嗜線蟲致病桿菌GroEL基因、蛋白及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及“嗜線蟲致病桿菌（Xenorhabdusbovienii）GroEL基因，蛋白及其應(yīng)用”，屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)和生物防治領(lǐng)域。本發(fā)明涉及的殺蟲蛋白具有如SEQNO.2所示的氨基酸序列，及編碼該殺蟲蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQNO.1所示。上述基因?qū)γ掴徬x除服幼蟲具有很高的毒力，以應(yīng)用于轉(zhuǎn)化微生物和植物，使之表現(xiàn)出對相關(guān)害蟲的毒性，并克服、延緩鱗翅目害蟲對轉(zhuǎn)基因工程菌株和轉(zhuǎn)基因植物的抗藥性的產(chǎn)生。
【專利說明】嗜線蟲致病桿菌基因、蛋白及其應(yīng)用
[0001]
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及對棉鈴蟲(ZfeJicorerjDa armigera )高效的嗜線蟲致病桿菌Croi^Z基因，蛋白及其應(yīng)用，屬于農(nóng)業(yè)生物防治與生物技術(shù)范疇。
【背景技術(shù)】
[0003]農(nóng)業(yè)蟲害是導(dǎo)致農(nóng)作物減產(chǎn)的重要原因之一，減少蟲害的損失時增加糧食與飼料作物產(chǎn)量的重要途徑。棉鈴蟲OydicoMrpa是一種常見蟲害，危害非常嚴(yán)重且食性雜，除危害棉花外，還危害小麥、玉米、辣椒、番茄和向日葵等多種作物。棉鈴蟲主要危害華北棉區(qū)、菜區(qū)，華南、華西等地區(qū)也危害嚴(yán)重。棉鈴蟲是棉花的第一大害蟲，常年造成棉花自然損失率在50%左右。要防治棉鈴蟲首先要做好蟲情測報和田間調(diào)查。當(dāng)百株棉花累計卵量達到防治指標(biāo)后，要及時準(zhǔn)確地采取施用藥劑等措施防治。目前防治棉鈴蟲要采取化學(xué)防治的方法為主，結(jié)合生物防治等措施，協(xié)調(diào)使用，達到經(jīng)濟、安全和高效地控制病蟲害的目的。
[0004]生物農(nóng)藥與化學(xué)農(nóng)藥相比，其有效成分來源，工業(yè)化生產(chǎn)途徑，產(chǎn)品的殺蟲防病機理和作用方式等諸多方面，有著許多本質(zhì)的區(qū)別。生物農(nóng)藥更適合于擴大在未來有害生物綜合治理策略中的應(yīng)用比重。正是由于生物農(nóng)藥具有如，選擇性強，對人畜安全、對生態(tài)環(huán)境影響小、誘發(fā)害蟲流行病、產(chǎn)品改良的技術(shù)潛力大等諸多方面的優(yōu)點，所以扶植生物農(nóng)藥工業(yè)無論從促進科學(xué)技術(shù)創(chuàng)新發(fā)展，還是從國家投入產(chǎn)出的經(jīng)濟利益方面考慮，都完全吻合今后產(chǎn)業(yè)生態(tài)革命的方向，無公害生物農(nóng)藥是人類實現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展和保障食品安全生產(chǎn)的高新技術(shù)突破口之一，在未來全球農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)中的特殊地位。
[0005]昆蟲病原線蟲共生菌是一類新型的具有開發(fā)潛力和應(yīng)用前景的生物資源。在昆蟲病原線蟲共生菌復(fù)合體對昆蟲的致病作用中，起主要作用的是共生菌。當(dāng)線蟲進入昆蟲體內(nèi)后，即在昆蟲血腔內(nèi)釋放共生菌，共生菌大量繁殖并分泌殺蟲物質(zhì)，在短時間內(nèi)使昆蟲死亡。近年來，隨著研究的不斷深入，昆蟲病原線蟲共生菌殺蟲蛋白表現(xiàn)出殺蟲能力強、殺蟲快速高效等諸多優(yōu)點，因而從共生菌中克隆殺蟲蛋白基因用于新型生物農(nóng)藥的研制和轉(zhuǎn)基因抗蟲作物的開發(fā)。
[0006]2001年，Morgan等從Z.nematophilus PMF1296品系的粘粒文庫中篩選到一個粘?？寺?，對菜青蟲{Pieris rapae)有口服毒性。該粘?？寺∷鶖y帶的殺蟲蛋白基因簇包括多個開放讀碼框(ORFs)，主要由3個相同方向轉(zhuǎn)錄的開放讀碼框x/7妨7、
和一個反方向終止開放讀碼框xptAl構(gòu)成(Morgan JA, Sergeant M, Ellis D, et al.,Appl Environ Microbiol, 2001，67 (5): 2062-20691)。此外，Joshi 等(2008)從Znematophilus中分離出一個編碼具有幾丁質(zhì)結(jié)合活性的分子伴侶蛋白(Crc^Z),該蛋白分子量約58 kDa,對棉鈴蟲幼蟲具有很好的毒力，LC5tl約為3.6 μ g/g (Joshi MC, Sharma A,Kant S, et al., J Bio Chem.283, 42: 28287-28296)。.[0007]由于目前商品化的轉(zhuǎn)基因抗蟲作物含有抗蟲基因的種類相對有限，因此大面積地種植轉(zhuǎn)基因作物會增加害蟲抗藥性上升的風(fēng)險。發(fā)掘新型抗蟲基因可以豐富我國特有的抗蟲基因資源，為轉(zhuǎn)基因作物與工程菌株提供新的基因來源，避免害蟲抗藥性上升的風(fēng)險，避免新的生態(tài)災(zāi)難降臨，具有重要的經(jīng)濟、社會和生態(tài)效益。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明提供一種對棉鈴蟲等鱗翅目害蟲具有高毒力的嗜線蟲致病桿菌GroEL基因和殺蟲蛋白，以應(yīng)用于轉(zhuǎn)化微生物和植物，從而克服和延緩害蟲對轉(zhuǎn)基因工程菌和植物的抗性的產(chǎn)生,有效地防治農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的重要害蟲。
[0009]一種編碼該殺蟲蛋白的基因，該基因為,其核昔酸序列如SEQ N0.1所不。
[0010]一種分離的編碼殺蟲蛋白的多核苷酸分子，所述的多核苷酸分子包括與下列條件之一相符合的核苷酸序列:SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列；包含部分SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列，并且編碼具有殺蟲毒力蛋白質(zhì)分子的核苷酸序列。[0011]—種的殺蟲蛋白，其特征在于:該蛋白質(zhì)包括氣基酸序列SEQ ID N0.2。
[0012]其中殺蟲蛋白可以為SEQ ID N0.2氨基酸序列基本及部分相符合的氨基酸序列。
[0013]一種表達載體或一種宿主細胞，它含有SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.2所述的DNA序列。
[0014]一種殺蟲蛋白類藥物組合物，它含以上任一所述的殺蟲蛋白或其工程菌株的發(fā)酵液。
[0015]一種重組微生物，其特征在于它由根據(jù)權(quán)利要求SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.2中任何一個的多核苷酸分子轉(zhuǎn)化得到并表達該多核苷酸分子，含有與SEQ ID N0.2氨基酸序列基本及部分相符合的氨基酸序列或與SEQ ID N0.1基本及部分相符合的多核苷酸分子。。
[0016]一種生產(chǎn)殺蟲蛋白的方法，包括在適合于編碼殺蟲蛋白的多核苷酸分子表達的條件下培養(yǎng)一種根據(jù)所述的重組微生物以及可任選地回收表達的酶抑制劑的方法。
[0017]一種殺死有害昆蟲的方法，包括將有效劑量的根據(jù)所述的重組微生物及其表達產(chǎn)物以可任選的與一種可接受的農(nóng)用載體混合。
[0018]一種多核苷酸分子的植物，包括根據(jù)SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.2的任一個的多核苷酸分子轉(zhuǎn)化并表達該多核苷酸分子的植物。所述的植物可以是易受有害昆蟲攝食而造成農(nóng)業(yè)損失的任何植物，該基因可作為目的基因?qū)胫参铩?br> [0019]上述殺蟲蛋白在殺滅鱗翅目害蟲中的應(yīng)用。
[0020]一種殺蟲劑，其特征在于含有有效量的殺蟲蛋白。
[0021 ] 上述基因在抗鱗翅目害蟲中的應(yīng)用。
[0022]所述應(yīng)用時將上述基因轉(zhuǎn)入到微生物或植物，使其表達對鱗翅目害蟲的毒性蛋白。
[0023]本發(fā)明從菌株XB1027，獲得含有一個基因的陽性克隆pMl，通過測序分析，發(fā)現(xiàn)克隆PMl中含有一個1542個堿基的開放讀碼框，見SEQ N0.1，編碼513個氨基酸，見SEQN0.2。與Genbank中已經(jīng)登錄的GroEL基因相似性最高，相似性為89%，是一個新基因，命名為油&0況。將該基因構(gòu)建入表達載體，轉(zhuǎn)化受體菌株，得到表達菌株，測定重組表達蛋白的活性。結(jié)果表明，8 μ g/g重組蛋白對棉鈴蟲的較正死亡率為78.3%, 16 μ g/g重組蛋白的較正死亡率為100%，LC50為2.8 μ g/g。重組蛋白對棉鈴蟲的生長抑制效果同樣很顯著，8 μ g/g和16 μ g/g重組蛋白處理過的棉鈴蟲幼蟲平均蟲重分別為4.3 μ g/g和0.9 μ g/g,抑制率分別達93.5%和98.7%。
[0024]基因油&0況可以利用分子生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化微生物、植物并表現(xiàn)出對鱗翅目害蟲的毒性。上述基因轉(zhuǎn)化的表達菌株，表達得到的重組蛋白可以制成生物農(nóng)藥制劑用于鱗翅目害蟲的防治。
[0025]本發(fā)明XbGroEL表現(xiàn)出對鱗翅目害蟲的高毒力性，特別是對棉鈴蟲具有較高的生物活性，是很好的生物殺蟲基因，有很廣泛的應(yīng)用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1菌株XB1027對棉鈴蟲幼蟲的殺蟲活性。A，菌株XB1027對棉鈴蟲幼蟲死亡率的影響，菌株XB1027對棉鈴蟲幼蟲生長的影響。
[0027]圖2菌株XB1027中XbGroEL全長基因的PCR擴增，其中泳道1_5，菌株XB1027中XbGroEL全長基因的PCR產(chǎn)物，長度約為1.5kb ;6，陰性對照；M，DNA Marker。
[0028]圖3 XbGroEL基因在大腸桿菌感受態(tài)細胞BL21 (DE3)重組表達分析。1，誘導(dǎo)表達菌株上清液；2-5，純化的油Cro況基因重組表達蛋白；M，蛋白質(zhì)Marker。
[0029]圖4 XbGroEL基因重組表達蛋白對棉鈴蟲幼蟲的殺蟲活性。k,XbGroEL基因重組表達蛋白對棉鈴蟲幼蟲死亡率的影響；B，XbGroEL基因重組表達蛋白對棉鈴蟲幼蟲生長的影響。
[0030]【具體實施方式】
實施例1、菌株XB1027殺蟲活性測定
將菌株接種到LB固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)72小時，至菌液0D_值為0.6，以棉鈴蟲幼蟲為例測定菌株XB1027對鱗翅目害蟲的殺蟲活性。首先采用表面涂抹法對菌株XB1027進行生物活性的測定，將配制好的人工飼料用連續(xù)移液器加入96孔培養(yǎng)板中，每孔加200μ I菌液，飼料冷卻凝固后加入20 μ I的菌液，待菌液風(fēng)干后，接蟲。每種菌液(每個處理)加到6個孔中(24孔板上的I排)，同一個板上同時設(shè)清水和Bt菌株(I億芽孢每毫升)為陰、陽性對照。接棉鈴蟲的初孵幼蟲，將幼蟲直接置于24孔板中，每孔接蟲4頭，用封口膜封住每個孔，重復(fù)三次。將接好蟲的各個處理放到溫度28±2°C，相對濕度70%、光照12:12 (L:D)的養(yǎng)蟲室中培養(yǎng)，4天后調(diào)查結(jié)果并計算死亡率和記錄蟲體質(zhì)量。
[0031]結(jié)果顯示該濃度的菌液與飼料混合物對棉鈴蟲幼蟲具有很高的活性，菌株XB1027對棉鈴蟲幼蟲的死亡率達97.2%，平均蟲體重量為2.0mg，而Bt菌液的死亡率達到100%，平均蟲體重量為0.8mg，對照的平均蟲體重量為58.0mg0
[0032]實施例2、菌株XB1027中XbGroEL基因的克隆 設(shè)計了 I組擴增該基因全長的引物(P1/P2)，引物序列為:
Pl:5’ -CTGCTCGCCTTCAAAGTTT-3’
P2:5’ -CGGCAATGGTCGTATCCTT-3’
1.XbGroEL基因全長序列的擴增提取菌株XB1027的總DNA作為擴增的模板，用pfuDNA聚合酶進行PCR擴增，結(jié)果(見附圖2)，結(jié)果表明擴增產(chǎn)物為1.6kb的單一條帶。PCR擴增體系如下:
PCR反應(yīng)體系
【權(quán)利要求】
1.一種分離的編碼殺蟲蛋白的多核苷酸分子，其特征在于:所述的多核苷酸分子包括與下列條件之一相符合的核苷酸序列:SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列；包含部分SEQID N0.1所示的核苷酸序列，并且編碼具有殺蟲毒力蛋白質(zhì)分子的核苷酸序列。
2.—種的殺蟲蛋白，其特征在于:該蛋白質(zhì)包括氣基酸序列SEQ ID N0.2。
3.根據(jù)權(quán)利要求3所述的殺蟲蛋白，其特征在于:其中殺蟲蛋白包括與SEQID N0.2氨基酸序列基本及部分相符合的氨基酸序列。
4.一種表達載體或一種宿主細胞,其特征在于它含有如權(quán)利要求1或2所述的DNA序列。
5.一種殺蟲蛋白類藥物組合物，其特征在于:它含有如權(quán)利要求1-4任一所述的殺蟲蛋白或其工程菌株的發(fā)酵液。
6.一種重組微生物，其特征在于它由根據(jù)權(quán)利要求1-2中任何一個的多核苷酸分子轉(zhuǎn)化得到并表達該多核苷酸分子，含有與SEQ ID N0.2氨基酸序列基本及部分相符合的氨基酸序列或與SEQ ID N0.1基本及部分相符合的多核苷酸分子。
7.—種生產(chǎn)殺蟲 蛋白的方法，其特征在于:包括在適合于編碼殺蟲蛋白的多核苷酸分子表達的條件下培養(yǎng)一種根據(jù)權(quán)利要求6所述的微生物以及可任選地回收表達的酶抑制劑的方法。
8.—種殺死有害昆蟲的方法，其特征在于:包括將有效劑量的根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組微生物及其表達產(chǎn)物以可任選的與一種可接受的農(nóng)用載體混合。
9.一種多核苷酸分子的植物,其特征在于:包括根據(jù)權(quán)利要求1-2的任一個的多核苷酸分子轉(zhuǎn)化并表達該多核苷酸分子的植物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的多核苷酸分子的植物，其特在在于:所述的植物可以是易受有害昆蟲攝食而造成農(nóng)業(yè)損失的任何植物，該基因可作為目的基因?qū)胫参铩?br> 【文檔編號】C12N15/31GK103451194SQ201310318943
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年9月14日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月14日
【發(fā)明者】薛仁峰, 張慶, 黃艷, 孟黎歌 申請人:蘇州研迪智能科技有限公司