動態(tài)培養(yǎng)制備有序化細(xì)菌纖維素的發(fā)酵反應(yīng)器及制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種動態(tài)培養(yǎng)制備有序化細(xì)菌纖維素的發(fā)酵反應(yīng)器，包括主體容器，所述主體容器的側(cè)壁采用透氧材料，還包括用于驅(qū)動主體容器內(nèi)的液體沿其內(nèi)壁作相對轉(zhuǎn)動的動力裝置。同時本發(fā)明中還提供了一種動態(tài)培養(yǎng)制備有序化細(xì)菌纖維素的方法，包括以下步驟：制備培養(yǎng)基；培養(yǎng)基接種細(xì)菌；動態(tài)發(fā)酵：密封注滿細(xì)菌發(fā)酵液的主體容器后，控制動力裝置的轉(zhuǎn)速為100～500r/min，將發(fā)酵反應(yīng)容器置于30℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)3～7天，得到纖維素凝膠；產(chǎn)物純化。本發(fā)明采用動態(tài)發(fā)酵，工藝簡單，所制備的細(xì)菌纖維素具有定向排列的納米纖維結(jié)構(gòu)、較高的孔隙率和透明度，具有發(fā)酵過程對產(chǎn)物的產(chǎn)量和結(jié)構(gòu)可控性強等優(yōu)點。
【專利說明】動態(tài)培養(yǎng)制備有序化細(xì)菌纖維素的發(fā)酵反應(yīng)器及制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于細(xì)菌纖維素材料的制備領(lǐng)域，涉及一種動態(tài)培養(yǎng)制備有序化細(xì)菌纖維素的裝置及方法。
【背景技術(shù)】
[0002]細(xì)菌纖維素與天然纖維素結(jié)構(gòu)非常相似，都是由葡萄糖以β — 1，4 一糖苷鍵連接而成的高分子化合物。但是細(xì)菌纖維素?fù)碛衅洫毺氐奶匦?(I)高純度、高結(jié)晶度、高聚合度、較大的比表面積和密度；(2)超精細(xì)三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；(3)彈性摸量大、抗張強度以及拉伸強度高；(4)持水能力強，具有很好的形狀保持能力；(5)良好的生物相容性、無毒性；(6)生物合成的可調(diào)控性。采用不同的培養(yǎng)方法、培養(yǎng)條件，可得到性質(zhì)不同的纖維素。
[0003]細(xì)菌纖維素具有以上優(yōu)異的特性，在組織工程支架、人工血管以及人工眼角膜等生物醫(yī)學(xué)工程中具有廣泛的應(yīng)用前景。在醫(yī)學(xué)材料應(yīng)用方面，國外的細(xì)菌纖維素產(chǎn)品實現(xiàn)商品化的有Biofill和Genginex兩種產(chǎn)品，己廣泛用作外科和齒科材料。對于二級和三級燒傷、潰瘍等，Biofill已被成功用作人造皮膚的臨時替代品，Genginex己用于齒根膜組織的修復(fù)。另外，Xylose公司生產(chǎn)的Xcell可以作為傷口敷料。
[0004]目前，用于醫(yī)學(xué)材料的細(xì)菌纖維素多為靜置培養(yǎng)，所獲得的纖維素內(nèi)部結(jié)構(gòu)無序排列。而支架中纖維的取向性對細(xì)胞行為會有顯著影響，定向纖維有利于細(xì)胞的遷移、粘附、貼壁和增殖，能夠顯著提高膜片的機械性能，作為細(xì)胞支架時能夠支持更強的生物應(yīng)力。因此，許多學(xué)者開始對 支架中纖維的取向調(diào)控展開研究。但是對細(xì)菌纖維素合成微環(huán)境的調(diào)控難度大，進(jìn)展緩慢，研究報道較少。Putra等分別采用模板法、硅油法和硅膠管法獲得了定向排列的納米纖維；Sano等通過在培養(yǎng)基外施加電場控制Ax的活動獲得了具有取向性排列的纖維支架。
[0005]細(xì)菌纖維素特有的三維納米結(jié)構(gòu)中的介孔可作為生物模板來控制合成具有預(yù)期形貌與尺寸的納米材料和納米結(jié)構(gòu)，從而獲得各種新的功能材料。該模板具有合成時性能和結(jié)構(gòu)的可調(diào)控性、較高的生物適應(yīng)性和良好的生物可降解性。有序的纖維結(jié)構(gòu)可以作為模板來引導(dǎo)有序結(jié)構(gòu)的制備與組裝，實現(xiàn)對納米材料的取向、結(jié)構(gòu)和排布等的控制，為研究納米有序體系的性質(zhì)提供有利途徑。
[0006]現(xiàn)有的方法存在產(chǎn)量低、工藝復(fù)雜等缺點，需要對現(xiàn)有的方法改進(jìn)或探索新的方法以高效地制備定向的納米纖維支架，并將其應(yīng)用到組織工程領(lǐng)域中。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]針對上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供一種動態(tài)培養(yǎng)制備有序化細(xì)菌纖維素的發(fā)酵反應(yīng)器，通過本發(fā)明可以獲得微觀結(jié)構(gòu)定向排列的細(xì)菌纖維素膜，簡化了工藝要求，提高了產(chǎn)量。
[0008]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明一種動態(tài)培養(yǎng)制備有序化細(xì)菌纖維素的發(fā)酵反應(yīng)器，包括主體容器，所述主體容器的側(cè)壁采用透氧材料，所述透氧材料選自于硅膠、銀基三氧化二鋁、GEOR-TEX, EVENT、ADVANCE-TEX, SYNPERTEX、TEXAPROE、DENTIKS 和 KING-TEX 中的一種；還包括動力裝置，所述動力裝置用于驅(qū)動主體容器內(nèi)的液體沿其內(nèi)壁作相對轉(zhuǎn)動。
[0009]進(jìn)一步講，所述動力裝置包括設(shè)置在所述主體容器內(nèi)的中心轉(zhuǎn)軸，所述中心轉(zhuǎn)軸上設(shè)有攪拌葉片，所述中心轉(zhuǎn)軸由電機帶動，所述電機的轉(zhuǎn)速為100~500r/min ;或所述動力裝置由磁力攪拌器和置于所述主體容器中的磁子構(gòu)成。
[0010]本發(fā)明一種動態(tài)培養(yǎng)制備有序化細(xì)菌纖維素的方法，包括以下步驟:
[0011]步驟一、制備培養(yǎng)基:所述培養(yǎng)基的組分及含量如下:葡萄糖10~25g/L、酵母粉I~7.5g/L、蛋白胨I~10g/L和磷酸氫二鈉I~10g/L ;將上述組分加入到裝有純凈水的容器中，攪拌直至其完全溶解；用冰醋酸調(diào)節(jié)體系的PH值至3~7之間，高溫滅菌后作為細(xì)菌生長的培養(yǎng)基；
[0012]步驟二、培養(yǎng)基接種細(xì)菌:待滅菌后的培養(yǎng)基冷卻至室溫，在無菌條件下，按照6%的體積分?jǐn)?shù)將種子溶液接種到所述培養(yǎng)基中，放入轉(zhuǎn)速為160r/min的搖床中，30°C溫度下振蕩24h ；
[0013]步驟三、動態(tài)發(fā)酵:取接種細(xì)菌的培養(yǎng)液注滿到如權(quán)利要求1所述的發(fā)酵反應(yīng)容器中，排除氣泡后用凡士林密封，控制動力裝置的轉(zhuǎn)速為100~500r/min，將發(fā)酵反應(yīng)容器置于30°C的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)3~7天，得到纖維素膜凝膠；
[0014]步驟四、產(chǎn)物純化:將所得纖維素膜凝膠用去離子水和濃度為0.lmol/L的NaOH反復(fù)交替煮沸，調(diào)節(jié)PH為7，最終獲得純凈的纖維素水凝膠，將其置于蒸餾水中，冷藏待用。
[0015]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是:
[0016]1.相對于模板法和電場控制等方法，該發(fā)明采用動態(tài)培養(yǎng)反應(yīng)器的核心部件為半透膜和動力裝置，工藝簡單，操作簡便，能耗較低，無污染，適合工業(yè)化量產(chǎn)。
[0017]2.本發(fā)明方法對產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和產(chǎn)量可控性較強。通過控制動力系統(tǒng)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速，可以同時控制纖維取向度和纖維素的產(chǎn)量；采用不同透氧能力的半透膜，可以控制產(chǎn)物的產(chǎn)量。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1所示為葉片攪拌發(fā)酵反應(yīng)器結(jié)構(gòu)示意圖；
[0019]圖2所示為磁子攪拌發(fā)酵反應(yīng)器結(jié)構(gòu)示意圖；
[0020]圖3所示為利用該反應(yīng)器靜態(tài)培養(yǎng)細(xì)菌纖維素的SEM圖像；
[0021]圖4所示為利用該反應(yīng)器動態(tài)培養(yǎng)細(xì)菌纖維素的SEM圖像。
【具體實施方式】
[0022]下面結(jié)合【具體實施方式】對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)地描述。
[0023]本發(fā)明一種動態(tài)培養(yǎng)制備有序化細(xì)菌纖維素的發(fā)酵反應(yīng)器，包括主體容器，所述主體容器的側(cè)壁2采用透氧材料，所述透氧材料選自于硅膠、銀基三氧化二鋁、GE0R-TEX、EVENT、ADVANCE-TEX、SYNPERTEX、TEXAPROE、DENTIKS 和 KING-TEX 中的一種；還包括動力裝置，所述動力裝置用于驅(qū)動主體容器內(nèi)的液體沿其內(nèi)壁作相對轉(zhuǎn)動，如圖1所示，所述動力裝置包括設(shè)置在所述主體容器內(nèi)的中心轉(zhuǎn)軸4，所述中心轉(zhuǎn)軸4上設(shè)有攪拌葉片3，所述中心轉(zhuǎn)軸4由電機I帶動，所述電機I的轉(zhuǎn)速為100~500r/min。如圖2所示,所述動力裝置還可以由磁力攪拌器6和置于所述主體容器中的磁子5構(gòu)成。
[0024]本發(fā)明一種動態(tài)培養(yǎng)制備有序化細(xì)菌纖維素的方法，包括以下步驟:
[0025]步驟一、制備培養(yǎng)基:所述培養(yǎng)基的組分及含量如下:葡萄糖10~25g/L、酵母粉I~7.5g/L、蛋白胨I~10g/L和磷酸氫二鈉I~10g/L ;將上述組分加入到裝有純凈水的容器中，攪拌直至其完全溶解；用冰醋酸調(diào)節(jié)體系的PH值至3~7之間，高溫滅菌后作為細(xì)菌生長的培養(yǎng)基；
[0026]步驟二、培養(yǎng)基接種細(xì)菌:待滅菌后的培養(yǎng)基冷卻至室溫，在無菌條件下，按照6%的體積分?jǐn)?shù)將種子溶液接種到所述培養(yǎng)基中，放入轉(zhuǎn)速為160r/min的搖床中，30°C溫度下振蕩24h ；
[0027]步驟三、動態(tài)發(fā)酵:取接種細(xì)菌的培養(yǎng)液注滿到如權(quán)利要求1所述的發(fā)酵反應(yīng)容器中，排除氣泡后用凡士林密封，控制動力裝置的轉(zhuǎn)速為100~500r/min，將發(fā)酵反應(yīng)容器置于30°C的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)3~7天，得到纖維素凝膠，至于培養(yǎng)天數(shù)的不同只影響到纖維素凝膠的產(chǎn)量對本發(fā)明產(chǎn)物的特性不起作用。
[0028]步驟四、產(chǎn)物純化:將所得纖維素凝膠用去離子水和濃度為0.lmol/L的NaOH反復(fù)交替煮沸，調(diào)節(jié)PH為7，最終獲得純凈的纖維素水凝膠，將其置于蒸餾水中，冷藏待用。
[0029]下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
[0030]實施例1
[0031]采用機械傳動裝置驅(qū)動 發(fā)酵液沿半透膜內(nèi)壁相對運動的培養(yǎng)方式，如圖1所示。
[0032]1.設(shè)計發(fā)酵反應(yīng)器的高為100mm，直徑為90mm，所述主體容器的側(cè)壁材料采用1.5_厚度的硅膠板，動力裝置中的葉片長為20_，中心轉(zhuǎn)軸連接有變頻電機。
[0033]2.配制培養(yǎng)基:將葡萄糖25g/L、酵母粉7.5g/L、蛋白胨10g/L和磷酸氫二鈉IOg/L依次加入裝有1000ml超純水的燒杯中，攪拌直至其完全溶解；用冰醋酸調(diào)節(jié)體系的pH值至4~5之間。115°C高溫滅菌30min后取出，作為細(xì)菌生長的培養(yǎng)基。
[0034]3.培養(yǎng)基接種細(xì)菌:待滅菌后的培養(yǎng)基冷卻至室溫，在無菌條件下，按照6%的體積分?jǐn)?shù)將種子溶液接種到新鮮的培養(yǎng)基中，放入搖床中，30°C振蕩24h，搖床轉(zhuǎn)速為160r/min0
[0035]4.動態(tài)發(fā)酵:取接種細(xì)菌的培養(yǎng)液注滿整個反應(yīng)容器，排除氣泡后用凡士林密封。調(diào)節(jié)電機轉(zhuǎn)速100r/min左右，將發(fā)酵反應(yīng)器置于通風(fēng)良好的30°C的恒溫培養(yǎng)箱，連續(xù)培養(yǎng)7天。
[0036]5.產(chǎn)物純化:將所得纖維素膜凝膠置于去離子水中清洗，加熱至水沸，反復(fù)換水煮沸，煮至產(chǎn)物變白，液體無氣味。再加入NaOH (0.lmol/L)加熱煮沸清洗幾次，再用去離子水煮至PH為7，即得到純凈的纖維素水凝膠，將其置于蒸餾水中，并冷藏待用。
[0037]6.微觀形貌觀察:將細(xì)菌纖維素膜用液氮冷凍，置于冷凍干燥機中，在_50°C、抽真空的條件下凍2天，將干膜用導(dǎo)電膠粘附在樣品臺上，離子濺射儀對樣品表面進(jìn)行噴金(5mA，5min)。采用FEI Nano430型場發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察樣品的微觀形貌。
[0038]圖3所示為利用該反應(yīng)器靜態(tài)培養(yǎng)細(xì)菌纖維素的SEM圖像，圖4所示為利用該反應(yīng)器動態(tài)培養(yǎng)細(xì)菌纖維素的SEM圖像。對比兩圖說明:利用該反應(yīng)容器動態(tài)培養(yǎng)細(xì)菌纖維素出現(xiàn)有序排列，且沿一定方向排列的纖維直徑較大，這些纖維之間由直徑較小的纖維素絲纏繞連接。
[0039] 實施例2
[0040]采用磁力攪拌裝置驅(qū)動發(fā)酵液沿半透膜內(nèi)壁相對運動的培養(yǎng)方式，如圖2所示。
[0041]本實施例2的制備方法步驟如下:
[0042]1.設(shè)計發(fā)酵反應(yīng)器的高為100mm，直徑為90mm，所述主體容器的側(cè)壁材料采用1.5mm厚度的硅膠板，選用長度約為30_磁子。
[0043]2.配制培養(yǎng)基:如實施例1。
[0044]3.培養(yǎng)基接種細(xì)菌:如實施例1。
[0045]4.動態(tài)發(fā)酵:取接種細(xì)菌的培養(yǎng)液注滿整個反應(yīng)容器，排除氣泡后用凡士林密封。調(diào)節(jié)磁力攪拌器的轉(zhuǎn)速lOOr/min左右，將發(fā)酵反應(yīng)器置于通風(fēng)良好的30°C的恒溫培養(yǎng)箱，連續(xù)培養(yǎng)7天。
[0046]其他步驟如實施例1。
[0047]實施例3
[0048]采用磁力攪拌裝置驅(qū)動發(fā)酵液沿半透膜內(nèi)壁相對運動的培養(yǎng)方式，如圖2所示。
[0049]本實施例3的制備方法步驟如下:
[0050]1.設(shè)計發(fā)酵反應(yīng)器的高為70mm，直徑為60mm，所述主體容器的側(cè)壁材料采用
1.5mm厚度的硅膠板，選用長度約為30mm磁子。
[0051]2.配制培養(yǎng)基:如實施例1。
[0052]3.培養(yǎng)基接種細(xì)菌:如實施例1。
[0053]4.動態(tài)發(fā)酵:取接種細(xì)菌的培養(yǎng)液注滿整個反應(yīng)容器，排除氣泡后用凡士林密封。調(diào)節(jié)磁力攪拌器的轉(zhuǎn)速300r/min左右，將發(fā)酵反應(yīng)器置于通風(fēng)良好的30°C的恒溫培養(yǎng)箱，連續(xù)培養(yǎng)7天。
[0054]其他步驟如實施例1。
[0055]實施例4
[0056]采用磁力攪拌裝置驅(qū)動發(fā)酵液沿半透膜內(nèi)壁相對運動的培養(yǎng)方式，如圖2所示。
[0057]本實施例4的制備方法步驟如下:
[0058]1.設(shè)計發(fā)酵反應(yīng)器的高為100mm，直徑為90mm，所述主體容器的側(cè)壁材料采用
0.8mm厚度的硅膠板，選用長度約為30mm磁子。
[0059]2.配制培養(yǎng)基:如實施例1。
[0060]3.培養(yǎng)基接種細(xì)菌:如實施例1。
[0061]4.動態(tài)發(fā)酵:取接種細(xì)菌的培養(yǎng)液注滿整個反應(yīng)容器，排除氣泡后用凡士林密封。調(diào)節(jié)磁力攪拌器的轉(zhuǎn)速500r/min左右，將發(fā)酵反應(yīng)器置于通風(fēng)良好的30°C的恒溫培養(yǎng)箱，連續(xù)培養(yǎng)7天。
[0062]其他步驟如實施例1。
[0063]對比實施例1和實施例2說明，兩種動力裝置均能達(dá)到制備有序化細(xì)菌纖維素的目的。對比實施例2、實施例3和實施例可以得出:隨動力裝置攪拌速度的增加，發(fā)酵液沿半透膜內(nèi)壁的的相對運動速度增加，產(chǎn)物的微觀結(jié)構(gòu)中，納米纖維的有序化度增加。[0064]盡管上面結(jié)合圖對本發(fā)明進(jìn)行了描述，但是本發(fā)明并不局限于上述的【具體實施方式】，上述的【具體實施方式】僅僅是示意 性的，而不是限制性的，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的啟示下，在不脫離本發(fā)明宗旨的情況下，還可以作出很多變形，這些均屬于本發(fā)明的保護(hù)之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種動態(tài)培養(yǎng)制備有序化細(xì)菌纖維素的發(fā)酵反應(yīng)器，包括主體容器，其特征在于，所述主體容器的側(cè)壁采用透氧材料，還包括動力裝置，所述動力裝置用于驅(qū)動主體容器內(nèi)的液體沿其內(nèi)壁作相對轉(zhuǎn)動。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述動態(tài)培養(yǎng)制備有序化細(xì)菌纖維素的發(fā)酵反應(yīng)器，其特征在于:所述透氧材料選自于硅膠、銀基三氧化二鋁、GEOR-TEX, EVENT、ADVANCE-TEX、SYNPERTEX、TEXAPROE、DENTIKS 和 KING-TEX 中的一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述動態(tài)培養(yǎng)制備有序化細(xì)菌纖維素的發(fā)酵反應(yīng)器，其特征在于:所述動力裝置包括設(shè)置在所述主體容器內(nèi)的中心轉(zhuǎn)軸，所述中心轉(zhuǎn)軸上設(shè)有攪拌葉片，所述中心轉(zhuǎn)軸由電機帶動,所述電機的轉(zhuǎn)速為100~500r/min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述動態(tài)培養(yǎng)制備有序化細(xì)菌纖維素的發(fā)酵反應(yīng)器，其特征在于:所述動力裝置由磁力攪拌器和置于所述主體容器中的磁子構(gòu)成。
5.一種動態(tài)培養(yǎng)制備有序化細(xì)菌纖維素的方法，包括以下步驟: 步驟一、制備培養(yǎng)基:所述培養(yǎng)基的組分及含量如下:葡萄糖10~25g/L、酵母粉I~7.5g/L、蛋白胨I~10g/L和磷酸氫二鈉I~10g/L ;將上述組分加入到裝有純凈水的容器中，攪拌直至其完全溶解；用冰醋酸調(diào)節(jié)體系的pH值至3~7之間，高溫滅菌后作為細(xì)菌生長的培養(yǎng)基； 步驟二、培養(yǎng)基接種細(xì)菌:待滅菌后的培養(yǎng)基冷卻至室溫，在無菌條件下，按照6%的體積分?jǐn)?shù)將種子溶液接種到所述培養(yǎng)基中，放入轉(zhuǎn)速為160r/min的搖床中，30°C溫度下振蕩24h ； 步驟三、動態(tài)發(fā)酵:取接種細(xì)菌的培養(yǎng)液注滿到如權(quán)利要求1所述的主體容器中，排除氣泡后用凡士林密封，控制動力裝置的轉(zhuǎn)速為100~500r/min，將發(fā)酵反應(yīng)容器置于30°C的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)3~7天，得到纖維素凝膠； 步驟四、產(chǎn)物純化:將所得纖維素凝膠用去離子水和濃度為0.lmol/L的NaOH反復(fù)交替煮沸，調(diào)節(jié)PH為7，最終獲得純凈的纖維素水凝膠，將其置于蒸餾水中，冷藏待用。
【文檔編號】C12R1/01GK103484356SQ201310430907
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年9月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月18日
【發(fā)明者】萬怡灶, 胡達(dá), 張琛, 羅紅林, 王哲人 申請人:天津大學(xué)