一種獲得瑟伯氏棉五個抗病相關(guān)基因cDNA全長的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種獲得瑟伯氏棉五個抗病相關(guān)基因cDNA全長的方法，包括以下步驟：培育瑟伯氏棉幼苗，制備黃萎病菌孢子懸液；培養(yǎng)缽中接菌誘導(dǎo)，取瑟伯氏棉幼根，提取RNA，合成cDNA第一鏈；利用瑟伯氏棉近緣物種雷蒙地棉PGIP等基因的EST序列，進(jìn)行序列延伸，設(shè)計特異引物完成電子克?。簧厦轕GIP等基因EST的PCR擴(kuò)增、回收，連接在pGEM-T?Easy?Vector上，將PGIP等基因片段轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞DH5α；RACE法克隆cDNA全長，基因組DNA的PCR擴(kuò)增及回收，純化目的片段；PGIP等基因的Real?Time?PCR，序列分析。本發(fā)明提供了一種獲得瑟伯氏棉五個抗病相關(guān)基因cDNA全長的方法，獲得了瑟伯氏棉5個抗黃萎病相關(guān)基因cDNA全長，為今后克隆野生植物基因提供了一套行之有效的技術(shù)路線，具有重要的應(yīng)用價值。
【專利說明】—種獲得瑟伯氏棉五個抗病相關(guān)基因cDNA全長的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于棉花抗病基因克隆領(lǐng)域，尤其涉及一種獲得瑟伯氏棉五個抗病相關(guān)基因cDNA全長的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]NBS-LRR(Nucleotide-binding site, Leucine-rich repeat)類抗病蛋白通過與病菌效應(yīng)因子結(jié)合，其氨基端和LRR結(jié)構(gòu)域發(fā)生構(gòu)象變化，從而使NBS功能域發(fā)揮激酶作用，進(jìn)而由氨基端的 TIR(Toll and human interleukin receptor)或 CC(coiled-coil)功能域激活下游信號傳導(dǎo)，最終在感染部位的細(xì)胞和組織局部發(fā)生壞死的過敏反應(yīng)(Hypersensitive response) (Jones et al, 2006),抵御病原菌的侵染，并避免病原菌進(jìn)一步擴(kuò)散。
[0003]迄今為止，大約70多個R基因已被克隆并鑒定(Liu etal.，2007)。我國對R(resistance)基因的定位和克隆方面也取得了較大的進(jìn)展(陳捷胤，2010 ;張立榮等，2011)。目前，國內(nèi)外研究主要集中在TIR-NBS-LRR類抗病蛋白各功能域的功能(Traut，1994 ；Hulbert et al., 2001 ；Mestre et al., 2006)、抗病蛋白編碼基因之間的互作、及抗病蛋白與上下游信號分子的識別等方面(Zhang et al.，2010)。LRR結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)首先與無毒蛋白的識別(Jones et al.，1997)，并決定特異抗性(Hulbert et al.，2001)。TIR結(jié)構(gòu)域在啟動下游防御信號途徑中起主要作用(Shirasu et al.，2003)，且該結(jié)構(gòu)域多在雙子葉植物中存在(Meyers et al., 2003),而單子葉植物中很少見(Monosi et al.,2004)。該特點可能與雙子葉植物的特異抗性有關(guān)。NBS結(jié)構(gòu)域存在于真核生物的許多蛋白中，這些蛋白對于細(xì)胞的生長、分化 、細(xì)胞骨架的形成、小泡運輸和防御反應(yīng)都有關(guān)鍵性的作用(Panet al., 2000 ；Dangl et al.,2001)。該特征暗示NBS結(jié)構(gòu)域的功能十分廣泛。
[0004]有研究指出，NBS-LRR類基因在植物基因組中呈多拷貝、且往往成簇存在(Meyerset al.，2002)，這或許是植物產(chǎn)生應(yīng)對不同病原物或同種病原物的不同小種特異抗性的遺傳基礎(chǔ)(Meyers et al.，2003)。有報道表明，眾多的NBS-LRR類基因在擬南芥各呈現(xiàn)低水平表達(dá)、并且其中一部分成組織特異性表達(dá)模式。在病原菌誘導(dǎo)下，也只是為數(shù)不多的幾個NBS-LRR類基因呈現(xiàn)表達(dá)水平的改變，而剩余的絕大多數(shù)基因的表達(dá)水平并無變化(Tan etal.，2007)。以上報道暗示，植物在某一病原物浸染下，不是一個NBS-LRR類基因，更不是其全部NBS-LRR類基因在起作用，而是針對該病原物的特定效應(yīng)因子，植物中自身有選擇的幾個NBS-LRR類基因在協(xié)同發(fā)揮作用，進(jìn)而誘導(dǎo)超敏反應(yīng)。
[0005]必須承認(rèn)植物與病原菌相互作用機(jī)制的復(fù)雜性。植物中存在的眾多NBS-LRR類基因是以什么樣的方式在起作用的，植物抗病信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中NBS-LRR類蛋白的上下游因子又是如何將抗病信號一步一步轉(zhuǎn)導(dǎo)下去的，而病原菌釋放的效應(yīng)因子(effector)又具有什么樣的特性和共性。這些問題的解答需要植物病理學(xué)、微生物學(xué)等眾多領(lǐng)域共同的努力，并且預(yù)期需要一個很漫長的過程。
[0006]最近，有研究指出植物實現(xiàn)自身的抗病功能需要成對的NBS-LRR類抗病蛋白的同源或異源互作。多種多樣的NBS-LRR基因?qū)υ谥参锟苟喾N病原菌中協(xié)同起作用Sinapidouet al., 2004 ；Narusaka et al., 2009 ；Birker et al.,2009)。
[0007]目前的研究結(jié)果亦表明，黃萎病菌W株系誘導(dǎo)瑟伯氏棉，4個NBS-LRR類抗病蛋白點(雙向電泳差異點)集中高調(diào)表達(dá)(Zhao et al.，2012)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明實施例的目的在于提供一種獲得瑟伯氏棉五個抗病相關(guān)基因cDNA全長的方法，旨在解決現(xiàn)在獲取野生棉抗病基因方法缺乏的問題。[0009]本發(fā)明實施例是這樣實現(xiàn)的，一種獲得瑟伯氏棉五個抗病相關(guān)基因cDNA全長的方法，該方法包括以下步驟:
[0010]培育瑟伯氏棉幼苗，制備黃萎病菌孢子懸液；
[0011]培養(yǎng)缽中接菌誘導(dǎo)，取瑟伯氏棉幼根，提取RNA,合成cDNA第一鏈；
[0012]利用瑟伯氏棉近緣物種雷蒙地棉PGIP等基因的EST序列，進(jìn)行序列延伸，設(shè)計特異引物完成電子克隆；
[0013]瑟伯氏棉PGIP等基因EST的PCR擴(kuò)增、回收，連接在pGEM-T Easy Vector上，將PGIP等基因片段轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞DH5a ；
[0014]RACE法克隆cDNA全長，基因組DNA的PCR擴(kuò)增及回收，純化目的片段；
[0015]PGIP等基因的Real Time PCR,序列分析。
[0016]進(jìn)一步、培育瑟伯氏棉幼苗的步驟為:
[0017]種子表面用1%。升汞消毒液處理8min，無菌水充分沖洗后，播種于事先高壓滅菌，建筑細(xì)沙:蛭石=6:4的無底紙缽內(nèi)的培養(yǎng)土中，于人工可控溫室晝溫28°C，夜溫25°C，相對濕度60%發(fā)芽，待幼苗第二片真葉展開時接菌，每缽保留3-5株發(fā)育一致的幼苗備用。
[0018]進(jìn)一步、制備黃萎病菌孢子懸液的步驟為:
[0019]黃萎病大麗輪枝菌平板活化后，轉(zhuǎn)接到查彼氏培養(yǎng)基，200rpm，25°C液體培養(yǎng)10天，經(jīng)4層滅菌紗布過濾，無菌水稀釋，制成1.2 X IO7孢子/ml的孢子懸液。
[0020]進(jìn)一步、接菌誘導(dǎo)的條件為:室內(nèi)控制晝溫25°C，夜溫22°C，相對濕度80%。
[0021]進(jìn)一步、瑟伯氏棉PGIP基因cDNA電子克隆的具體步驟為:
[0022]采用雙向電泳差異蛋白的同源蛋白Q93WN4，在NCBI上搜索瑟伯氏棉近緣物種雷蒙地棉PGIP基因的EST序列，利用ClasX進(jìn)行序列延伸，以此序列設(shè)計特異引物:
[0023]F 5' -ACAAAGCAATGAAGCCAGTC-3'
[0024]L 5' -GATCAACAAGCTCGAAGTGG-3'
[0025]以瑟伯氏棉cDNA為底物擴(kuò)增瑟伯氏棉EST。
[0026]進(jìn)一步、PGIP基因cDNA的PCR擴(kuò)增的方法為:
[0027]選取瑟伯氏棉20h第一鏈cDNA，根據(jù)電子克隆結(jié)果設(shè)計特異引物進(jìn)行PCR，每管體系為:HS酶π?χ25μ 1，5端引物2μ 1，3端引物2μ 1，cDNA3yl，超純水18 μ 1，采用Touchdown 程序:95°C lmin*6cycles, 72°C IOmin0
[0028]進(jìn)一步、RACE法克隆cDNA全長的方法為:
[0029]選取接菌20h根的總RNA，反轉(zhuǎn)第一鏈cDNA，以此為模板，以瑟伯棉PGIP基因EST序列設(shè)計引物GPS1，GPS2，擴(kuò)增瑟伯氏棉PGIP基因的3'端和5"端；[0030]①'端和3'端的PCR擴(kuò)增及回收測序:
[0031]
【權(quán)利要求】
1.一種獲得瑟伯氏棉五個抗病相關(guān)基因CDNA全長的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟: 培育瑟伯氏棉幼苗，制備黃萎病菌孢子懸液； 培養(yǎng)缽中接菌誘導(dǎo)，取瑟伯氏棉幼根，提取RNA，合成cDNA第一鏈； 利用瑟伯氏棉近緣物種雷蒙地棉PGIP基因的EST序列，進(jìn)行序列延伸，設(shè)計特異引物完成電子克?。? 瑟伯氏棉PGIP基因EST的PCR擴(kuò)增、回收，連接在pGEM-T Easy Vector上，將PGIP基因片段轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞DH5a ； RACE法克隆cDNA全長，基因組DNA的PCR擴(kuò)增及回收，純化目的片段； PGIP基因的Real Time PCR，序列分析。
2.如權(quán)利要求1所述的獲得瑟伯氏棉五個抗病相關(guān)基因cDNA全長的方法，其特征在于，培育瑟伯氏棉幼苗的步驟為: 種子表面用1%。升汞消毒液處理8min，無菌水充分沖洗后，播種于事先高壓滅菌，建筑細(xì)沙:蛭石=6:4的無底紙缽內(nèi)的培養(yǎng)土中，于人工可控溫室晝溫28°C，夜溫25°C，相對濕度60%發(fā)芽，待幼苗第二片真葉展開時接菌，每缽保留3-5株發(fā)育一致的幼苗備用。
3.如權(quán)利要求1所述的獲得瑟伯氏棉五個抗病相關(guān)基因cDNA全長的方法，其特征在于，制備黃萎病菌孢子懸液的步驟為: 黃萎病大麗輪枝菌平板活化后，轉(zhuǎn)接到培養(yǎng)基，200rpm，25°C液體培養(yǎng)10天，經(jīng)4層滅菌紗布過濾，無菌水稀釋，制成1.2 X IO7孢子/ml的孢子懸液。
4.如權(quán)利要求1所述的獲得瑟伯氏棉五個抗病相關(guān)基因cDNA全長的方法，其特征在于，接菌誘導(dǎo)的條件為:室內(nèi)控制晝溫25°C，夜溫22°C，相對濕度80%。
5.如權(quán)利要求1所述的獲得瑟伯氏棉五個抗病相關(guān)基因cDNA全長的方法，其特征在于，瑟伯氏棉PGIP基因cDNA電子克隆的具體步驟為: 采用雙向電泳差異蛋白的同源蛋白Q93WN4，在NCBI上搜索瑟伯氏棉近緣物種雷蒙地棉PGIP基因的EST序列，利用ClasX進(jìn)行序列延伸，以此序列設(shè)計特異引物:
F 5' -ACAAAGCAATGAAGCCAGTC-3'
L 5' -GATCAACAAGCTCGAAGTGG-3' 以瑟伯氏棉cDNA為底物擴(kuò)增瑟伯氏棉EST。
6.如權(quán)利要求1所述的獲得瑟伯氏棉五個抗病相關(guān)基因cDNA全長的方法，其特征在于，PGIP基因cDNA的PCR擴(kuò)增的方法為: 選取瑟伯氏棉20h第一鏈cDNA，根據(jù)電子克隆結(jié)果設(shè)計特異引物進(jìn)行PCR，每管體系為:HS 酶 mix25y 1，5 端引物 2μ 1，3 端引物 2μ l,cDNA3y 1，超純水 18 μ 1，采用 Touchdown程序:95°C lmin*6cycles, 72°C IOmin0
7.如權(quán)利要求1所述的獲得瑟伯氏棉五個抗病相關(guān)基因cDNA全長的方法，其特征在于，RACE法克隆cDNA全長的方法為: 選取接菌20h根的總RNA，反轉(zhuǎn)第一鏈cDNA，以此為模板，以瑟伯棉PGIP基因EST序列設(shè)計引物GPS1，GPS2，擴(kuò)增瑟伯氏棉PGIP基因的3'端和5"端； ①'端和3'端的PCR擴(kuò)增及回收 測序:
8.如權(quán)利要求1所述的獲得瑟伯氏棉五個抗病相關(guān)基因cDNA全長的方法，其特征在于，獲得四個NBS-LRR類抗病基因cDNA的方法為: 根據(jù)黃萎病菌誘導(dǎo)下瑟伯氏棉差異表達(dá)蛋白的三個同源蛋白:①煙草的B3V7R2蛋白，②棉白楊的B9INW6蛋白，③擬南芥的Q19EF1蛋白，在NCBI找到最高e-velue的雷蒙地棉的對應(yīng)EST，分別設(shè)計引物，在接菌瑟伯氏棉根中擴(kuò)增到520bp、788bp、643bp和729bp四條EST序列，以此為母序列，通過電子克隆和RACE結(jié)合，得到了四個TIR-NBS-LRR類抗病基因類似物。
【文檔編號】C12N15/29GK103710358SQ201310731988
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2013年12月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月27日
【發(fā)明者】房衛(wèi)平, 趙付安, 謝德意, 李武, 楊曉杰, 趙元明, 呂淑平, 唐中杰, 聶利紅 申請人:河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所