抑制KRAS基因表達(dá)的RNAi醫(yī)藥組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種抑制KRAS基因表達(dá)的組合物等，其含有脂質(zhì)粒子，所述脂質(zhì)粒子含有作為藥物的雙鏈核酸和式(I)表示的陽(yáng)離子性脂質(zhì)，所述雙鏈核酸中，反義鏈具有與序列號(hào)1～3中任一的KRAS基因的mRNA的連續(xù)至少19個(gè)堿基的序列互補(bǔ)的堿基序列；式(I)中，R1及R2相同或不同，為碳原子數(shù)為12～24的直鏈狀或支鏈狀的烷基、鏈烯基或炔基，L1及L2相同或不同，為-CO-O-或-O-CO-，a及b相同或不同，為1～3，R3為氫原子、碳原子數(shù)為1～6的烷基或碳原子數(shù)為3～6的鏈烯基。
【專利說(shuō)明】抑制KRAS基因表達(dá)的RNAi醫(yī)藥組合物

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及抑制KRAS基因表達(dá)的組合物、包含該組合物的醫(yī)藥品等。

【背景技術(shù)】
[0002] KRAS屬于RAS家族（分子量約21kDa的具有GTP水解活性的蛋白質(zhì)）。KRAS存在 于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，發(fā)揮將因表皮生長(zhǎng)因子（Epidermal Growth Factor ;EGF)等細(xì)胞外的生 長(zhǎng)因子與其受體的結(jié)合而產(chǎn)生的信號(hào)傳遞到細(xì)胞內(nèi)的作用。KRAS存在激活突變，人的癌中 的約20 %確認(rèn)到激活突變。尤其是，在胰臟癌、大腸癌及肺癌中，高頻率地確認(rèn)到KRAS的激 活突變（參見(jiàn)癌癥研宄（Cancer Res)，2012年，第72卷，p. 2457)。報(bào)道稱，在大腸癌中，作 為抗表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor ;EGFR)抗體藥品的西妥昔單 抗（cetuximab)和帕尼單抗（panitumumab)對(duì)具有KRAS的激活突變的患者無(wú)效（參見(jiàn)"新 英格蘭醫(yī)學(xué)雜志（The New England Journal of Medicine，N Engl J Med) "，2009 年，第 360卷，ρ· 1408，"臨床腫瘤學(xué)雜志（Journal of Clinical Oncology，J Clin Oncol) "，2008 年，第 26 卷，p. 374，"臨床腫瘤學(xué)雜志（Journal of Clinical Oncology，J Clin Oncol)"， 2008年，第26卷，p. 1626)。KRAS被認(rèn)為是抗癌劑的良好靶標(biāo)，多年來(lái)一直在嘗試基于低 分子量藥物研發(fā)來(lái)研發(fā)制造 KRAS抑制劑（參見(jiàn)"癌癥生物學(xué)與治療（Cancer Biology & Therapy) "，2002年，第1卷，p. 599)。然而，目前尚無(wú)以KRAS為靶標(biāo)的對(duì)癌等的有效治療 藥。
[0003] 作為抑制靶基因的表達(dá)的方法，例如已知利用了 RNA干擾（RNA interference，以 下稱為RNAi)的方法等，具體而言，報(bào)道了通過(guò)將具有與作為靶標(biāo)的基因相同的序列的雙 鏈RNA導(dǎo)入到線蟲(chóng)中，從而可特異性地抑制該靶基因表達(dá)的現(xiàn)象（參見(jiàn)"自然（Nature)"， 1998年，第391卷，第6669號(hào)，p. 806-811)。另外發(fā)現(xiàn)，在果蠅中，通過(guò)導(dǎo)入21?23個(gè) 堿基的長(zhǎng)度的雙鏈RNA來(lái)代替長(zhǎng)的雙鏈RNA，也可抑制靶基因的表達(dá)，這被命名為短干擾 RNA(short interfering RNA，siRNA)(參見(jiàn)國(guó)際公開(kāi)第 01/75164 號(hào)小冊(cè)子）。
[0004] 關(guān)于RNAi，在體內(nèi)（in vivo)試驗(yàn)中也得到了大量驗(yàn)證，報(bào)道了使用了 50個(gè)堿基 對(duì)以下的siRNA在胚胎動(dòng)物中的效果（參見(jiàn)美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)第2002-132788號(hào)說(shuō)明書(shū)） 及在成年小鼠中的效果（參見(jiàn)國(guó)際公開(kāi)第03/10180號(hào)小冊(cè)子）。另外，當(dāng)將siRNA靜脈內(nèi)給 予至小鼠胚胎時(shí)，在腎臟、脾臟、肺、胰臟及肝臟各器官中確認(rèn)到了對(duì)特定的基因表達(dá)的抑 制效果（參見(jiàn)"自然?遺傳學(xué)（Nature Genetics) "，2002年，第32卷，第1號(hào)，P. 107-108)。 此外，還報(bào)道了在腦細(xì)胞中直接給予siRNA也可抑制特定的基因的表達(dá)（參見(jiàn)"自然?生物 技術(shù)（Nature Biotechnology) "，2002 年，第 20 卷，第 10 號(hào)，P. 1006-1010) 〇
[0005] KRAS siRNA例如被記載于專利文獻(xiàn)1、專利文獻(xiàn)2等中。
[0006] 含有siRNA類的醫(yī)藥品例如被記載于專利文獻(xiàn)3、專利文獻(xiàn)4、專利文獻(xiàn)5等中。
[0007] 專利文獻(xiàn)3中公開(kāi)了含有siRNA類、和例如1，2_二亞油基氧基-N，N-二甲基 氨基丙烷（DLinDM)等的醫(yī)藥品。出于開(kāi)發(fā)更柔軟的陽(yáng)離子性脂質(zhì)、從而提高脂質(zhì)體 等的膜流動(dòng)性的目的使用了 DLinDMA等，其特征在于，使結(jié)構(gòu)上類似的陽(yáng)離子性脂質(zhì) N- (2, 3-二-(9- (Z)-十八碳烯酰基氧基））-丙烷-1-基-N，N，N-三甲基氯化銨（DOTAP)及 N-[l-(2, 3-二油烯基氧基）丙基]-N，N，N-三甲基氯化銨（DOTMA)的高級(jí)烷基成為至少包 含2處不飽和位點(diǎn)的高級(jí)烷基。另外，專利文獻(xiàn)4中公開(kāi)了含有siRNA類、和例如2, 2-二 亞油基-4-二甲基氨基甲基-[1，3]-二氧戊環(huán)（DLin-K-DM)等的醫(yī)藥。
[0008] 另外，專利文獻(xiàn)5中公開(kāi)了例如反式-3, 4-雙（（(Z)-十八碳-9-烯?；趸┘?基）吡咯烷（化合物1-3)等。
[0009] 專利文獻(xiàn)1 :國(guó)際公開(kāi)第2008/109516號(hào)小冊(cè)子 [0010] 專利文獻(xiàn)2 :國(guó)際公開(kāi)第2010/115206號(hào)小冊(cè)子
[0011] 專利文獻(xiàn)3 :國(guó)際公開(kāi)第2005/121348號(hào)小冊(cè)子
[0012] 專利文獻(xiàn)4 :國(guó)際公開(kāi)第2009/086558號(hào)小冊(cè)子
[0013] 專利文獻(xiàn)5 :國(guó)際公開(kāi)第2011/136368號(hào)小冊(cè)子


【發(fā)明內(nèi)容】

[0014] 發(fā)明所要解決的課題
[0015] 本發(fā)明的目的在于提供一種抑制KRAS基因表達(dá)的組合物、包含該組合物的醫(yī)藥 品等。
[0016] 解決課題的手段
[0017] 本發(fā)明涉及以下的（1)?（23)。
[0018] (1)
[0019] 一種組合物，其含有下述脂質(zhì)粒子，所述脂質(zhì)粒子含有：
[0020] 作為藥物的雙鏈核酸，其具有有義鏈及反義鏈，該有義鏈和該反義鏈具有至少25 個(gè)堿基對(duì)，該反義鏈具有與序列號(hào)1?3中任一的KRAS基因的mRNA的連續(xù)至少19個(gè)堿基 的序列互補(bǔ)的堿基序列，具有最長(zhǎng)為35個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度；和
[0021] 式（I)表示的陽(yáng)離子性脂質(zhì)，
[0022]

【權(quán)利要求】
1. 一種組合物，其含有下述脂質(zhì)粒子，所述脂質(zhì)粒子含有： 作為藥物的雙鏈核酸，所述雙鏈核酸具有有義鏈及反義鏈，該有義鏈和該反義鏈具有 至少25個(gè)堿基對(duì)，該反義鏈具有與序列號(hào)1?3中任一的KRAS基因的mRNA的連續(xù)至少19 個(gè)堿基的序列互補(bǔ)的堿基序列，具有最長(zhǎng)為35個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度；和 式（I)表示的陽(yáng)離子性脂質(zhì)，
式⑴中，R1及R2相同或不同，為碳原子數(shù)為12?24的直鏈狀或支鏈狀的烷基、鏈烯 基或炔基， L1及L2相同或不同，為-CO-O-或-0-C0-， a及b相同或不同，為1?3， R3為氫原子、碳原子數(shù)為1?6的烷基或碳原子數(shù)為3?6的鏈烯基。
2. 如權(quán)利要求1所述的組合物，其中，脂質(zhì)粒子是進(jìn)一步含有式（II)表示的陽(yáng)離子性 脂質(zhì)的脂質(zhì)粒子，
式（II)中，R4及R5相同或不同，為碳原子數(shù)為12?24的直鏈狀或支鏈狀的烷基、鏈 條基或塊基， R6為氫原子、碳原子數(shù)為1?6的烷基、碳原子數(shù)為3?6的鏈烯基、吡咯烷-3-基、哌 啶-3-基、哌啶-4-基或被相同或不同的1?3個(gè)的氨基、單烷基氨基、二烷基氨基、羥基、 烷氧基、氨基甲酰基、單烷基氨基甲?；?、二烷基氨基甲?；⑦量┩榛?、哌啶基或嗎啉基取 代的碳原子數(shù)為1?6的烷基或碳原子數(shù)為3?6的鏈烯基。
3. 如權(quán)利要求2所述的組合物，其中，R4及R5均為十二烷基、十三烷基、十四烷基、 2, 6, 10-三甲基^^一烷基、十五烷基、3, 7, 11-三甲基十二烷基、十六烷基、十七烷基、 十八烷基、6, 10, 14-三甲基十五烷-2-基、十九烷基、2, 6, 10, 14-四甲基十五烷基、二十 烷基、3, 7, 11，15-四甲基十六烷基、二^^一烷基、二十二烷基、二十三烷基、二十四烷基、 (Z)-十四碳-9-稀基、（Z)-十六碳-9-稀基、（Z)-十八碳-6-稀基、（Z)-十八碳-9-稀 基、（E)-十八碳-9-烯基、（Z)-十八碳-11-烯基、（9Z，12Z)_十八碳-9, 12-二烯基、 (92，122，152)-十八碳-9，12，15-三烯基、（2)-二十碳-11-烯基、（112，142)-二十 碳-11，14-二烯基、3, 7, 11-三甲基十二碳-2, 6, 10-三烯基或3, 7, 11，15-四甲基十六 碳-2_條基。
4. 如權(quán)利要求2所述的組合物，其中，R4及R5均為十四烷基、十六烷基、（Z)-十六 碳-9-稀基、（Z)-十八碳-6-稀基、（Z)-十八碳-9-稀基、（9Z, 12Z)-十八碳-9, 12-二稀 基、（Z)-二十碳-11-烯基或（11Z，14Z)-二十碳-11，14-二烯基。
5. 如權(quán)利要求3或4所述的組合物，其中，R6為氫原子、甲基、吡咯烷-3-基、哌 啶-3-基、哌啶-4-基或被相同或不同的1?3個(gè)的氨基、單烷基氨基、二烷基氨基、羥基、 烷氧基、氨基甲?；瓮榛被柞；?、二烷基氨基甲?；⑦量┩榛?、哌啶基或嗎啉基取 代的碳原子數(shù)為1?6的烷基或碳原子數(shù)為3?6的鏈烯基。
6. 如權(quán)利要求1?5中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，R3為氫原子或甲基。
7. 如權(quán)利要求1?6中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，L1及L2為-O-CO-，R1及R2為相同 的十二烷基、十四烷基、十六烷基、十八烷基、二十烷基、二十二烷基、二十四烷基、（Z)-十四 碳-9_稀基、（Z)-十六碳_9_稀基、（Z)-十八碳_6_稀基、（Z)-十八碳_9_稀基、(E)-十八 碳-9-烯基、（Z)-十八碳-11-烯基、（9Z，12Z)-十八碳-9, 12-二烯基、（9Z，12Z，15Z)-十八 碳-9, 12, 15-三烯基、（Z)-二十碳-11-烯基、（11Z，14Z)-二十碳-11，14-二烯基、 3, 7, 11-三甲基十二碳-2, 6, 10-三烯基或3, 7, 11，15-四甲基十六碳-2-烯基。
8. 如權(quán)利要求1?6中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，L1及L2為-C0-0-，R1及R2為 相同的十三烷基、十五烷基、十七烷基、十九烷基、二十一烷基、二十三烷基、（Z)-十三 碳-8_條基、（Z)-十五碳_8_條基、（Z)-十七碳_5_條基、（Z)-十七碳_8_條基、（E)-十七 碳-8-烯基、（Z)-十七碳-10-烯基、（8Z，IlZ)-十七碳-8, 11-二烯基、（8Z，11Z，14Z)-十七 碳-8, 11，14-三烯基、（Z) -十九碳-10-烯基、（10Z，13Z) -十九碳-10, 13-二烯 基、（11Z，14Z)-二十碳-11，14-二烯基、2, 6, 10-三甲基十一碳-1，5, 9-三烯基或 2, 6, 10, 14-四甲基十五碳-1-烯基。
9. 如權(quán)利要求1?8中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，作為藥物含有下述雙鏈核酸，所述 雙鏈核酸具有分別為序列號(hào)4及5、序列號(hào)6及7、序列號(hào)8及9、序列號(hào)4及10或序列號(hào)4 及11的有義鏈及反義鏈。
10. 如權(quán)利要求1?9中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，陽(yáng)離子性脂質(zhì)與該雙鏈核酸形成 復(fù)合體，或者，形成陽(yáng)離子性脂質(zhì)組合中性脂質(zhì)及/或高分子而成的物質(zhì)與該雙鏈核酸的 復(fù)合體。
11. 如權(quán)利要求1?9中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，陽(yáng)離子性脂質(zhì)與該雙鏈核酸形成 復(fù)合體，或者，陽(yáng)離子性脂質(zhì)與中性脂質(zhì)及/或高分子組合而成的物質(zhì)與該雙鏈核酸形成 復(fù)合體，脂質(zhì)粒子是由該復(fù)合體和將該復(fù)合體封入的脂質(zhì)膜構(gòu)成的脂質(zhì)粒子。
12. -種抑制RAS基因的表達(dá)的方法，其特征在于，使用權(quán)利要求1?11中任一項(xiàng)所述 的組合物，向細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入該雙鏈核酸。
13. 如權(quán)利要求12所述的方法，其中，細(xì)胞是位于哺乳類的腫瘤中的細(xì)胞。
14. 如權(quán)利要求12所述的方法，其中，細(xì)胞是位于哺乳類的大腸或胰臟中的細(xì)胞。
15. 如權(quán)利要求12?14中任一項(xiàng)所述的方法，其中，向細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入的方法是通過(guò)靜脈 內(nèi)給予而向細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入的方法。 16. RAS相關(guān)疾病的治療方法，向哺乳動(dòng)物給予權(quán)利要求1?11中任一項(xiàng)所述的組合 物。
17. 如權(quán)利要求16所述的方法，其中，給予的方法是靜脈內(nèi)給予。
18. 癌的治療方法，其中向哺乳動(dòng)物給予權(quán)利要求1?11中任一項(xiàng)所述的組合物。
19. 如權(quán)利要求18所述的方法，其中，給予的方法是靜脈內(nèi)給予。
20. 用于治療RAS相關(guān)疾病的醫(yī)藥品，其包含權(quán)利要求1?11中任一項(xiàng)所述的組合物。
21. 如權(quán)利要求20所述的醫(yī)藥品，其用于靜脈內(nèi)給予。
22. 癌的治療劑，其包含權(quán)利要求1?11中任一項(xiàng)所述的組合物。
23. 如權(quán)利要求22所述的癌的治療劑，其用于靜脈內(nèi)給予。
【文檔編號(hào)】C12N15/09GK104471062SQ201380037777
【公開(kāi)日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2013年7月16日 優(yōu)先權(quán)日:2012年7月16日
【發(fā)明者】直井智幸, 洼山剛之, 榎園淳一, 石井俊彥, 德永昌浩, 畑中劍太朗 申請(qǐng)人:協(xié)和發(fā)酵麒麟株式會(huì)社, 戴瑟納制藥公司