專利名稱：水稻或水稻加工品中Bt基因快速檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)產(chǎn)品檢驗(yàn)領(lǐng)域，涉及水稻或水稻加工品中Bt基因快速檢測方法。
背景技術(shù)：
隨著全球人口急速邁向70億關(guān)口，轉(zhuǎn)基因作物的種植面積在連續(xù)猛增15年之后繼續(xù)攀升。據(jù)國際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)中心(the International Service for theAcquisition of Agr1-biotech Applications, ISAAA)統(tǒng)計，2011 年全球轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物種植面積達(dá)到1.6億公頃。2011年，種植轉(zhuǎn)基因作物的國家有29個，其中，主要種植國家為美國、巴西、阿根廷、印度、加拿大和中國。我國轉(zhuǎn)基因作物的種植面積居世界第6位，在2011年達(dá)到了 390萬公頃[1]。2009年11月，我國農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)了華恢I號和Bt63抗蟲水稻在湖南省種植的安全證書，這說明轉(zhuǎn)基因水稻在我國的商業(yè)化種植指日可待。轉(zhuǎn)基因作物對人體健康及生態(tài)環(huán)境的潛在風(fēng)險一直以來備受關(guān)注[2_3]。由于轉(zhuǎn)基因食品缺乏長期的安全性試驗(yàn)數(shù)據(jù)，因而長期的食用安全無法確定，歐盟、美國、日本及我國等許多國家都相繼制定了轉(zhuǎn)基因生物的管理法規(guī)，對轉(zhuǎn)基因食品采取標(biāo)簽管理和溯源管理制度。2012年，中國出口到歐盟的米制品，由于被檢出含有轉(zhuǎn)基因成分，頻頻遭到審查、通報、撤架。因此，為保護(hù)我國的貿(mào)易出口，迫切需要建立一種準(zhǔn)確、特異、快速的轉(zhuǎn)基因作物檢測方法。傳統(tǒng)的核酸檢測操作步驟繁瑣，檢測時間較長因此不適合于現(xiàn)場實(shí)時檢測和跟蹤檢測；并且需要PCR擴(kuò)增儀等昂貴的設(shè)備，檢測成本高，對檢驗(yàn)人員的知識、操作水平要求高，不能滿足現(xiàn)行的核酸檢測現(xiàn)場監(jiān)管需要。與原料的轉(zhuǎn)基因檢測相比，加工品經(jīng)過若干道加工程序，原料DNA在加工過程中不可避免的遭到一定程度的降解 ，加工過程中出現(xiàn)的某些物理、化學(xué)或酶因子也會影響DNA的質(zhì)量，并且會對核酸的擴(kuò)增產(chǎn)生抑制效應(yīng)，這些因素都增加了加工品中轉(zhuǎn)基因成分檢測的難度。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種水稻或水稻加工品中Bt基因快速檢測方法。本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):水稻或水稻加工品中Bt基因快速檢測方法，包含如下步驟:( I)提取水稻或水稻加工品基因組DNA ；(2)以步驟(I)提取的基因組DNA為模板，以上游外引物F3:SEQ ID N0.1、下游外引物B3:SEQ ID N0.2、上游內(nèi)引物FIP:SEQ ID N0.3、下游內(nèi)引物BIP:SEQ ID N0.4進(jìn)行LAMP擴(kuò)增；(3)擴(kuò)增產(chǎn)物用兩種方法進(jìn)行檢測:A.2%瓊脂糖凝膠電泳，電泳完畢，凝膠成像系統(tǒng)拍照成像，如果電泳結(jié)果呈現(xiàn)LAMP典型的梯狀條帶，則說明水稻或水稻加工品中含有Bt基因；B.取15 ii L反應(yīng)產(chǎn)物，加入2 ii L SYBR Green I染料，片刻后對結(jié)果直接進(jìn)行可視化觀察，若反應(yīng)液顯示綠色熒光，則樣品中含有Bt基因，若顯示淺橙色則為陰性結(jié)果。其中，所述的水稻加工品優(yōu)選大米、米飯或米酒。所述的LAMP 反應(yīng)體系為:10XThermopol Reaction Buffer2.50 μ L, 25mMMgCl23.00 μ L,20mM dNTPs3.50 μ L，8U/μ L Bst DNA 聚合酶 0.80 μ L，20 μ M 上游內(nèi)引物FIP1.60 μ L，20 μ M 下游內(nèi)引物引物 ΒΙΡ1.60 μ L, 10 μ M 上游外弓I 物 F30.25 μ L，10 μ M 下游外引物Β30.25yL，5M甜菜堿1.00 μ L，IOOng/μ L DNA模板1.00 μ L，無核酸酶純水
9.50 μ L，共計 25 μ L0所述的LAMP反應(yīng)程序?yàn)?61°C恒溫反應(yīng)60min，80°C保溫IOmin終止反應(yīng)。有益效果:本發(fā)明通過一系列的LAMP反應(yīng)體系、反應(yīng)條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)及引物特異性實(shí)驗(yàn)，成功地建立了米制品中Bt基因的LAMP快速檢測方法，檢出限達(dá)到0.005%，該法具有操作簡單、不需要特殊儀器、結(jié)果易于觀察的優(yōu)點(diǎn)，適合于基層推廣。并且，考慮到水稻加工品加工過程中DNA的降解，本發(fā)明設(shè)計的LAMP引物能夠?qū)U(kuò)增片段的大小控制在合適的范圍，避免擴(kuò)增片段大導(dǎo)致假陰性結(jié)果和擴(kuò)增片段小降低反應(yīng)特異性的缺點(diǎn)。


圖1用于LAMP引物設(shè)計的部分Bt基因序列。圖2LAMP檢測轉(zhuǎn)基因水稻的特異性試驗(yàn)檢測結(jié)果，其中M:DNA marker ；1 ;轉(zhuǎn)基因水稻2:非轉(zhuǎn)基因水稻；3: 空白對照。圖3不同Mg2+濃度對LAMP反應(yīng)擴(kuò)增效果的影響，其中，A:LAMP反應(yīng)凝膠電泳結(jié)果；B =LAMP 反應(yīng)后加入 SYBR Green I 染色結(jié)果；M =Marker DM2000 ;l:Mg2+濃度為 ImM ；2:Mg2+濃度為2mM ;3:Mg2+濃度為3mM ;4:Mg2+濃度為4mM ;5:Mg2+濃度為5mM ;6:Mg2+濃度為6mM。圖4不同Bst DNA聚合酶添加量對LAMP反應(yīng)擴(kuò)增效果的影響，其中A =LAMP反應(yīng)凝膠電泳結(jié)果；B:LAMP反應(yīng)后加入SYBR Green I染色結(jié)果；M =Marker DM2000 ；1:Bst DNA聚合酶添加量為1.6U ；2:Bst DNA聚合酶添加量為3.2U ；3:Bst DNA聚合酶添加量為4.8U ；
4:Bst DNA聚合酶添加量為6.4U ；5:Bst DNA聚合酶添加量為8.0U。圖5不同反應(yīng)溫度對LAMP反應(yīng)擴(kuò)增效果的影響，其中A =LAMP反應(yīng)凝膠電泳結(jié)果；B =LAMP反應(yīng)后加入SYBR Green I染色結(jié)果；M:Marker DM2000 ；1:反應(yīng)溫度為56°C ；2:反應(yīng)溫度為57°C ；3:反應(yīng)溫度為58°C ；4:反應(yīng)溫度為59°C ；5:反應(yīng)溫度為60°C ；6:反應(yīng)溫度為61°C ；7:反應(yīng)溫度為62°C ；8:反應(yīng)溫度為63°C ；9:反應(yīng)溫度為64°C ；10:反應(yīng)溫度為65。。。圖6不同反應(yīng)時間LAMP反應(yīng)擴(kuò)增效果的影響，其中A =LAMP反應(yīng)凝膠電泳結(jié)果；B =LAMP 反應(yīng)后加入 SYBR Green I 染色結(jié)果；M:DM2000DNA Marker ; I 反應(yīng)15min ；2.反應(yīng) 30min ;3.反應(yīng) 45min ;4.反應(yīng) 60min ;5.反應(yīng) 75min。圖7LAMP引物特異性實(shí)驗(yàn)，其中A:LAMP反應(yīng)凝膠電泳結(jié)果；B =LAMP反應(yīng)后加入SYBR Green I染色結(jié)果；M:Marker DM2000; 1.非轉(zhuǎn)基因水稻；2.空白；3.轉(zhuǎn)基因水稻。圖8LAMP反應(yīng)實(shí)物樣品靈敏度試驗(yàn)，其中A =LAMP反應(yīng)凝膠電泳結(jié)果；B =LAMP反應(yīng)后加入SYBR Green I染色結(jié)果；M:Marker DM2000 ;1_8:標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)基因水稻樣品混入10%，5%，1%,0.5%,0.1%,0.05%,0.01%,0.005% 的樣品；9:非轉(zhuǎn)基因水稻；10:空白。圖9米飯和米酒的LAMP檢測，其中A =LAMP反應(yīng)凝膠電泳結(jié)果；B =LAMP反應(yīng)后加A SYBR Green I染色結(jié)果；M:DM2000DNA Marker ；A:轉(zhuǎn)基因大米；B:非轉(zhuǎn)基因大米；C:空白；1:蒸煮樣品；2:米酒發(fā)酵Id ；3:米酒發(fā)酵2d ；4:米酒發(fā)酵3d。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例11.1DNA的提取及提取物的檢測DNA提取方法參照GB/T19495.3-2004中的CTAB法。DNA質(zhì)量濃度和純度的測定:用紫外分光光度計分別測定核酸在260nm和280nm處的紫外吸收值，以260nm和280nm處的紫外吸收值的比值計算純度。取DNA濃度大于20ng/ii L，A260/280在1.7 2.0之間的提取物作為模板。空白對照用無菌水做為模板。1.2引物設(shè)計選取GenBank發(fā)布的轉(zhuǎn)Bt水稻中含有的蘇云金芽孢桿菌毒蛋白基因CrylAc(GeneBank accession number Y09787)基因做為擴(kuò)增模板,利用在線引物設(shè)計軟件PrimerExploer Version5.0 (https://primerexplorer.jp/lamp5.0.0/index, html)進(jìn)行弓I物設(shè)計(圖1)，引物設(shè)計完成后，進(jìn)行在線BLAST檢測，最終在407到590區(qū)域共183bp處設(shè)計了一套LAMP反應(yīng)引物(F3、B3、FIP、BIP),由上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物序列見表
1表ILAMP反應(yīng)引物序列
權(quán)利要求
1.水稻或水稻加工品中Bt基因快速檢測方法，其特征在于包含如下步驟: (1)提取水稻或水稻加工品基因組DNA； (2)以步驟(I)提取的基因組DNA為模板，以上游外引物F3:SEQID N0.1、下游外引物B3:SEQ ID N0.2、上游內(nèi)引物 FIP:SEQ ID N0.3、下游內(nèi)引物 BIP:SEQ ID N0.4 進(jìn)行 LAMP擴(kuò)增； (3)擴(kuò)增產(chǎn)物用兩種方法進(jìn)行檢測:A.2%瓊脂糖凝膠電泳，電泳完畢，凝膠成像系統(tǒng)拍照成像，如果電泳結(jié)果呈現(xiàn)LAMP典型的梯狀條帶，則說明水稻或水稻加工品中含有Bt基因；B.取15 μ L反應(yīng)產(chǎn)物，加入2 μ L SYBR Green I染料，片刻后對結(jié)果直接進(jìn)行可視化觀察，若反應(yīng)液顯示綠色熒光，則樣品中含有Bt基因，若顯示淺橙色則為陰性結(jié)果。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水稻或水稻加工品中Bt基因快速檢測方法，其特征在于所述的水稻加工品為大米、米飯或米酒。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水稻或水稻加工品中Bt基因快速檢測方法，其特征在于所述的 LAMP 反應(yīng)體系為:10 X Thermopol 反應(yīng)緩沖液 2.50 μ L, 25mMMgCl23.00 μ L, 20mMdNTPs3.50μ L,8U/y L Bst DN A聚合酶0.80 μ L，20 μ M上游內(nèi)引物FIP1.60 μ L, 20 μ MTif內(nèi)引物引物ΒΙΡ1.60 μ L，10 μ M上游外引物F30.25 μ L，10 μ M下游外引物Β30.25μ L，5M甜菜堿 1.00 μ L，IOOng/ μ L DNA 模板 1.00 μ L，無核酸酶純水 9.50 μ L，共計 25 μ L。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水稻或水稻加工品中Bt基因快速檢測方法，其特征在于所述的LAMP反應(yīng)程序?yàn)?61°C恒溫反應(yīng)60min，80°C保溫IOmin終止反應(yīng)。
全文摘要
本發(fā)明屬于農(nóng)產(chǎn)品檢驗(yàn)領(lǐng)域，公開了水稻或水稻加工品中Bt基因快速檢測方法。該檢測方法以步驟(1)提取的水稻或水稻加工品基因組DNA為模板，以上游外引物F3:SEQ ID NO.1、下游外引物B3SEQ ID NO.2、上游內(nèi)引物FIPSEQ ID NO.3、下游內(nèi)引物BIPSEQ ID NO.4進(jìn)行LAMP擴(kuò)增；根據(jù)反應(yīng)結(jié)果判斷水稻或水稻加工品中是否含有Bt基因。本發(fā)明通過一系列的LAMP反應(yīng)體系、反應(yīng)條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)及引物特異性實(shí)驗(yàn)，成功地建立了米制品中Bt基因的LAMP快速檢測方法，檢出限達(dá)到0.005%，該法具有操作簡單、不需要特殊儀器、結(jié)果易于觀察的優(yōu)點(diǎn)，適合于基層推廣。
文檔編號C12Q1/68GK103205496SQ20131011956
公開日2013年7月17日 申請日期2013年4月8日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月8日
發(fā)明者肖紅梅, 劉佳, 宋尚新, 劉梅, 張艷芳, 索娜, 江玲 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)