玉米cbl9基因cds序列的應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及玉米CBL9基因CDS序列的應(yīng)用。本發(fā)明首次提出玉米CBL9基因CDS序列的功能，將玉米CBL9基因CDS序列克隆至植物表達(dá)載體中，并將該載體轉(zhuǎn)入植物體內(nèi)，獲得的轉(zhuǎn)基因植株耐鹽堿、耐滲透脅迫、耐高葡萄糖及ABA脅迫。ZmCBL9蛋白通過(guò)調(diào)控下游相關(guān)基因參與植物耐鹽及滲透脅迫過(guò)程，對(duì)于培育高產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物具有重要意義。
【專(zhuān)利說(shuō)明】玉米CBL9基因CDS序列的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因植物領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及玉米CBL9基因⑶S序列的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]自然界中，植物不同于動(dòng)物無(wú)法逃避逆境只能應(yīng)對(duì)逆境。因此，植物演化形成一套感知逆境脅迫、傳導(dǎo)逆境信號(hào)，并在分子、細(xì)胞和生理水平上響應(yīng)的精細(xì)調(diào)控機(jī)制。眾多研究表明，各種脅迫環(huán)境下均會(huì)引發(fā)植物細(xì)胞中Ca2+濃度的變化。Ca2+濃度在時(shí)空上的變化代表了某種特殊的脅迫信號(hào)，稱(chēng)之為鈣信號(hào)；這其中鈣離子感受器則起了至關(guān)重要的作用，鈣離子感受器可以堅(jiān)持鈣信號(hào)，并通過(guò)與其互作的蛋白來(lái)傳導(dǎo)信號(hào)，調(diào)控下游基因的表達(dá)。
[0003]在植物中Ca2+-Ca2+感受器-作用蛋白-靶基因是關(guān)鍵的調(diào)控途徑。而眾多研究表明，Ca2+感受器可分為響應(yīng)型感受器(sensor responders)和依賴(lài)型感受器(sensorrelays)。前者既能結(jié)合Ca2+，又具有蛋白激酶活性，一旦結(jié)合Ca2+即刻改變構(gòu)象，通過(guò)調(diào)控自身分子內(nèi)作用，就可實(shí)現(xiàn)其功能或作用。目前，在植物中研究得比較深入的響應(yīng)型感受器有鈣依賴(lài)型蛋白激酶(CDPK)家族。而依賴(lài)型感受器本身不具有酶活性，結(jié)合Ca2+后必須與其相互作用的蛋白激酶發(fā)生分子間作用，才能實(shí)現(xiàn)其功能。植物中有兩類(lèi)，一種是鈣調(diào)素(CaM);鈣調(diào)素及鈣調(diào)素相關(guān)蛋白是研究最廣泛的一類(lèi)Ca2+結(jié)合蛋白，它含有4個(gè)能夠直接結(jié)合Ca2+的典型的EF-hand結(jié)構(gòu)域，其自身并沒(méi)有酶活性，只有結(jié)合鈣離子活化后才能進(jìn)一步作用于它的目標(biāo)蛋白，并實(shí)現(xiàn)信號(hào)的傳遞。鈣調(diào)素作用的目標(biāo)蛋白包括蛋白激酶、轉(zhuǎn)運(yùn)子、結(jié)構(gòu)蛋白等。另一種是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)為植物所特有的鈣調(diào)磷酸酶B類(lèi)似蛋白(CBL)。它和CaM 一樣，只含有Ca2+的結(jié)合域，不含有激酶區(qū)。CBL與CaM不同的是，它調(diào)控的是一類(lèi)特殊的蛋白激酶，稱(chēng)為 CBL 互作蛋白激酶(CBL-1nteracting protein kinases, CIPKs)。CIPK在N端含有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶區(qū)，并通過(guò)其特有的C末端區(qū)域(C-terminal reg1n)與CBL互作。通過(guò)對(duì)已知的基因組數(shù)據(jù)(包括EST)的掃描分析發(fā)現(xiàn)，CBL和CIPK只存在于植物中，說(shuō)明他們可能是植物所特有的一類(lèi)基因家族，可能出現(xiàn)于植物的早期進(jìn)化中。
[0004]研究表明，在許多植物中均已找到CBLs基因家族的存在；其中，在擬南芥、水稻、玉米和楊樹(shù)中發(fā)現(xiàn)10個(gè)CBLs，在高粱和葡萄中分別發(fā)現(xiàn)6個(gè)和8個(gè)CBLs基因。近年來(lái)對(duì)CBL基因家族的研究主要集中在模式植物擬南芥中，并且已報(bào)道的CBL基因大多參與了擬南芥對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)。AtCBL4/S0S3是最早報(bào)道的在擬南芥應(yīng)對(duì)鹽脅迫時(shí)起重要功能的基因，該基因主要在根中表達(dá)并與AtCIPK24/S0S2互作，后者可以磷酸化NHX7/S0S1將Na+運(yùn)出細(xì)胞，減少體內(nèi)Na+含量；AtCBL10/SCaBP8主要在莖和葉片中表達(dá)，參與了對(duì)Na+區(qū)隔化，降低高鹽對(duì)植物的損害；AtCBLl和AtCBL9通過(guò)參與不同的信號(hào)通路，對(duì)植株響應(yīng)逆境尤其是在對(duì)K+和N03_的吸收過(guò)程中起著重要的作用。AtCBL2和AtCBL3可被光照誘導(dǎo)，并在維持細(xì)胞內(nèi)離子平衡中起著重要的作用。此外，AtCBL5在應(yīng)對(duì)高鹽及滲透脅迫中也起著重要的作用。而AtCBL6、AtCBL7和AtCBL8的功能則未有報(bào)道。對(duì)于玉米CBLs基因的研究?jī)H發(fā)現(xiàn)ZmCBL4在應(yīng)對(duì)高鹽脅迫中起著重要的作用。
[0005]因此，目前對(duì)于植物CBL基因的研究方興未艾，僅有的一些研究結(jié)果只是對(duì)該領(lǐng)域的初步探索，這方面的研究工作基本上是在模式植物擬南芥上進(jìn)行的。對(duì)于重要作物(如水稻、玉米、小麥等)的此類(lèi)基因的研究還鮮有報(bào)道，特別是有關(guān)玉米CBL基因的功能研究尚未見(jiàn)應(yīng)用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供玉米CBL9基因CDS序列的應(yīng)用。
[0007]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供玉米CBL9基因⑶S序列在提高植物耐鹽堿、耐滲透脅迫、耐高葡萄糖及ABA脅迫的能力中的應(yīng)用。
[0008]優(yōu)選地，所述植物為擬南芥等。
[0009]本發(fā)明中涉及的玉米鈣調(diào)磷酸酶B類(lèi)似蛋白9 (ZmCBL9)的氨基酸序列如Seq IDN0.2所示。ZmCBL9基因CDS序列為:
[0010]i)Seq ID N0.1所示的核苷酸序列；或
[0011]ii)Seq ID N0.1所示的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個(gè)或多個(gè)核苷酸且表達(dá)相同功能蛋白質(zhì)的核苷酸序列；或
[0012]iii)在嚴(yán)格條件下與Seq ID N0.1所示序列雜交的核苷酸序列；
[0013]所述嚴(yán)格條件為在含0.1 % SDS的0.1 X SSPE或含0.1% SDS的0.1 X SSC溶液中，在65 °C下雜交，并用該溶液洗膜。
[0014]本發(fā)明還提供含有ZmCBL9基因⑶S序列的載體，出發(fā)載體優(yōu)選為植物雙元表達(dá)載體 ρ3301ο
[0015]本發(fā)明還提供含有上述的載體的工程菌、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
[0016]本發(fā)明還提供一種轉(zhuǎn)基因植株的構(gòu)建方法，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，將上述含有ZmCBL9基因CDS序列的載體轉(zhuǎn)入植物體內(nèi)，篩選轉(zhuǎn)基因植株。
[0017]本發(fā)明還提供一種能夠高效表達(dá)ZmCBL9的轉(zhuǎn)基因植株，該植株表現(xiàn)為對(duì)鹽脅迫的抗性。
[0018]所述轉(zhuǎn)基因植株的構(gòu)建方法如下:
[0019]1、依據(jù)目的基因的序列，設(shè)計(jì)引物，從玉米cDNA擴(kuò)增ZmCBL9基因⑶S序列，與pGEM-Τ載體連接，經(jīng)過(guò)測(cè)序確定所獲得的序列與目的片段一致，所得載體命名為pGEM-ZmCBL9。
[0020]2、將pGEM_ZmCBL9載體及植物表達(dá)載體p3301，分別用Nco I和BstE II進(jìn)行酶切，然后使用T4DNA連接酶，將ZmCBL9片段與p3301的載體片段連接，然后轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，獲得重組克隆，經(jīng)過(guò)PCR檢測(cè)后，將單克隆送測(cè)序，測(cè)序正確的克隆進(jìn)行擴(kuò)繁，提質(zhì)粒,命名為 p3301-ZmCBL9。
[0021]3、用 p3301-ZmCBL9 轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌 GV3101 菌株。
[0022]4、轉(zhuǎn)化擬南芥，獲得純合的轉(zhuǎn)化陽(yáng)性苗株系。
[0023]5、將轉(zhuǎn)基因株系分別在MS、0.7μΜ ΑΒΑ、4%葡萄糖、150mM NaCl和325mM甘露醇的MS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，獲得耐鹽、耐滲透、耐葡萄糖和ABA的轉(zhuǎn)基因材料。
[0024]本發(fā)明進(jìn)一步提供用于擴(kuò)增玉米CBL9基因⑶S序列的引物對(duì)，包括正向引物F5’ -ATGGGGTGCTTCCAT-3’ 和反向引物 R5’ -TCACGTGACGAGATC-3’。
[0025]本發(fā)明首次提出玉米CBL9基因⑶S序列的功能，將玉米CBL9基因⑶S序列克隆至植物表達(dá)載體中，并將該載體轉(zhuǎn)入植物體內(nèi)，獲得的轉(zhuǎn)基因植株耐鹽堿、耐滲透脅迫、耐高葡萄糖及ABA脅迫。ZmCBL9蛋白通過(guò)調(diào)控下游相關(guān)基因參與植物耐鹽及滲透脅迫過(guò)程，對(duì)于培育高產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物具有重要意義。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0026]圖1為本發(fā)明中涉及的植物雙元表達(dá)載體p3301的質(zhì)粒圖譜。
[0027]圖2為本發(fā)明實(shí)施例3中ZmCBL9轉(zhuǎn)基因株系目的基因的PCR檢測(cè)結(jié)果其中，M:Marker ；1:正對(duì)照(以ZmCBL9超表達(dá)載體為PCR模板)；2_11:ZmCBL9不同轉(zhuǎn)基因株系目的基因擴(kuò)增結(jié)果；WT:負(fù)對(duì)照(以野生型擬南芥Col的DNA為PCR模板)。
[0028]圖3為本發(fā)明實(shí)施例4中轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型植株在含有不同脅迫條件的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)情況比較；其中，轉(zhuǎn)35S::ZmCBL9基因擬南芥種子點(diǎn)播在不同脅迫處理?xiàng)l件的MS培養(yǎng)基上，4°C春化3天后，置于22°C培養(yǎng)，10天后觀察生長(zhǎng)狀況轉(zhuǎn)基因株系在不同處理?xiàng)l件平板上的生長(zhǎng)情況，轉(zhuǎn)基因株系L2、L6和LlO長(zhǎng)勢(shì)明顯優(yōu)于野生型WT。
[0029]圖4為本發(fā)明實(shí)施例5中轉(zhuǎn)35S::ZmCBL9擬南芥能夠互補(bǔ)擬南芥cbl9突變體在不同脅迫條件下的敏感表型；其中，轉(zhuǎn)35S::ZmCBL9基因擬南芥種子點(diǎn)播在不同脅迫處理?xiàng)l件的MS培養(yǎng)基上，4°C春化3天后，置于22°C培養(yǎng)，10天后觀察生長(zhǎng)狀況互補(bǔ)株系及突變體在不同處理?xiàng)l件平板上的生長(zhǎng)情況，互補(bǔ)株系(COM)長(zhǎng)勢(shì)明顯優(yōu)于cbl9突變體。

【具體實(shí)施方式】
[0030]以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(Sambrook J&RussellDff, Molecular cloning:a laboratory manual, 2001),或按照制造廠商說(shuō)明書(shū)建議的條件。[0031 ] 實(shí)施例1含有玉米CBL9基因⑶S序列的表達(dá)載體的構(gòu)建
[0032]1、依據(jù)已知目的基因的序列(GenBank:ΝΜ_001157847.1)，設(shè)計(jì)引物(正、反向引物序列分別如Seq ID N0.3和4所示)，從玉米cDNA擴(kuò)增ZmCBL9基因⑶S序列，并用瓊脂糖凝膠試劑盒回收目的片段。
[0033]2、將回收的片段與pGEM-T載體連接，然后轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，獲得陽(yáng)性單克隆，送測(cè)序，經(jīng)過(guò)序列比對(duì)，獲得與原序列一致的單克隆，搖菌并提取該單克隆質(zhì)粒，將其命名為 pGHM-ZmCBL9。
[0034]3、將pGEM-ZmCBL9和p3301質(zhì)粒分別用Nco I和BstE II進(jìn)行酶切，并通過(guò)T4DNA連接酶連接。然后轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，將獲得的陽(yáng)性單克隆送測(cè)序，經(jīng)過(guò)序列比對(duì)正確無(wú)誤后，提質(zhì)粒，將其命名為p3301-ZmCBL9。
[0035]植物雙元表達(dá)載體p3301的質(zhì)粒圖譜如圖1所示。
[0036]實(shí)施例2含有玉米CBL9基因⑶S序列的轉(zhuǎn)基因植株的獲得
[0037]1、將構(gòu)建好的超表達(dá)載體p3301_ZmCBL9轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101。
[0038]2、用沾花浸染(floral dipping)的方法轉(zhuǎn)化野生型擬南芥。
[0039]3、將轉(zhuǎn)化后得到的T1代種子春化3天，然后直接播種到營(yíng)養(yǎng)土中生長(zhǎng)，正常生長(zhǎng)約兩周后，用0.5%。的PPT(phosphinothricin)噴灑T1代擬南芥篩選轉(zhuǎn)化植株(即轉(zhuǎn)35S::ZmCBL9 基因植株)。
[0040]4、由于植物表達(dá)載體p3301中帶有抗PPT(phosphinothricin)的Basta基因，它在轉(zhuǎn)化時(shí)能隨目的基因一起轉(zhuǎn)入植物體，因此在噴施PPT (phosphinothricin)后大部分未轉(zhuǎn)化植株死亡，而轉(zhuǎn)化植株仍然能夠正常生長(zhǎng)。轉(zhuǎn)化植株按照不同株系分別收獲T2代種子。
[0041]5、收獲各轉(zhuǎn)基因株系T2代種子后，用0.5%的NaClO對(duì)種子進(jìn)行消毒處理。然后點(diǎn)種于含有0.5%。的PPT (phosphinothricin)的MS培養(yǎng)基平板中(每個(gè)轉(zhuǎn)基因株系需要約50粒種子)，以野生型為負(fù)對(duì)照。
[0042]6、春化3天后置于22°C光照培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)，一周后觀察幼苗生長(zhǎng)情況。野生型在含0.5 %。的PPT (phosphinothricin)的MS培養(yǎng)基中無(wú)法存活；T2代雜合體轉(zhuǎn)基因株系由于在產(chǎn)生子代的過(guò)程中會(huì)發(fā)生基因分離與自由組合，因此會(huì)有一部分無(wú)PPT(phosphinothricin)抗性的種子出現(xiàn)；只有T2代為純合體轉(zhuǎn)基因株系的種子能全部在含PPT (phosphinothricin)抗性的MS培養(yǎng)基中存活。
[0043]實(shí)施例3含有玉米CBL9基因⑶S序列的轉(zhuǎn)基因植株的PCR鑒定
[0044]1、以提取的陽(yáng)性植株的總DNA為模板，用ZmCBL9基因⑶S序列引物(Seq IDN0.3-4)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，陽(yáng)性植株能夠擴(kuò)增出642bp的條帶，而野生型植株不能擴(kuò)增出目的條帶(圖2)。
[0045]2、收獲各轉(zhuǎn)基因株系T2代種子后，用0.5%的NaClO對(duì)種子進(jìn)行消毒處理。然后點(diǎn)種于含有0.5%。的PPT (phosphinothricin)的MS培養(yǎng)基平板中(每個(gè)轉(zhuǎn)基因株系需要約50粒種子)，以野生型為負(fù)對(duì)照。
[0046]3、春化3天后置于22°C光照培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)，一周后觀察幼苗生長(zhǎng)情況。野生型在含0.5%。的PPT(phosph inothricin)的MS培養(yǎng)基中無(wú)法存活。
[0047]4、T2代雜合體轉(zhuǎn)基因株系由于在產(chǎn)生子代的過(guò)程中會(huì)發(fā)生基因分離與自由組合，因此會(huì)有一部分無(wú)PPT (phosphinothricin)抗性的種子出現(xiàn)；只有T2代為純合體轉(zhuǎn)基因株系的種子能全部在含PPT (phosphinothricin)的MS培養(yǎng)基中存活。
[0048]實(shí)施例4含有玉米CBL9基因⑶S序列的轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株抗逆性的比較
[0049]將35S::ZmCBL9 轉(zhuǎn)基因株系點(diǎn)種在 MS、0.7μΜ ΑΒΑ、4 % 葡萄糖、150mM NaCl 和325mM甘露醇的MS平板上，4°C春化3天，置于22°C，16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗的培養(yǎng)箱中，5天后觀察表型并進(jìn)行分析。從圖3結(jié)果可以看出，野生型在脅迫下子葉發(fā)育遲緩且綠苗率降低，而轉(zhuǎn)基因株系的長(zhǎng)勢(shì)則明顯優(yōu)于野生型植株。此外兩者在正常MS培養(yǎng)基中表型無(wú)明顯差別。
[0050]實(shí)施例5玉米CBL9基因轉(zhuǎn)化擬南芥cbl9突變體后能恢復(fù)其對(duì)不同脅迫處理下的敏感表型
[0051]1、將p3301-ZmCBL9超表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101，用沾花浸染(floraldipping)的方法轉(zhuǎn)化擬南芥cbl9突變體。
[0052]2、將轉(zhuǎn)化后得到的T1代種子春化3天，然后直接播種到營(yíng)養(yǎng)土中生長(zhǎng)，正常生長(zhǎng)約兩周后，用0.5%。的PPT (phosphinothricin)噴灑Tl代擬南芥篩選轉(zhuǎn)化植株。能夠存活的植株即為T(mén)1代植株。
[0053]3、按照不同株系分別收獲種子。用PPT篩選，統(tǒng)計(jì)存活株數(shù)，取符合3:1分離的株系，即為單拷貝的T2代植株。
[0054]4、將T2代存活的植株移至小花盆繁種，收獲得到T3代種子，將其繼續(xù)在含有PPT的MS培養(yǎng)基上篩選，獲得能夠完全存活的純合體株系，收獲其種子則為轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)株系(COM)。
[0055]5、將轉(zhuǎn)35S::ZmCBL9基因互補(bǔ)株系及突變體株系點(diǎn)播在MS、0.7 μ M ΑΒΑ、4%葡萄糖、150mM NaCl和325mM甘露醇的MS平板上，4°C春化3天，置于22°C，16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗的培養(yǎng)箱中，4天后觀察表型并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。從圖4結(jié)果可以看出，突變體在不同脅迫處理下子葉發(fā)育遲緩甚至難以出苗，相對(duì)突變體株系而言，野生型表現(xiàn)稍好而互補(bǔ)株系則表現(xiàn)與野生型相當(dāng)甚至優(yōu)于野生型的表現(xiàn)。
[0056]雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
【權(quán)利要求】
1.玉米CBL9基因⑶S序列在提高植物耐鹽堿、耐滲透脅迫、耐高葡萄糖及ABA脅迫的能力中的應(yīng)用； 其中，所述玉米CBL9基因⑶S序列為: i)SeqID N0.1所示的核苷酸序列；或 ii)SeqID N0.1所示的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個(gè)或多個(gè)核苷酸且表達(dá)相同功能蛋白質(zhì)的核苷酸序列；或 iii)在嚴(yán)格條件下與SeqID N0.1所示序列雜交的核苷酸序列； 所述嚴(yán)格條件為在含0.1% SDS的0.1 X SSPE或含0.1% SDS的0.1 X SSC溶液中，在65 °C下雜交，并用該溶液洗膜。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述植物為擬南芥。
3.含有權(quán)利要求1所述玉米CBL9基因CDS序列的載體，其特征在于，出發(fā)載體為植物雙元表達(dá)載體P3301。
4.含有權(quán)利要 求3所述載體的工程菌。
5.一種轉(zhuǎn)基因植株的構(gòu)建方法，其特征在于，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，將權(quán)利要求3所述載體轉(zhuǎn)入植物體內(nèi)，篩選轉(zhuǎn)基因植株。
6.用于擴(kuò)增權(quán)利要求1所述玉米CBL9基因⑶S序列的引物對(duì)，其特征在于，包括正向引物 F5’ -ATGGGGTGCTTCCAT-3’ 和反向引物 R5’ -TCACGTGACGAGATC-3’。
【文檔編號(hào)】C12N1/21GK104073504SQ201410206189
【公開(kāi)日】2014年10月1日 申請(qǐng)日期:2014年5月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月15日
【發(fā)明者】鄭軍, 張凡, 牟穎熙, 王國(guó)英 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所