. 2 y m的細(xì)菌濾器滅菌，將母液按6mL/L的量添加入經(jīng)高溫滅 菌冷卻后的DF液體培養(yǎng)基（無(wú)（NH4) 2S04)。母液于-20°C保存。
[0027] 3、DF固體培養(yǎng)基：
[0028] 在DF液體培養(yǎng)基添加的Bacto-Agar，添加濃度為1. 8%。
[0029] 4、ADF固體平板：
[0030] 將不添加（NH4) 2S04的DF固體培養(yǎng)基滅菌處理后倒在標(biāo)準(zhǔn)尺寸培養(yǎng)皿中，在超凈 臺(tái)上冷卻凝固后，每皿以30 y mol的量涂布ACC溶液。
[0031] DF是以（NH4)2S04為唯一氮源的基本培養(yǎng)基，ADF是用ACC替換DF培養(yǎng)基中 (nh 4)2so4為唯一氮源的培養(yǎng)基。
[0032] 5、NA培養(yǎng)基（g ? L-1蒸餾水）：
[0033] 牛肉膏 5g，蛋白胨 10g，NaCl 5g，瓊脂 15g，水 1000mL，NaOH 溶液調(diào) pH :7. 0-7. 2。
[0034] 6、篩選過(guò)程：
[0035] 第一步：采樣
[0036] 從新疆主要種植區(qū)典型鹽漬化耕地中采集作物根際土樣。
[0037] 第二步：富集
[0038] 把采集的土樣各稱(chēng)取lg，分別放入盛有50mL滅菌水的三角瓶（容量為150mL)加 入適量滅菌玻璃珠，于200rpm下振蕩30min，待成懸池液后取下，靜置30min，分別吸取lmL 上清液加入盛有50mlNA- 土壤浸提液復(fù)合培養(yǎng)液的150mL三角瓶中，于30°C、200rpm條件 下培養(yǎng)過(guò)夜。從上述培養(yǎng)液中，分別轉(zhuǎn)移lmL,懸浮液至另一 50mL NA-土壤浸提液復(fù)合培養(yǎng) 液的150mL三角瓶中于30°C、200rpm條件下繼續(xù)振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。從第二步培養(yǎng)液中，再分 別轉(zhuǎn)移lmL懸浮液至50mLDF培養(yǎng)液中，30°C、200rpm培養(yǎng)過(guò)夜。最后轉(zhuǎn)移同樣體積（lmL) 的懸浮液至ADF培養(yǎng)液中，進(jìn)行ACC脫氨酶活性菌株篩選（30°C、200rpm培養(yǎng)過(guò)夜）。從各 ADF培養(yǎng)液中，分別吸取250 ii L菌液，涂布于ADF固體培養(yǎng)基上，在30°C下，培養(yǎng)72h。
[0039] 從ADF平板挑取單菌落，（為避免重復(fù)篩選，觀察比較菌落形態(tài)，每樣本挑取大致 相同的2?3個(gè)單菌落）。所篩選菌株再次接種于DF和ADF培養(yǎng)液中，在600nm處測(cè)光密 度，繪制各菌株生長(zhǎng)曲線(xiàn)，以反復(fù)驗(yàn)證各菌株利用ACC為唯一氮源生長(zhǎng)的特性，重復(fù)2次， 操作中凡涉及ACC為唯一氮源的步驟都應(yīng)嚴(yán)格避免其他氮源的污染，各種器皿均需經(jīng)洗液 浸泡過(guò)夜，雙蒸水洗凈。將最終確定具有ACC脫氨酶活性的菌株在NA平板上劃線(xiàn)分純。30°C 下培養(yǎng)48h后，挑取單菌落接種于NA斜面上培養(yǎng)48h，待長(zhǎng)出菌苔后在4°C冰柜保存。此即 為具有ACC脫氨酶活性的菌株SRPG-4。菌落形態(tài)幾乎是透明、乳白色、針尖狀小圓點(diǎn)。 [00 40] 第三步：初篩
[0041] 將上輪篩選得到的具有ACC脫氨酶活性的菌株接種于盛有l(wèi)OOmlNA培養(yǎng)液的 250mL三角瓶中，在200rpm、30°C下?lián)u培48h。搖培結(jié)束后，于8000rpm下將發(fā)酵液離心 lOmin，棄上清，富集菌體。并用滅菌蒸餾水重懸菌體，用分光光度計(jì)調(diào)校各菌懸液的0D值， 使其保持基本一致。
[0042] 將珍珠巖于180°C下干熱滅菌6-8小時(shí)，冷卻后以每發(fā)芽盒35g的量分裝，發(fā)芽盒 提前用75%酒精擦拭，并在紫外燈下照射lOmin。
[0043] 挑選飽滿(mǎn)、大小一致的棉種，用70%的酒精消毒5min，再用0. 1 %升汞溶液對(duì)棉種 浸泡消毒lOmin，用滅菌蒸餾水沖洗3次。之后將適量棉種子在菌懸液中浸泡接種4個(gè)小 時(shí)。對(duì)照棉種子浸于滅菌蒸餾水中。浸好的棉種用吸水紙吸去表面水分后，以30粒/盒的 量均勻播種于發(fā)芽盒中。設(shè)不加鹽對(duì)照（CK-NS)、和加鹽對(duì)照（CK-S)。每個(gè)菌株的處理棉 種同樣設(shè)不加鹽處理（-NS)和加鹽處理（-S)。處理和對(duì)照均設(shè)6個(gè)重復(fù)。種好后，不加鹽 對(duì)照和處理利用Hoagland營(yíng)養(yǎng)液澆灌，加鹽對(duì)照和處理利用含0. 8% NaCl的Hoagland營(yíng) 養(yǎng)液澆灌。并在第三天對(duì)各個(gè)加菌處理補(bǔ)澆50ml菌液（105)。將發(fā)芽盒置于人工智能氣 候箱中培養(yǎng)（光強(qiáng)：300 U mol ? m-2 ? s-1 ;光照：14h ? cf1 ;晝夜溫度：30°C /25°C，相對(duì)濕度： 40% )。于第10天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率，選擇處理后發(fā)芽率顯著高于對(duì)照的菌株進(jìn)行下一輪天然鹽 漬化土的盆栽試驗(yàn)。
[0044] 第四步：復(fù)篩
[0045] 菌懸液的制備和棉種處理同初篩。
[0046] 盆栽試驗(yàn)設(shè)計(jì)：設(shè)置棉種接菌和不接菌兩個(gè)處理，在不接菌處理中設(shè)置鹽漬化土 壤和正常土壤兩個(gè)對(duì)照，每個(gè)處理8個(gè)重復(fù)，將菌株處理的種子每10粒播入裝有無(wú)菌土 (把從田間采來(lái)的鹽漬化土與正常土在160°C干熱滅菌8h)的lOcmXIOcm的盆缽中，播 種深度2cm左右，置于溫室中培養(yǎng)（光強(qiáng)：280 y mol ? m 2 ? s 1 ;光照：24h ? d 1 ;晝夜溫度： 28 °C /25 °C，相對(duì)濕度：40% )，每天澆水一次，水量控制一致。從第8天開(kāi)始統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率，連 續(xù)記錄30天。對(duì)發(fā)芽率顯著高于對(duì)照的篩選菌株進(jìn)行鑒定。
[0047] 第五步：鑒定
[0048] 對(duì)解鹽促生菌SRPG-4進(jìn)行生理生化特性的鑒定以及16S rDNA分子的鑒定，從分 子水平確定解鹽促生菌的種屬。
[0049] 鑒定結(jié)果見(jiàn)表1。
[0050] 表1菌株SRPG-4的生理生化特性
[0051]

【權(quán)利要求】
1. 一株產(chǎn)1，-氨基環(huán)丙烷-羧酸（ACC)脫氨酶活性的植生拉烏爾菌株（Raoultella planticola)SRPG-4菌株，該菌株已在國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局指定的保藏單位保藏，保藏日期 為2014年6月30日，保藏單位名稱(chēng)：中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心 (CGMCC)，保藏號(hào) CGMCC No. 9392。
2. -種如權(quán)利要求1所述菌的篩選方法，包括以下步驟： 富集：用DF和ADF培養(yǎng)基富集到具有ACC脫氨酶活性的菌株，菌株SRPG-4的ACC脫氨 酶比酶活力達(dá)到〇? 832±0. 032U/mg ; 初篩：以珍珠巖為盆栽基質(zhì)進(jìn)行模擬鹽漬化條件進(jìn)行產(chǎn)ACC脫氨酶活性菌株的解鹽促 生特性的初步篩選； 復(fù)篩：以天然鹽漬化土壤為種植基質(zhì)進(jìn)行產(chǎn)ACC脫氨酶活性菌株的解鹽促生特性的再 次篩選； 鑒定保藏：篩選的菌株經(jīng)鑒定為植生拉烏爾菌SRPG-4,保藏號(hào)：CGMCC No. 9392。
3. 權(quán)利要求1所述菌株，其特征在于在以ACC為唯一氮源的條件下能夠很好的生長(zhǎng)，菌 落形態(tài)幾乎是透明、乳白色、針尖狀小圓點(diǎn)，并且可以在含鹽量8% NaCl的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。
4. 權(quán)利要求1所述菌株的特征，該菌株在鹽脅迫條件下能夠提高作物種子的發(fā)芽率 29. 5%、成株率61. 6%和促進(jìn)作物提高鮮重33. 7%、干重33. 3%、株高15. 0%。
5. 權(quán)利要求1所述菌株，該菌株在鹽脅迫條件下可以通過(guò)調(diào)節(jié)作物植株對(duì)生長(zhǎng)素 IAA 產(chǎn)生量的增加，從而緩解了由于鹽脅迫而造成植株中IAA含量的不斷降低。
6. 權(quán)利要求1所述菌株，該菌株可以在鹽脅迫條件下通過(guò)ACC產(chǎn)生的代謝而降低乙烯 含量的產(chǎn)生，從而減輕了鹽脅迫下乙烯對(duì)作物生長(zhǎng)所造成的危害。
7. 權(quán)利要求1所述菌株，該菌株可以在鹽脅迫條件下有效緩解作物內(nèi)源IAA含量的較 快的下降，從而控制內(nèi)源乙烯和ABA量在作物植株中產(chǎn)生。
8. 如上述權(quán)利要求2所述的篩選菌株的鹽漬化條件為含鹽量0. 3-1. 0%，目標(biāo)作物為 棉花、加工番爺、辣椒中的一種。
【文檔編號(hào)】C12N1/20GK104450550SQ201410386848
【公開(kāi)日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年8月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月3日
【發(fā)明者】武占省, 何艷慧, 李春, 凃亮, 樊艷爽 申請(qǐng)人:石河子大學(xué), 北京理工大學(xué)