具有抑菌作用的沙棘籽多肽及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種具有抑菌作用的沙棘籽多肽溶液及其制備方法和應(yīng)用。制備步驟:將沙棘籽渣經(jīng)浸泡處理后,用ProteAX蛋白酶離心取上清液,用截留孔徑為5000Da的超濾膜濃縮分離離心上清液,得到沙棘籽抑菌多肽溶液。抑菌培養(yǎng)試驗(yàn)表明,該多肽溶液在10~20mg/mL濃度范圍內(nèi)對(duì)沙門氏菌、金黃葡萄球菌和綠膿桿菌等常見(jiàn)的腸道致病菌具有明顯的抑制作用。以上沙棘籽多肽可作為飼料添加劑使用。
【專利說(shuō)明】具有抑菌作用的沙棘籽多肽及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及沙棘多肽的制備,具體涉及沙棘籽提油后殘?jiān)脑倮?,是一種具有 抑菌作用的沙棘籽多肽溶液及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 沙棘籽渣為沙棘油加工生產(chǎn)后的廢棄物,通常只有少量用作飼料,大部分都是作 為垃圾廢棄掉。而經(jīng)過(guò)提取沙棘油的沙棘籽渣中的蛋白含量達(dá)27-30%,蛋白資源被浪費(fèi) 掉。目前對(duì)于沙棘籽渣的開(kāi)發(fā)利用極少,主要是關(guān)于提取其中原花青素及黃酮,但是由于 其開(kāi)發(fā)成本較高,而未被廣泛利用。關(guān)于沙棘籽多肽的研究有,黃鵬、蘇寧等人發(fā)表的《沙 棘生物活性肽的制備及功效研究》,此研究通過(guò)酶解法制備出一種具有抗氧化作用多肽,采 用的蛋白酶為細(xì)菌Neutrase中性蛋白酶。連偉帥、高英、王常青等人發(fā)表的《用沙棘籽渣 加工飼料級(jí)活性肽》文章中,制備沙棘籽多肽采用的蛋白酶為堿性蛋白酶,多肽用截留分子 量2000Da和3500Da的超濾膜超濾分離出分子量為2000?3500Da的多肽,該多肽對(duì)大腸 桿菌,金黃色葡萄球菌具有一定的抑制作用。申請(qǐng)?zhí)枮?01310337183. 1的專利申請(qǐng)《一種 具有抑菌作用的沙棘籽多肽的制備方法》,通過(guò)酶解法制備出一種具有抑菌作用的多肽,所 用的酶為酸性蛋白酶-木瓜蛋白酶復(fù)合水解,水解液用500Da的納濾膜納濾,截留分子量為 500Da的以上的多肽。其主要分離出的是小分子鹽類,一些沒(méi)有抑菌效果的大分子物質(zhì)仍然 留在沙棘籽多肽溶液中,干擾抑菌效果。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0003] 本發(fā)明的目的在于提供的一種具有更好抑菌作用的沙棘籽多肽溶液及其制備方 法,以及該多肽溶液在飼料添加劑中應(yīng)用。
[0004] 本發(fā)明提供的一種具有抑菌作用的沙棘籽多肽溶液的制備方法,以沙棘籽渣(沙 棘籽脫脂后的殘?jiān)樵?,?jīng)過(guò)浸泡預(yù)處理后,用Prote AX蛋白酶水解,然后經(jīng)過(guò)離心、 超濾和濃縮后制得,具體包括以下步驟:
[0005] 將沙棘籽漁加水浸泡后,加入ProteAX蛋白酶水解,將水解液放入密閉容器中置 于家用微波爐中滅酶4?10分鐘;然后離心,取上清液,用孔徑為5000Da的超濾膜分離得 到沙棘籽多肽溶液,濃縮到多肽含量2%保存;沙棘籽渣中的蛋白與ProteAX蛋白酶的質(zhì)量 比為 1 : 0· 02 ?0· 05。
[0006] 所述的水解條件為,在ρΗ5· 5?7. 5,溫度45?55 °C條件下水解1?5h。
[0007] 沙棘籽多肽溶液在10?20mg/mL濃度條件下,對(duì)沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和綠 膿桿菌等致病菌具有抑制作用。該沙棘籽多肽溶液可用作飼料添加劑,抑制畜禽腸道疾病 的產(chǎn)生,同時(shí)還可以補(bǔ)充動(dòng)物日常所需要的蛋白等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。
[0008] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:
[0009] ProteAX蛋白酶是我國(guó)允許用于食品工業(yè)的進(jìn)口蛋白酶,該酶是通過(guò)米曲霉發(fā)酵 制成的復(fù)合蛋白酶,2008年引入中國(guó),主要用于植物蛋白水解物如大豆蛋白、魚(yú)蛋白苦味的 去除等工業(yè)領(lǐng)域。本發(fā)明首次將ProteAX蛋白酶用于沙棘籽多肽的制備。ProteAX蛋白酶 制備的沙棘籽多肽溶液不但對(duì)沙門氏菌和金黃色葡萄球菌具有良好的抑制作用,比專利申 請(qǐng)201310337183. 1中公開(kāi)的酸性蛋白酶+木瓜蛋白酶解多肽的效果好,抑菌圈更大,而且 對(duì)綠膿桿菌也有較好的抑菌作用,而酸性蛋白酶+木瓜蛋白酶解多肽對(duì)綠膿桿菌沒(méi)有抑菌 作用。
[0010] 本發(fā)明的沙棘籽多肽去除了 5000Da以上的大分子多肽和蛋白對(duì)抑菌作用的干 擾,而專利申請(qǐng)201310337183. 1中公開(kāi)的沙棘籽多肽未采用該工序。凝膠G50分析表明, 5000Da超濾濾出液的主要多肽為2000Da以下的小分子肽和4000至5000Da中短分子多肽; 凝膠柱層析分離后的抑菌實(shí)驗(yàn)對(duì)比表明,在分子量為2000Da以下的小分子沙棘籽多肽與 4000-5000Da多肽分子協(xié)同作用下,對(duì)沙門氏菌、金黃葡萄球菌和綠膿桿菌有廣譜的抑菌效 果。
[0011] 實(shí)驗(yàn)表明,通過(guò)超濾分離得到的該多肽只有在1〇?20mg/mL濃度條件下,才具有 良好的抑菌效果,高于或低于該濃度范圍抑菌效果較差。原因可能是濃度較低時(shí),溶液中有 效多肽含量少,無(wú)法達(dá)到抑菌作用;濃度偏高時(shí),溶液中糖類等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量增多,營(yíng)養(yǎng)物 質(zhì)促進(jìn)微生物生長(zhǎng)作用掩蓋了多肽的抑菌作用,故只有在10?20mg/mL濃度下才有顯著的 抑囷效果。
[0012] 采用微波加熱滅酶,即將水解液放入密閉塑料容器中,用1000W家用微波爐加 熱4-10分鐘即可達(dá)到酶滅活的作用。常規(guī)沸水浴滅酶時(shí)間長(zhǎng),預(yù)熱和沸水浴的時(shí)間往往 要在20分鐘以上,而長(zhǎng)時(shí)間處于高溫條件下,會(huì)使溶液中多肽與游離氨基酸、游離糖類等 發(fā)生美拉德反應(yīng),另外,多肽在高溫長(zhǎng)時(shí)間作用下易發(fā)生聚合,使溶液中有效多肽成分下 降。本方法的密閉容器的微波滅酶方法,具有滅酶時(shí)間短,對(duì)溶液中有效抑菌多肽成分破 壞少。實(shí)驗(yàn)表明,密閉容器中微波滅酶的多肽水解液其抑菌圈大于煮沸滅酶。而專利申請(qǐng) 201310337183. 1中公開(kāi)的沙棘籽多肽采用的是常規(guī)敞口容器的水浴滅酶。
【專利附圖】
【附圖說(shuō)明】
[0013] 圖1實(shí)施例1沙棘籽多肽樣品對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果圖
[0014] 圖2實(shí)施例1沙棘籽多肽樣品對(duì)沙門氏菌的抑菌效果圖
[0015] 圖3實(shí)施例2沙棘籽多肽樣品抑制沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌濃度梯度 曲線
[0016] 圖4微波滅酶和煮沸滅酶的沙棘籽多肽溶液抑菌效果對(duì)比圖
【具體實(shí)施方式】
[0017] 實(shí)施例1
[0018] 取20g粉碎好的脫脂沙棘籽渣(蛋白含量為30% ),加入300ml蒸餾水,于25°C 下放置8小時(shí)后,調(diào)pH至6. 5,加入0. 18g Prote ΑΧ蛋白酶于50°C下水解3h ;裝入玻璃瓶 中,擰緊蓋子,用1000W的家用微波爐微波滅酶5min,將酶解液以4000r/min離心取上清液, 用截留孔徑5000Da的超濾膜超濾,取濾出液濃縮到多肽含量達(dá)到2%保存。
[0019] 將以上濃縮液稀釋到20mg/ml做抑菌試驗(yàn),采用的細(xì)菌為金黃色葡萄球菌和沙門 氏菌,培養(yǎng)基為營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。培養(yǎng)基煮沸并冷卻至50?60°C時(shí)倒入培養(yǎng)皿中,凝固后 將金黃色葡萄球菌及沙門氏菌分別接種至培養(yǎng)基表面。在培養(yǎng)基表面打直徑3mm的小孔, 孔中點(diǎn)樣品20?30 μ 1,37°C培養(yǎng)48h后觀察到,樣品對(duì)金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的抑菌 圈直徑為9. 8mm(見(jiàn)圖1)和7. 4mm(見(jiàn)圖2),說(shuō)明本樣品對(duì)以上菌有抑制作用。
[0020] 實(shí)施例2
[0021] 取50g粉碎好的脫脂沙棘籽渣(蛋白含量為30% ),加入1000ml蒸餾水,于25°C 下放置10小時(shí)后,調(diào)pH至7. 0,加入0. 45g Prote ΑΧ蛋白酶于46°C下水解4. 5h,裝入密封 的玻璃瓶中,用1000W的家用微波爐微波滅酶7min,將酶解液以4000r/min離心取上清液, 用截留孔徑5000Da的超濾膜超濾,取濾出液濃縮到多肽含量達(dá)到16%。
[0022] 將濃縮液稀釋到5、10、20、40、80、160mg/ml做抑菌試驗(yàn),采用的細(xì)菌為沙門氏菌、 金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌,培養(yǎng)基為營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。培養(yǎng)與觀察方法同實(shí)施例1中所 述,得到濃度抑制曲線(圖3)。由濃度抑制曲線可以看出,對(duì)沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和 綠膿桿菌的最佳多肽抑制濃度為1 〇-20mg/ml。
[0023] 實(shí)施例3
[0024] 取100g粉碎好的脫脂沙棘籽渣(蛋白含量30%),加入1500ml蒸餾水,于25°C下 放置8小時(shí)后,調(diào)pH至7. 0,加入0. 63g Prote AX蛋白酶于55°C下水解1.5h,裝入密封的 玻璃瓶中,用1200W的家用微波爐加熱滅酶lOmin,將酶解液以4000r/min離心取上清液,用 截留孔徑5000Da的超濾膜超濾,取濾出液再用截留孔徑4000Da的超濾膜超濾,取濃縮液分 離出4000至5000Da中短分子多肽,另取濾出液用截留孔徑2000Da的超濾膜超濾,取濾出 液,得到2000Da以下的小分子肽。將不同分子量多肽濃縮到達(dá)到15mg/ml。
[0025] 將以上不同分子量多肽溶液進(jìn)行抑菌試驗(yàn),采用的細(xì)菌為金黃色葡萄球菌和沙 門氏菌,培養(yǎng)基為營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。培養(yǎng)與觀察方法同實(shí)施例1中所述。該樣品對(duì)金黃 色葡萄球菌的抑菌圈直徑為5000Da以下是8. 9mm、5000Da?4000Da是5. 4mm、2000Da 以下是6. 3mm ;對(duì)沙門氏菌的抑菌圈直徑為5000Da以下是7. 2mm、5000Da?4000Da是 4. 7mm、2000Da以下是3. 4mm,說(shuō)明本樣品分子量在2000Da以下的小分子沙棘籽多肽與 4000-5000Da多肽分子協(xié)同作用下抑菌效果最佳。
[0026] 實(shí)施例4
[0027] 取20g粉碎好的沙棘籽渣,加入300ml蒸餾水,于25°C下放置8小時(shí)后,調(diào)pH至 6. 5,加入0. 18g Prote AX蛋白酶于50°C下水解3h,煮沸滅酶15min,將酶解液以4000r/min 離心取上清液,用截留孔徑5000Da的超濾膜超濾,取濾出液濃縮到多肽含量達(dá)到2%。
[0028] 將煮沸滅酶后得到的沙棘多肽溶液與實(shí)施例1中微波滅酶得到的沙棘多肽溶液 做抑菌對(duì)比試驗(yàn),采用的細(xì)菌為金黃色葡萄球菌,培養(yǎng)基為營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。培養(yǎng)與觀察方 法同實(shí)施例1中所述,得到煮沸滅酶、微波滅酶的多肽水解液對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌圈直 徑分別為6. 8mm(見(jiàn)圖4A)和9. 4mm(見(jiàn)圖4B),說(shuō)明微波滅酶的多肽水解液其抑菌作用優(yōu)于 煮沸滅酶。
【權(quán)利要求】
1. 一種具有抑菌作用的沙棘籽多肽溶液的制備方法,其特征在于,將沙棘籽渣加水浸 泡后,加入ProteAX蛋白酶水解,將水解液放入密閉容器中置于家用微波爐中滅酶4?10 分鐘;然后離心,取上清液,用孔徑為5000Da的超濾膜分離得到沙棘籽多肽溶液,濃縮到多 肽含量2%保存;所述的沙棘籽渣中的蛋白與ProteAX蛋白酶的質(zhì)量比為1 : 0.02?0.05。
2. 如權(quán)利要求1所述的一種具有抑菌作用的沙棘籽多肽溶液的制備方法,其特征在 于,所述的水解條件為,在PH5. 5?7. 5,溫度45?55 °C條件下水解1?5h。
3. 如權(quán)利要求1或2所述方法制備的沙棘籽多肽溶液。
4. 如權(quán)利要求3所述的沙棘籽多肽溶液用作飼料添加劑。
【文檔編號(hào)】C12P21/06GK104099393SQ201410352663
【公開(kāi)日】2014年10月15日 申請(qǐng)日期:2014年7月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月23日
【發(fā)明者】王常青, 陳彤 申請(qǐng)人:山西大學(xué)