水稻耐旱相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種水稻耐旱相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)，名稱為DRK1，是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；（b）將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐旱相關(guān)的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明克隆得到DRK1基因，過表達該基因可以降低植物的耐旱性，而缺失該基因可以提高植物的耐旱性，說明該基因可用來調(diào)控植物耐旱性；為培養(yǎng)耐旱植物奠定了基礎(chǔ)。因此應(yīng)用DRK1基因調(diào)控植物耐旱性，提高干旱條件下農(nóng)作物的產(chǎn)量和質(zhì)量。
【專利說明】水稻耐旱相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域，尤其涉及一種水稻耐旱相關(guān)蛋白及其編碼基因與 應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 水稻是最重要的糧食作物之一，世界上一半以上人口以它為主食。水稻生產(chǎn)的可 持續(xù)性是關(guān)系國計民生的重大課題。水稻生產(chǎn)受到病蟲害等生物脅迫和干旱、鹽害、低溫等 非生物脅迫的影響。其中干旱是影響水稻生產(chǎn)最大限制因素之一。尤其是當前水資源短缺 的形式下，研究水稻對干旱響應(yīng)的分子機理具有特別重要的意義。
[0003] 水稻可以通過多種機制對干旱做出響應(yīng)，如縮短生育周期，增強對土壤中水分的 吸收能力，減少水分散失等。水稻也可以通過形態(tài)、生理和生化等方面的復(fù)雜改變，增強對 干旱的抵抗。在組織和細胞水平，這些改變包括提早成熟，降低葉面積，葉片卷曲，增強根系 吸收，降低分蘗數(shù)，降低呼吸作用，關(guān)閉氣孔，積累滲透物質(zhì)如脯氨酸和海藻糖等。植物需要 維持各條耐旱途徑之間達到合理平衡，以便在干旱下達到最優(yōu)的產(chǎn)量。
[0004] 研究發(fā)現(xiàn)許多基因參與水稻對干旱的響應(yīng)過程，包括蛋白激酶、轉(zhuǎn)錄因子、水孔蛋 白、LEA蛋白、脫水蛋白、細胞色素 P450等。鑒定水稻耐旱的關(guān)鍵基因，進而揭示耐旱的分 子機制，是生產(chǎn)上對水稻進行遺傳改良的前提。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的一個目的是提供一種水稻耐旱相關(guān)蛋白及其編碼基因。
[0006] 本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)，名稱為DRK1 Qrought xesistant kinasel)，來源于水稻 (Oryza sativa)，是如下（a)或（b):
[0007] (a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0008] (b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/ 或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關(guān)的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。
[0009] 所述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過10個氨基酸 殘基的取代和/或缺失和/或添加。
[0010] 上述序列表中的序列2由1001個氨基酸殘基組成。
[0011] 編碼所述蛋白的DNA分子也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0012] 上述DNA分子是如下（1)或（2)或（3)的DNA分子：
[0013] (1)編碼區(qū)為序列表中序列1所示的DNA分子；
[0014] (2)在嚴格條件下與（1)限定的DNA序列雜交且編碼與植物耐逆性相關(guān)蛋白的DNA 分子；
[0015] (3)與（1)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有 85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有 99%同源性且編碼與植物耐逆性相關(guān)蛋白的DNA分子。
[0016] 所述嚴格條件為在6XSSC，0. 5%SDS的溶液中，在65 ° C下雜交，然后用 2 X SSC, 0· 1%SDS 和 1 X SSC, 0· 1%SDS 各洗膜一次。
[0017] 上述序列表中的序列1由3006個核苷酸組成。
[0018] 上述耐逆性均具體為耐旱性。
[0019] 本發(fā)明的另一個目的是提供抑制或沉默上述蛋白表達的物質(zhì)的用途。
[0020] 本發(fā)明提供的抑制或沉默上述蛋白表達的物質(zhì)在調(diào)控植物耐逆性中的應(yīng)用。
[0021] 上述應(yīng)用中，所述抑制或沉默權(quán)利要求1所述蛋白表達的物質(zhì)為重組載體、含有 重組載體的轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌；
[0022] 所述重組載體為將DNA片段1和DNA片段2均插入雙元表達載體中，得到的抑制 或沉默權(quán)利要求1所述蛋白表達的重組載體；所述DNA片段1的編碼區(qū)與所述DNA片段2 的編碼區(qū)互為反向互補；所述DNA分子1編碼區(qū)的核苷酸序列為序列表中序列1自5'末端 第1位-499位核苷酸；在本發(fā)明的實施例中，雙元表達載體為pCUbi 1390- Λ FAD2,重組載 體為RNA干擾重組載體pCUbil390- Λ FAD2-SX，其構(gòu)建方法見實施例2的一的2。
[0023] 上述應(yīng)用中，所述調(diào)控植物耐逆性為提高植物耐旱性，提高耐旱性通過在干旱脅 迫下，提高植物成活率和/或降低植物失水率和/或降低植物失水率速率體現(xiàn)。
[0024] 所述植物具體為雙子葉植物或單子葉植物；所述單子葉植物進一步具體為水稻。
[0025] 本發(fā)明的第三個目的提供重組載體、含有重組載體的轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌。
[0026] 本發(fā)明提供的重組載體、含有重組載體的轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌：
[0027] 所述重組載體為將DNA片段1和DNA片段2均插入雙元表達載體中，得到的抑制 或沉默權(quán)利要求1所述蛋白表達的重組載體；所述DNA片段1的編碼區(qū)與所述DNA片段2 的編碼區(qū)互為反向互補；所述DNA分子1編碼區(qū)的核苷酸序列為序列表中序列1自5'末端 第1位-499位核苷酸；
[0028] 在本發(fā)明的實施例中，雙元表達載體為pCUbi 1390- Λ FAD2,重組載體為RNA干擾 重組載體pCUbil390- Λ FAD2-SX，其構(gòu)建方法見實施例2的一的2。
[0029] 含有上述DNA分子的重組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌也是本發(fā)明保護 的范圍；
[0030] 所述重組載體為將上述DNA分子插入表達載體中，得到表達上述蛋白的重組載 體。在本發(fā)明的實施例中，表達載體具體為pCUbil390,重組載體為序列表中序列1所示的 核苷酸同源重組到雙元表達載體pCUbi 1390上得到的載體，命名為pCUbi 1390-DRK1。
[0031] 上述蛋白、上述DNA分子或上述含有上述DNA分子的重組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細 胞系或重組菌在調(diào)控植物耐逆性中的應(yīng)用；
[0032] 所述調(diào)控植物耐逆性具體為降低植物耐旱性，降低耐旱性通過在干旱脅迫下，降 低成活率和/或提高失水率和/或提高植物失水率速率體現(xiàn)。
[0033] 所述植物具體為雙子葉植物或單子葉植物；所述單子葉植物進一步具體為水稻。
[0034] 本發(fā)明的第四個目的是提供一種培育轉(zhuǎn)基因植物B的方法或一種培育轉(zhuǎn)基因植 物A的方法。
[0035] 本發(fā)明提供的一種培育轉(zhuǎn)基因植物B的方法，為抑制目的植物中的上述蛋白的活 性或表達，得到轉(zhuǎn)基因植物B，所述轉(zhuǎn)基因植物B的耐旱性高于所述目的植物；
[0036] 所述抑制目的植物中的上述蛋白的活性或表達具體為將第三個目的中的重組載 體導(dǎo)入所述目的植物；
[0037] 本發(fā)明提供的一種培育轉(zhuǎn)基因植物A的方法，為將上述DNA分子導(dǎo)入目的植物中， 得到轉(zhuǎn)基因植物A，所述轉(zhuǎn)基因植物A的耐旱性低于所述目的植物；
[0038] 所述將編碼上述蛋白的DNA分子具體通過上述含有上述DNA分子的重組載體導(dǎo)入 目的植物。
[0039] 所述目的植物具體為雙子葉植物或單子葉植物；所述單子葉植物進一步具體為水 稻。
[0040] 擴增所述DNA分子全長或其任意片段的引物對也是本發(fā)明保護的范圍。
[0041] 本發(fā)明實施例中的引物對如下：5' -ATGGGCCTCACGTGTGATACAC-3' 和 5' -TCATGCAT CTTGTTCATTACATGCC-3'。
[0042] 本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明克隆得到DRK1基因，過表達該基因可以降低植物的耐 旱性，而缺失該基因可以提高植物的耐旱性，說明該基因可用來調(diào)控植物耐旱性；為培養(yǎng)耐 旱植物奠定了基礎(chǔ)。因此應(yīng)用DRK1基因調(diào)控植物耐旱性，提高干旱條件下農(nóng)作物的產(chǎn)量和 質(zhì)量。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0043] 圖1為pCUbil390_ Λ FAD2載體結(jié)構(gòu)示意圖
[0044] 圖2為DRK1缺失和過表達植株中DRK1基因轉(zhuǎn)錄水平檢測
[0045] 圖3為DRK1缺失和過表達植株的表型

【具體實施方式】
[0046] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0047] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0048] 水稻（Oryza sativa ssp. Japonica)Asominori 記載在如下文獻中：Wu W, Zheng XM, Lu G, Zhong Z, Gao H, Chen L, Wu C, Wang HJ, Wang Q, Zhou K, Wang JL, Wu F, Zhang X，Guo X，Cheng Z，Lei C，Lin Q，Jiang L, Wang H，Ge S, Wan J (2013) Association of functional nucleotide polymorphisms at DTH2with the northward expansion of rice cultivation in Asia. Proc Natl Acad Sci U S A. 19; 110 (8): 2775-80,公眾可從中國農(nóng) 業(yè)科學院作物科學研究所獲得，以下也稱為水稻日本晴或野生型水稻。
[0049] 根癌農(nóng)桿菌 EHA105 (Agrobacterium tumefaciens EHA105)記載在如下 文獻中：New Agrobacterium helper plasmids for gene transfer to plants. Hood, Elizabeth E;Gelvin，Stanton B;Melchers，Leo S;Hoekema, Andre. Transgenic ResearchjGhp. 208-218-218 (1993).公眾可從中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所獲得。
[0050] 雙元表達載體pCUbi 1390記載在如下文獻中：Wu Z，Zhang X，He B，Diao L，Sheng S，Wang J，Guo X，Su N，Wang L，Jiang L，Wang C，Zhai H, Wan J. A chlorophyll-deficient rice mutant with impaired chlorophyl1ide esterification in chlorophyll biosynthesis. Plant Physiol. 2007Sep; 145 (1) : 29-40,公眾可從中國農(nóng)業(yè)科學院作物科 學研究所獲得。
[0051] pCUbil390_ Λ FAD2 載體記載在如下文獻中：Wax crystal-sparse leaf2, a rice homologue of WAX2/GL1, is involved in synthesis of leaf cuticular wax. Mao B. , et al. (2012). Planta235:39 - 52,公眾可從中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所獲得。
[0052] 水稻材料的栽培條件：將水稻種子用水浸泡3天，然后播種在苗床上。4葉期的水 稻幼苗移栽到水田中，分單株插秧。
[0053] 實施例1、DRK1基因的獲得
[0054] 根據(jù)gramene數(shù)據(jù)庫，設(shè)計引物（引物序列為：forward primer, 5'
[0055] -ATGGGCCTCACGTGTGATACAC-3' ；reverse primer，5'
[0056] -TCATGCATCTTGTTCATTACATGCC-3'），用上述引物，以水稻（Oryza sativa ssp.
[0057] Japonica) Asominori2周幼苗的cDNA為模板，得到全長cDNA序列3006bp，結(jié)果為 該PCR產(chǎn)物具有序列表中序列1所示的核苷酸，該PCR產(chǎn)物的基因為DRK1，該基因的編碼區(qū) 為序列表中序列1 ;該基因編碼的蛋白命名為DRK1，該蛋白的氣基酸序列為序列表中的序 列2。
[0058] 實施例2、DRK1基因在調(diào)控植物耐旱性中的應(yīng)用
[0059] 一、過表達重組載體獲得
[0060] 1、過表達重組載體pCUbil390-DRKl的獲得
[0061] 以水稻（Oryza sativa ssp. Japonica) Asominori2 周苗提取 RNA 反轉(zhuǎn)錄得到的總 cDNA 為模板，用引物 5-TCTGCACTAGGTACCTGCAGATGGGCCTCACGTGTGATACAC-3 和 5-ATGGATCC GTCGACCTGCAGTCATGCATCTTGTTCATTACATGCC-3 進行擴增，得到 3049bp 的 PCR 產(chǎn)物。經(jīng)過測 序，該PCR產(chǎn)物具有序列表中序列1所示的核苷酸；
[0062] 回收上述PCR產(chǎn)物，通過clontech infusion kit (takara公司產(chǎn)品）同源重組到 雙元表達載體pCUbil390的酶切位點PstI上，得到的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，得到轉(zhuǎn)化 子。
[0063] 提取轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒送去測序，該質(zhì)粒為將序列表中序列1所示的核苷酸同源重組 到雙元表達載體pCUbi 1390上得到的載體，命名為pCUbi 1390-DRK1，為過表達重組載體。
[0064] 二、DRK1 基因 RNA 干擾載體 pCUbil390- Λ FAD2-DRK1 的構(gòu)建
[0065] 1、DRK1基因干擾片段的獲得
[0066] (1)水稻品種Asominori幼苗RNA的提取及cDNA的制備
[0067] 使用RNAprep pure植物總RNA提取試劑盒(購自天根生化科技(北京)有限公司）， 提取水稻（Oryza sativa ssp. Japonica) Asominoril4 天幼苗的 RNA，反轉(zhuǎn)錄得到 cDNA。
[0068] (2)引物的設(shè)計
[0069] 擴增DRK1正義片段的引物為DRKl-sense_F:5-
[0070] TTCTGCACTAGGTACCAGGCCTGATGGGCCTCACGTGTGATACAC-3 和 DRKl-sense-R:5-
[0071] CTGACGTAGGGGCGATAGAGCTCGAAGTGCACCAGTTAGGGCATTTC-3。
[0072] 擴增 DRK1 反義片段的引物為 DRKl-antisense-F:5-CGGGGATCCGTCGACTACATGGGCC TCACGTGTGATACAC-3 和 DRKl-antisense-R:5-AGGTGGAAGACGCGTTACGAAGTGCACCAGTTAGGGCA TTTC-3。
[0073] (3) PCR擴增DRK1基因干擾片段
[0074] 以cDNA為模板，用DRKl-sense-F及DRKl-sense-R引物進行PCR擴增，得到片段 1。以cDNA為模板，用DRKl-antisense-F及DRKl-antisense-R引物進行PCR擴增，得到片 段2。
[0075] 將上述片段電泳檢測，片段1大小為499bp，片段2大小為499bp。將片段1和片 段2均送去測序，結(jié)果表明片段1的編碼序列為序列表中序列1所示核苷酸自5'末端第 l-499bp，片段2的編碼序列為序列表中序列1所示核苷酸自5'末端第1-499的反向互補 序列。
[0076] 2、帶DRK1基因正義干擾片段的pCUbil390- Λ FAD2-sense-DRKl重組載體獲得
[0077] (1)DRK1基因正義干擾片段的同源重組定向克隆
[0078] 用Sac I酶切pCUbi 1390- Λ FAD2載體（結(jié)構(gòu)示意圖如圖1所示)，得到了線 性pCUbil390-AFAD2,回收。將片段1采用同源重組定向克隆的方法連接到線性的 pCUbil39〇- Λ FAD2載體(具體步驟和方法參考clontech infusion kit說明書，該試劑盒 可從大連寶生物公司購買)，再將同源重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5 α感受態(tài)細胞，37度培養(yǎng)過夜，得 到單克隆。
[0079] (2)鑒定 pCUbil39〇_ Λ FAD2_sense-DRKl 重組載體
[0080] 挑選（1)中所得的單克隆，接種于含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)；取過 夜培養(yǎng)的菌液作為PCR反應(yīng)模板，使用載體引物1390-F及FAD-R進行PCR擴增，鑒定已經(jīng) 插入片段1的pCUbil390- Λ FAD2-sense-DRKl重組載體，得到854bp DNA條帶的即為陽性 克隆，引物序列如下：
[0081] 1390-F :5'-TGCCTTCATACGCTATTTATTTGC-3' ；
[0082] FAD-R :5, -GAAGCGACGGACCTGGAGAT-3,。
[0083] 提取陽性克隆的質(zhì)粒，送去測序，測序引物為Left MCS-F及Left MCS-R， 測序結(jié)果表明，片段1正確連接到pCUbil390-AFAD2載體Sac I上的質(zhì)粒命名為 pCUbi1390- Λ FAD2-sense-DRKl。
[0084] 3、帶DRK1基因正義及反義干擾片段的pCUbil390- Λ FAD2-SX重組載體的獲得 (1) DRK1基因反義干擾片段的同源重組定向克隆
[0085] 用SnaB I酶切步驟pCUbil390- Λ FAD2-sense-DRKl質(zhì)粒，回收待用。采用同源 重組定向克隆的方法(具體步驟和方法參考clontech infusion kit說明書，該試劑盒可從 大連寶生物公司購買)，先將回收的片段2和線性pCUbil390- Λ FAD2-sense-DRKl進行同 源重組反應(yīng)，再將同源重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5 α感受態(tài)細胞，37度過夜培養(yǎng)得到單克隆。
[0086] (2)鑒定 pCUbil390- Λ FAD2-DRK1 重組載體
[0087] 挑選單克隆菌，接種于含卡拉霉素的LB液體培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)；取過夜培養(yǎng)的 菌液作為PCR反應(yīng)模板，使用FAD-F及1390-R引物，進行PCR擴增反應(yīng)。引物序列如下：
[0088] FAD-F :5'-CCTTTCACAACCTGATTTCCCA-3' ；
[0089] 1390-R :5'-TAATCATCGCAAGACCGGCAACAGG-3'。
[0090] 能夠擴出片段大小為lk的質(zhì)粒即為陽性克隆。將該質(zhì)粒送去測序，以FAD-F及 1390-R作為測序引物，該質(zhì)粒為將片段1連接到pCUbi 1390- Λ FAD2載體Sac I，且將片 段2連接到pCUbi 1390- Λ FAD2載體SnabI位點的質(zhì)粒，片段1的編碼區(qū)和片段2的編碼 區(qū)互為反向互補；命名為pCUbi 1390- Λ FAD2-SX。
[0091] 三、過表達轉(zhuǎn)DRK1水稻和RNA干擾轉(zhuǎn)DRKIRNAi水稻的獲得
[0092] 1、過表達轉(zhuǎn)DRK1水稻的獲得
[0093] 將上述獲得的過表達重組載體pCUbil390_DRKl通過熱激的方法轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌 EHA105中，得到重組菌，提取質(zhì)粒，送去測序，質(zhì)粒為pCUbil390-DRKl，含有該質(zhì)粒的重組 菌命名為 EHA105/pCUbil390-DRKl。
[0094] 將水稻日本晴的種子脫殼滅菌，參照Hiei等的方法（Plant J. 1994,6:271 - 282) 進行轉(zhuǎn)化，得到TO代轉(zhuǎn)DRK1水稻植株。
[0095] T0代轉(zhuǎn)DRK1水稻植株收種后播種得到T1代轉(zhuǎn)DRK1水稻植株。
[0096] T1代轉(zhuǎn)DRK1水稻植株生長1個月后，提取葉片的RNA反轉(zhuǎn)錄得到cDNA作為模板， 用引物 ATGGGCCTCACGTGTGATACAC 和 GAAGTGCACCAGTTAGGGCATTTC 進行熒光定量 PCR (方法 參照kakara公司，SYBR# Premix Ex Taq?試劑說明書)，篩選DRK1表達量調(diào)高的單株。以 野生型水稻（WT)為對照。
[0097] 內(nèi)參為 Ubiquitin，內(nèi)參的引物為 UBI_F:ACCCTGGCTGACTACAACATC 和 UBI-R:AGTTGACAGCCCTAGGGTG。結(jié)果如圖2所示，野生型水稻中DRK1的相對表達量為2. 0， 而T1代轉(zhuǎn)DRK1水稻株系0E1、0E2、0E3、0E4、0E5、0E6和0E8的DRK1基因的表達量分別為 8. 2, 6. 2，1. 8, 5. 1，6. 5，12, 7. 9。
[0098] 表明，T1代轉(zhuǎn)DRK1水稻中DRK1基因的表達量高于野生型水稻，為過表達DRK1水 稻。
[0099] 采用同樣方法將空載體pCUbi 1390轉(zhuǎn)入野生型水稻中，得到T0代轉(zhuǎn)pCUbi 1390水 稻，收種、播種，得到T1代轉(zhuǎn)pCUbil390水稻。
[0100] 2、DRK1基因 RNA干擾水稻的獲得
[0101] 將上述獲得的質(zhì)粒pCUb i 1390- Λ FAD2-SX通過熱激的方法轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌 ΕΗΑ105中，得到重組菌，提取質(zhì)粒，送去測序，質(zhì)粒為pCUbil390- Λ FAD2-SX，含有該質(zhì)粒的 重組菌命名為 EHA105/pCUbil390- Λ FAD2-SX。
[0102] 將水稻日本晴的種子脫殼滅菌，接種到誘導(dǎo)愈傷的培養(yǎng)基中。培養(yǎng)3周后，從盾片 處生長出愈傷組織，挑選生長旺盛，顏色淺黃，比較松散的胚性愈傷，用作轉(zhuǎn)化的受體。
[0103] 將上述獲得的EHA105/pCUbil390- Λ FAD2-SX侵染胚性愈傷，在黑暗處25°C培養(yǎng) 3天后，在含有50mg / L潮霉素的選擇培養(yǎng)基上篩選潮霉素抗性植株。將潮霉素抗性植株 在陰涼處煉苗，幾天后移栽到水田，得到T0代轉(zhuǎn)DRKIRNAi水稻。
[0104] T0代轉(zhuǎn)DRKIRNAi水稻植株收種后播種得到T1代轉(zhuǎn)DRKIRNAi水稻植株。
[0105] T1代轉(zhuǎn)DRKIRNAi水稻植株生長1個月后，提取葉片的RNA反轉(zhuǎn)錄得到cDNA作為 模板，用載體上的引物 1390-F(10707-10730) :TGCCTTCATACGCTATTTATTTGC 和 FAD2-R(1082 7-10846) :GAAGCGACGGACCTGGAGAT進行定量PCR。以野生型水稻（WT)為對照。
[0106] 內(nèi)參為 Ubiquitin，內(nèi)參的引物為 UBI_F:ACCCTGGCTGACTACAACATC 和 UBI-R:AGTTGACAGCCCTAGGGTG。結(jié)果如圖2顯示，野生型水稻中DRK1的表達量為2. 0,而 T1代轉(zhuǎn)DRKIRNAi水稻中RNAi-1, RNAi-3, RNAi-4和RNAi-5中DRK1基因的表達量分別為 0. 8, 0. 8, 0. 2和1. 1，均低于野生型水稻。
[0107] 表明，T1代轉(zhuǎn)DRKIRNAi水稻中DRK1基因的表達量低于野生型水稻。
[0108] 采用同樣方法將空載體pCUbil390_ Λ FAD2轉(zhuǎn)入野生型水稻中，得到T0代轉(zhuǎn) pCUbi 1390- Λ FAD2水稻，收種、播種，得到T1代轉(zhuǎn)pCUbi 1390- Λ FAD2水稻。
[0109] 三、過表達轉(zhuǎn)DRK1水稻和RNA干擾轉(zhuǎn)DRKIRNAi水稻的表型鑒定
[0110] 將編號為0E1和0E8的T1代轉(zhuǎn)DRK1水稻、編號為RNAi-4的T1代轉(zhuǎn)DRKIRNAi水 稻、野生型水稻（WT)、T1代轉(zhuǎn)pCUbil390水稻和T1代轉(zhuǎn)pCUbil390- Λ FAD2水稻的種子播 種后，培養(yǎng)3周后澆透水，然后不再澆水進行自然干旱處理，生長7天后，然后恢復(fù)澆水，4天 后照相。每個株系30株，實驗重復(fù)3次，統(tǒng)計植株成活率和失水率。
[0111] 葉片失水率實驗方法為：生長3周水稻苗，取地上部分稱重（Ζ)，然后不再澆水進 行自然干旱處理，一定時間后稱取材料重量（Zt)，失水率=(z-zt)/Ζ*100%。
[0112] 結(jié)果如圖3所示，Α為表型觀察，Β為成活率，C為失水率；
[0113] 從圖3A中可以看出，干旱處理前，野生型、T1代轉(zhuǎn)DRK1水稻和T1代轉(zhuǎn)DRKIRNAi 生長狀態(tài)沒有明顯差異；干旱處理后過表達植株失水最嚴重，其次是野生型日本晴，而干擾 植株生長最好；恢復(fù)澆水后干擾植株最快恢復(fù)正常，野生型較慢，而過表達植株出現(xiàn)大量旱 死植株。
[0114] 從圖3B中可以看出，編號為0E1和0E8的T1代轉(zhuǎn)DRK1水稻、編號為RNAi-4的T1 代轉(zhuǎn)DRKIRNAi水稻、野生型日本晴（WT)的成活率分別為12. 4%、21. 6%、83. 5%和34. 5% ;
[0115] 從圖3C中可以看出，
[0116] 編號為0E1的T1代轉(zhuǎn)DRK1水稻在自然干旱處理后1、2、3、4、5、6、711的失水率分 別為 30. 5、51· 2、72· 5、80· 4、85· 7、90· 1、92· 8 ;
[0117] 編號為0E8的T1代轉(zhuǎn)DRK1水稻在自然干旱處理后l、2、3、4、5、6、7h的失水率分 別為 32. 5、54· 6、73· 5、80· 4、88· 4、92· 5、95· 6 ;
[0118] 編號為RNAi-4的T1代轉(zhuǎn)DRKIRNAi水稻在自然干旱處理后l、2、3、4、5、6、7h的失 水率分別為 21. 2、30· 5、40· 5、45· 6、50· 4、53· 6、56· 7 ;
[0119] 野生型水稻（11')在自然干旱處理后1、2、3、4、5、6、711的失水率分別為25.7、45.2、 60. 3,75. 4,80. 4,85. 3,88. 6 ；
[0120] 從上述可以看出，編號為0E1和0E8的T1代轉(zhuǎn)DRK1水稻、編號為RNAi-4的T1代轉(zhuǎn) DRKIRNAi水稻、野生型水稻（WT)的失水率速度從快到慢的順序是0E8, 0E1，WT和RNAi-4。
[0121] 野生型水稻（WT)、T1代轉(zhuǎn)pCUbil390水稻和T1代轉(zhuǎn)pCUbil390- Λ FAD2水稻結(jié) 果無顯著差異。
[0122] 以上結(jié)果表明，DRK1編碼的蛋白與耐旱相關(guān)，干擾該蛋白的表達可以提高植物的 耐旱性。
[0001] 序爽表 < 11?)>? I小=1農(nóng)業(yè)科7:院作物科學研究所 <>水稻_.ν·Ι1Ι叉進丨?及U:編碼.肺、 <IH0>2 <210> I <211 > ；?)0? <2Ι2> !)ΝΛ <213> 水稻（.s',." / w) <400> 1 aIgggc c t ca c glg t galac acaaaclgca aaactggcca 1 la lac tael ageat teata 60 ctgctatgtc atgggattgg cf-u-icgtcgat tgccgtggga acagagccga tcagctctca 120 cl gel tgatl tcaagaaggg cat caccaac ga l-cca ta tg gagee 11 ggc cacttggaac 180 accagcacac atttctgtag gtggcaaggt gtcaagtgca cotccactgg gccatggcgc 240 gtcatggcgc tcaatctctc cagccaaagt ttgacaggcc aaataaggtc ctctctcgga 300 aacctatxct teettaatat acttgacctc ggegataata aettaettgg ctccttacct 360 cgccttggca atettaagea acttcaggca ctctatctgt ataaaaacaa tttgacaggg 420 ataattcctg atgaacttac aaattgttcc agettaaegt acatagacct ctcaggaaat 480
[0002] gccetauetg gti^cacticc iccaaatUa g^clclclKt ccanictuge ! tnlcttlal 540 ctltclgcga acaagctaac iggaaccalc ccgca^^ccc ?ig^caacal caccacclig 600 gtagaHutct alcUgaiac aaaicKaUc khhkkkkMch ttccagacaa Kctllggcaa 660 i tgccgHHcl tgacHiit til ggccctaggt caaiutcaigc t<ilcgggiga lalcccat t ? 720 and tcicca gccl ilcicl tcaacUlla agctlggaal acaataigt l cggcaaggia 780 ttgeeaeaaa aeattagtga tatggtaeet aatetecaaa ttettcgett ggattacaat 840 atgttccaug Kftcaaatccc alctlctcla ggarsalgcl t igcagctaac agauataagi 900 HlggCHanca actacttcac c^ggcaaait cciaRciclt icggaaagci itclaaacic 960 tcctatatta gtctcgaaaa taatagccta gaggcttctg atggccaagg ctgggagttc 1020 ct<icacgcgt tgcigiuiacig tcigtciatcin gnacigttgl cactggctca naatcagcla i080 CrUiggagaaa taccgaaiie aHltggggac cltccgclca aacllcnaca gciagtgelg 1140 agtgaaaata agclaicagg agaagUcca gcaagcatag gmiacctlca gggcclgllt 1200
[0003] aggitaagtc tagatt tgnn cnatcttHCt ggcaaa<itag atgagtgggi tccaaagcit 1260 acaaaacigc aaaaatIncl tctccacagg aacaaci ila gcggglegal iccatcglct 1320 ulugeagugc tIcctcgtit gteanegett teaetageat ataatgeatt tgatggtccc 1380 a lac cal cc t cat tggga<ia eel t tcagga clccagringt laial clang t cat hh Inal 1440 ctcgaagglg tcatacclcc agagcl tagt taccl taaac aaclaataaa tetaagti la i5i)() tcHgaanacn agcttnctgg ggagalcccl ggcacltiga gccagtglaa agacclg^cn 1560 ancaiccHHH Igggcaalaa cilccilaci ggeaalalce caglaaclii iggcgaccia 1620 nimmcclm Mcgtnctcaa tetttcccal aacagcitgl egggoacaat tccgactaca 1680 clHiuitgal.c iaccagt.cat gr!grafuu:t g gacitl ? I cal acaat cgU:t ct:aaggn.aaa 17*10 ataccaatga etggaatatt tgcaaatcct actgttgttt cggtccaggg aaacatagga 1H00 clalgt^gag krHglgatgi4a iclccgiatkr eceecalgec aaKURttie ccagagaaga I860
[0004] aaaacacagi aciatttgal lagagtaiig aiccctaiai iiggcttcat gtcactcata 1920 iUigiggicl acl id iaci icitgagriHg algangccaa ?ξη^ηηηηη?η laUitcclcK 1980 caaicttitg gtgagaallt cctlanagtc IcataiaHtg atclagctca agccncaaga 2040 aa(:t tr丨（，gg aggrUmrcl lat t ggraaa glacggtgtH cagagKtaag 2100 ? tgauggaai aglugccgig aa^lUttg accllgagal gcgak rKftKrcc 2160 gaaagaagct tcatatcgga alKlgaagcl clcaguagca licaacalag aaalciicli 2220 ccaatcataa cl^caigctc gaccgtggac agtacgggca acgiltlcaa agtittagil 2280 iacgaglacH tgcctnntgg enacUggHC actt^galac rngncaanga ggglgggaaa 2340 gcteeeggac gtttgggttt aagaeaaaca attageatat gtgttaacat ageegatgea 2400 ctggaciati iacjauealga algeggaaga HeHHcjlaLee at Igigaiit gaaacccagc 2460 aaiataclit tagctgatga catgaatgct cttilgggag altltggcat tgcaagalti 2520 tatatcgact ciigglcgac alcaacaggi tcgaatagta cagtcggtgt taagggtacc 2580
[0005] alaggglala t tcclccaga gincgcgggH ggiggicatc catctaclIc tggggalgil 2640 taiiigtl leg ggcitagigal cctggagct i aiaacaggaa aaagaccgac Igalccialg 2700 ttcaaagacg gactcgacat tatcagcttt gtegagagta aettteeaca eeagatattt 276() caugigalig algctcgact egeuguaang tccatggact ccaalcaaac aaatatgnca 2H20 ciggaanalg clgtccaccn glM^ltgatn tctclgctac aacltgeget t ictigtac^ 2HH0 cgcaaattac caagigatcg catgaacalg aaacaaatag ccaacaagal gcaltcaatc 2940 aagacgacat atg11 gga11 ggaage taag aaata t ggtc cggeatgtaa tgaacaagat 3000 geatga 3006 <210> 2 <211> 1001 <212>邂--序列 <213> 水稻（Or/烈分? ? / ra) <400> 2
[0006] Mel (i 1 y Leu Thr Cys Asp Thr (iln Thr Mn Ly.s Luu Ala lie 1 le Leu 1 5 10 16 I.ou Μη Hit： I 1 v Luu Luu Cvs His (；lv I 1 e G1 y Asn Val Asp €ys Arg 20 25 30 Gly Asn Arg Ala A.sp (!ln Leu Scr Ixhj Lou Asp I'he Lys Lys (11 y I te 35 40 45 Thr /\,sn A.sp Pro Tyr (!ly Ala Leu Ala Thr Trp Asn Thr Scr Thr His m 55 60 Phe Cys Arg Trp (；ln (Sly Val Lys Cys I'hr Her 1'hr (Uy Pro Trp Arg 65 70 75 80 Val Mui Ala Luu Asn Leu Sur Sur (；ln Bur Lou Thr Gly Gin lie Arg 85 90 95
[0007] Her Sur Leu (Π y A.sn Leu Ser Phe Luu Asn [ 1 e Luu A.sp Leu G1 y Asp 100 105 110 Asn A.sn Leu Lou (Π y Ser Leu Pro Arg Lou Gly hsn Leu I,vh (Jin Leu 05 120 125 (--η Λ In Leu Tyr Leu 1'vr Lys A.sn Asn Lou Thr (?! y lie 1 !0 l*ro Asp 130 135 140 (!lu Leu Thr Asn Cvs Ser Sor I,cu Thr Tyr lie Asp Lou Her (；ly A.sn 145 150 15S 160 Λ1 a Leu Thr (Hy Ala Leu Pro Pro i\sn U)u《!ly Ser U)u St*r Asn Luu 16S 170 175 Ala Tvr Leu Tyr Lt>u Scr Ala ksn Lys Luu I'hr Gly Thr lit* Fro Gin 180 185 190
[0008] Μη Leu Gly hm lie Thr Thr l,eu Vh! {；!u He Tyr Leu Asp Thr Asn 195 200 205 Arg Fhe (Jlu (Hy (!Iy lie Pro Asp Lys Ιληι Trp (!In Luu Pro Asn l.uu 210 215 220 Thr lie Leu Ala Luu (!Iy (!In Asn Mel Ιληι Her (!ly A.sp Ik; Pro I'hu 225 230 235 240 Asn Phe Ser Ser Leu Ser lx*u (；ln Luu Lou St;r Leu (ilu I'yr Asn Mel 245 250 2F55 lJhe Cly Ly.s Val Luu Pro Gin Asn lie Ser Asp Mel Val Ι1γο Asn Leu 260 265 270 (IIn i le Leu Arg Luu Asp Tyr Asn Met IJhc (Sin Cly (Jin I 1 c Fro Ser [0009] 9k(\ 9 闕 Sor Lou Glv Asn Ala l.eu (；ln l.eu Thr (ilu Me Ser Met. .Ala Asn /\sn 290 295 300 Tyr Pne Thr Gly Gin lie Fro Ser Ser rne Gly Lys Leu Ser Lys Leu 305 310 315 320 Ser Tyr lie Ser Leu Glu Asn Asn Ser Leu Glu Ala Ser Asp Gly Gin οο? oqn qoc *J￡tO kjkXxj *Jkj%j (；ly Trp Glu Phe Leu llis Ala Leu Arg Asn t:ys Ser Asn Leu (ilu Leu 340 345 350 Leu Ser Leu Ala (；ln Asn (；In l.eu Gin (ily (Ilu I le Pro Asn Ser "e qkk oan qac
[0010] {} 1 y Asp Leu l》r(i Lull l.ys Leu (iln (--η Leu Val Luu Ser (Hu Ληιι Ly.s 3TO 375 380 Leu Ser (!]y Glu VaI lYo Ala Ser lie (Hy Asn Leu (Hn Gly Leu iJhe 385 390 395 400 Arg Lou Ser Leu Asp Leu Asn Ακη Leu Thr Cly Ly.s I]e Asp Glu Trp 405 410 415 Va 1 Pro Lys Lou Thr Lys l,ou (iln Lys Lou Leu Leu His Arg Asn Asn 420 425 430 Phe Ser Gly Ser lie Pro Sor Ser lie Ala Glu Leu Pro Arg Leu Ser 435 440 445 Thr Leu Ser Leu Ala Tyr Asn Ala Fhe Asp G1y Pro 11e Fro Ser Ser 450 45S 460
[0011] Leu (Sly Asn Leu Gly Leu (iln Lys Leu Tyr Luu Her Hi? Ann ksn 46S 4?0 475 480 Leu Glu (i 1 y Vn 1 11 e [?γο I^ro (ilu Luu Ser Tyr Lou Lys (Hn Luu lie 485 490 495 Asn Lou Ser Leu Ser Glu Asn Lys Leu Thr Glv Glu He FVo Gly Thr 500 505 510 Leu Se-r (? I n Cys Lys Λκρ l,eu Λ la i\sn lie (-- n Met Gly Asn Asn Pho 515 520 525 Leu Thr Gly Asn lie Pro Val Thr Phc Gly Asp Leu Lys Scr Lou Gly 530 535 540 Val Leu Asn Leu Ser Πis Asn Ser Leu Ser G1y Thr 11e Fro Thr Thr 54S 5S0 5S5 560
[0012] Leu Ληπ Asp Leu Pro Val Met Her Lys Leu Asp Lou Her Tyr Asn Arg 565 570 575 Lull (--η (Jly Lys 1 I c Pro Mel 1'hr (Sly I I e Phe ΛI a A.sn Pro Thr Vh I 5H0 585 590 Vh 1 Sur. Val Oln (!Iy Λκιι I Iu (Sly Leu Cys (!Iy (!ly Val Met Asp l.uu 595 ?00 605 Arg Mel Pro Pro Cys (；lri Val Val Scr (iln Ar? Arg Lys Thr Glri Tvr BIO HI 5 ?20 Tyr Luu I 1 o Arg Val Leu 11 e Pro llu Phe (Sly Phe Mel Scr Luu 1 Ic 625 H30 635 640 Luu Val Val I'yr l^c Ι,υιι l.eu Luu (Slu Lvs Met Lys Ι^? Arg (!lu Lys
[0013] 645 650 65Β Tyr lie Sor Sor Gin Sor Fho (；ly (--ιι Asn Phe Lou Lvs Vat Sor Tyr 660 665 670 Asn Asp Leu Ala Gin Ala Thr Arg Asn Fhe Ser Giu Ala Asn Lou lie 675 680 685 Civ Lys Giy Ser Tyr (ily Thr Val Tyr Arg Giy Lys Leu Lys Glu Cys 690 695 700 Lys Leu Glu Va.l Ala Val Lys Val Phc Asp I.cu Glu Mot Arg Giy Ala 705 710 715 720 Glu Arg Ser Phc He Ser Glu Cys Glu Ala I.eu Arg Ser Tie Gin His 725 730 735
[0014] Arg Asn Leu Leu Pro lie lie I'hr Ala Cvh Ser 1'hr Vnl Asp Ser Thr 740 745 750 Gly A.sn Va 1 l*hu Lys Ala Leu Val Tyr (!lu Tyr Mul I'ro Asn (!lv hsn 755 760 765 Leu Asp Thr Trp I "is Asp Lys (!lu Gly Gly Lys Ala Pr<? (ily Arg 770 775 780 Laii Gly 1 x?u Arg (；In Thr I 1 e Scr lit' Cys Val Asn lie ΛΙη Asp Mn 785 TOO 795 800 Leu Asp Tyr L-eu Ilis Ilis (ilu Cys (；ly Arg Thr 1'hr I 1 ο IIis Cys Asp SOS 810 815 Leu Lvs Fro Sur A.sn Ho Leu Luu Alu Asp Asp Met Asn Ala Leu Leu 820 825 830
[0015] (Π y Asp Fhe (-- y I I c ΛΙη Arg Phe I'yr lit； Asp Ser Trp Set* Thr Her 835 840 84S Thr (;ly Ser hsn Ser Thr VhI (11 y Val Lvs Gly Thr lie (； I y I'yr l 1 c 850 855 860 Pro Pro (ilu Tyr Λ la (!Iy (!!v Glv II is Pro Sor Thr Her (Hy Asp Val 865 870 875 880 Tyr Ser i^c (!ly 1 1 o Val 11 e I,cu (；Iu 1 ,οιι I le Thr (!ly Lys Arg Pro 885 890 895 Thr Asp Pro Mt'l- 1?) Lys Λχρ《!I y Ix'u Asp 11e I Iu St)r 1?) VhI (;I u 900 90S 910 Sur Asn Fhe Pro 11 i s Gin lie Fhc Gin Vul 11c Asp Ala Arg Leu Alu 915 920 925
[0016] (!lu Lys Her Mol Asp Her Asn (iln Thr Asri Met Thr Leu (11 u Asn Ala 930 935 940 Va 1 ilis (Jin Cys Luu 1 Ic Sur Leu Leu (Iln Ιληι Ala Lt；u St；r Cys Thr 945 950 955 960 Arg Lvs Leu Pro Sur Asp Arg Mel Ann Met Lys Gin lit! Ala Ann I.y.s mm 970 975 Met Ilis Scr Ik; l,ys Thr Thr I'yr Val C!Iy Uui (!lu Ala Ly.s Ly.s Tyr 980 985 99() (:I y Pro Λ hi Cys Asn G1 li G1 π Asp Ala 995 1()0()
【權(quán)利要求】
1. 一種蛋白，是如下（a)或（b): (a) 由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b) 將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺 失和/或添加且與植物耐逆性相關(guān)的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。
2. 編碼權(quán)利要求1所述蛋白的DNA分子。
3. 如權(quán)利要求2所述的DNA分子，其特征在于：所述DNA分子是如下（1)或（2)或（3) 的DNA分子： (1) 編碼區(qū)為序列表中序列1所示的DNA分子； (2) 在嚴格條件下與（1)限定的DNA序列雜交且編碼與植物耐逆性相關(guān)蛋白的DNA分 子； (3) 與（1)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、 至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同 源性且編碼與植物耐逆性相關(guān)蛋白的DNA分子。
4. 抑制或沉默權(quán)利要求1所述蛋白表達的物質(zhì)在調(diào)控植物耐逆性中的應(yīng)用。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于：所述抑制或沉默權(quán)利要求1所述蛋白表 達的物質(zhì)為重組載體、含有重組載體的轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌； 所述重組載體為將DNA片段1和DNA片段2均插入雙元表達載體中，得到的抑制或沉 默權(quán)利要求1所述蛋白表達的重組載體；所述DNA片段1的編碼區(qū)與所述DNA片段2的編 碼區(qū)互為反向互補；所述DNA分子1編碼區(qū)的核苷酸序列為序列表中序列1自5'末端第1 位-499位核苷酸。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的應(yīng)用，其特征在于： 所述調(diào)控植物耐逆性為提高植物耐旱性； 所述植物具體為雙子葉植物或單子葉植物；所述單子葉植物進一步具體為水稻。
7. 重組載體、含有重組載體的轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌： 所述重組載體為將DNA片段1和DNA片段2均插入雙元表達載體中，得到的抑制或沉 默權(quán)利要求1所述蛋白表達的重組載體；所述DNA片段1的編碼區(qū)與所述DNA片段2的編 碼區(qū)互為反向互補；所述DNA分子1編碼區(qū)的核苷酸序列為序列表中序列1自5'末端第1 位-499位核苷酸。
8. 含有權(quán)利要求2或3所述DNA分子的重組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌； 所述重組載體為將權(quán)利要求2或3所述DNA分子插入表達載體中，得到表達權(quán)利要求 1所述蛋白的重組載體。
9. 權(quán)利要求1所述蛋白、權(quán)利要求2或3所述DNA分子或權(quán)利要求8所述重組載體、表 達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌在調(diào)控植物耐逆性中的應(yīng)用； 所述調(diào)控植物耐逆性具體為降低植物耐旱性； 所述植物具體為雙子葉植物或單子葉植物；所述單子葉植物進一步具體為水稻。
10. -種培育轉(zhuǎn)基因植物B的方法，為抑制目的植物中的權(quán)利要求1所述蛋白的活性或 表達，得到轉(zhuǎn)基因植物B，所述轉(zhuǎn)基因植物B的耐旱性高于所述目的植物； 所述抑制目的植物中的權(quán)利要求1所述蛋白的活性或表達具體為將權(quán)利要求5或6所 述應(yīng)用中的所述重組載體或權(quán)利要求7所述的重組載體導(dǎo)入所述目的植物； 或一種培育轉(zhuǎn)基因植物A的方法，為將權(quán)利要求2或3所述DNA分子導(dǎo)入目的植物中， 得到轉(zhuǎn)基因植物A，所述轉(zhuǎn)基因植物A的耐旱性低于所述目的植物； 所述將編碼權(quán)利要求1所述蛋白的DNA分子具體通過權(quán)利要求8所述重組載體導(dǎo)入目 的植物； 所述目的植物具體為雙子葉植物或單子葉植物；所述單子葉植物進一步具體為水稻。
【文檔編號】C12N1/21GK104098662SQ201310123317
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2013年4月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月10日
【發(fā)明者】萬建民, 吳赴清, 林啟冰, 王潔, 郭秀平, 王久林, 程治軍, 張欣 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所