專利名稱：一種同步檢測十八種發(fā)熱伴出疹病原體的試劑盒及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及發(fā)熱伴出疹病原體的檢測試劑盒及其檢測方法，尤其是涉及一種基于GeXP多重基因表達(dá)遺傳分析系統(tǒng)的同步檢測十八種發(fā)熱伴出疹病原體的試劑盒及其檢測方法。
背景技術(shù)：
發(fā)熱伴出疹性疾病是以發(fā)熱、出癥為主要臨床表現(xiàn)的疾病，包括麻疹、風(fēng)疹和其它RFIs，常以暴發(fā)形式發(fā)生?，F(xiàn)有的發(fā)熱伴出疹性疾病發(fā)病率高，尤對嬰幼兒人群危害更大，給人類健康與社會發(fā)展造成巨大威脅。該類疾病臨床癥狀一般表現(xiàn)較溫和，但嚴(yán)重的并發(fā)癥及其組織學(xué)相似性，使準(zhǔn)確診斷病原體并進(jìn)行辯證治療變得至關(guān)重要。目前對發(fā)熱伴出疹性疾病診斷如病原培養(yǎng)、血清學(xué)診斷和分子診斷等手段多數(shù)不夠準(zhǔn)確高效，延誤治療甚至造成嚴(yán)重后果。因此亟需建立發(fā)熱伴出疹病原體快速高效的診斷方法。目前，我國發(fā)熱伴出疹病原體的傳統(tǒng)檢測方法主要包括以下幾種:(I)病原體檢查:即直接做影像及活組織檢查，或病原體分離培養(yǎng)，之后在顯微鏡、電鏡下觀察，做出診斷。優(yōu)點(diǎn):成本低；對實(shí)驗(yàn)室硬件要求低。缺點(diǎn):1)耗時(shí)長:一般需3-5天或更長；2)診斷效率低:只能單菌純培養(yǎng)；對一些表型特征變異的病原體，用形態(tài)學(xué)經(jīng)驗(yàn)很難辨別；此外，由于抗生素的濫用，細(xì)菌在檢測過程中生長受到抑制，導(dǎo)致假陰性的結(jié)果；3)工作量巨大:由于對每個(gè)抽檢樣品的每種菌都必須進(jìn)行檢測，工作量非常巨大，特別是部分對培養(yǎng)環(huán)境要求較為苛刻的菌，更加大了檢測的工作量和難度。(2)免疫學(xué)檢查:應(yīng)用最廣泛的是酶聯(lián)免疫技術(shù)(ELISA): 一般先用一抗與抗原發(fā)生特異性結(jié)合，然后用通用的酶標(biāo)記的二抗與一抗發(fā)生特異性結(jié)合，再將酶顯色，之后觀察結(jié)果。優(yōu)點(diǎn):1)樣品通量較高:利用96孔酶標(biāo)板，一塊平板可完成多個(gè)樣品的檢測；2)較敏感:利用酶聯(lián)的特性，可將原來的抗原信號放大；3)快捷:在時(shí)間上，比傳統(tǒng)的培養(yǎng)基微生物培養(yǎng)檢查法要縮短很多。但存在如下缺點(diǎn):1)易出現(xiàn)假陽性:由于洗滌和抗原包被的操作，或由于抗原表面決定簇類似而發(fā)生交叉反應(yīng)，故易出現(xiàn)假陽性；2)耗時(shí)耗力:制作抗體是非常耗時(shí)耗力的工作；3)靈敏度不確定:實(shí)驗(yàn)的靈敏度取決于抗體的好壞，而每個(gè)抗體的好壞不一，質(zhì)量難以控制；4)無法檢測多變異的病毒:變異性較快的病毒，如甲流病毒，存在多種亞型，并且經(jīng)常變異，變異導(dǎo)致抗體失效，無法檢測抗原。(3)分子生物學(xué)——PCR檢測方法:目前經(jīng)常應(yīng)用的有實(shí)時(shí)熒光定量PCR、免疫PCR、反轉(zhuǎn)錄PCR等，都是針對病原體的特異性靶基因進(jìn)行檢測。其中，熒光定量PCR檢測方法最為成熟。熒光定量PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn):靈敏性高，并可精確定量，在對李氏桿菌、沙門氏菌、肉毒桿菌、大腸桿菌等的檢測中都取得了良好效果。2004年，中國發(fā)布了實(shí)施熒光定量PCR檢測禽流感H7亞型的國家標(biāo)準(zhǔn)。2009 年，美國FDA批準(zhǔn)了用熒光定量PCR檢測豬流感HlNl亞型的試劑盒。但也存在如下缺點(diǎn):1)通量低:一次只能檢測一個(gè)病原成分，如需要檢測多種病原菌，就需要多臺PCR儀同時(shí)工作，效率低，周期長，對大批量的多種病原污染的樣品更是無從下手；2)成本相對較高:因一次只能檢測一個(gè)病原體，當(dāng)一個(gè)樣品同時(shí)需要檢測多種病原菌時(shí)，必須一個(gè)一個(gè)檢測，成本相對增高。(4)分子生物學(xué)一基因芯片法:基因芯片是通過微加工技術(shù)，將數(shù)以萬計(jì)、乃至百萬計(jì)的特定序列的DNA片段(基因探針)，有規(guī)律地排列固定于硅片、玻片等支持物上，構(gòu)成的一個(gè)二維DNA探針陣列，利用這類芯片與標(biāo)記的生物樣品進(jìn)行雜交，可對樣品的基因表達(dá)譜生物信息進(jìn)行快速定性和定量分析。優(yōu)點(diǎn):1)高通量并行檢測:當(dāng)一個(gè)樣品同時(shí)需要檢測多種病原菌時(shí)，一次實(shí)驗(yàn)即可得出全部結(jié)果；2)操作簡便快速:整個(gè)檢測只需4-8小時(shí)基本可以出結(jié)果；但也存在如下缺點(diǎn):1)技術(shù)成本昂貴、復(fù)雜:每個(gè)樣品需要一個(gè)芯片，成本大于YlOOO/樣品，不利于大規(guī)模推廣；2)探針的合成與固定比較復(fù)雜，特別是制作高密度的探針陣列，是主要的限速步驟；3)不能精確定量，重復(fù)性差；4)靈敏度較低:芯片法需核酸量較大，一般須先做多重PCR擴(kuò)增，由于引物較多，容易自身產(chǎn)生二聚體，發(fā)夾結(jié)構(gòu)，或由于Tm值不同，而導(dǎo)致擴(kuò)增目的片段效率不同，進(jìn)而影響檢測的靈敏度；5)由于芯片的種類較多，難以制定一個(gè)統(tǒng)一的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。Gen0meLabTMGeXP多重基因表達(dá)遺傳分析系統(tǒng)基于貝克曼公司成熟的毛細(xì)管電泳分離技術(shù)及高靈敏度的激光誘導(dǎo)熒光技術(shù)研發(fā)而成，一束8道的毛細(xì)管陳列設(shè)計(jì)充分利用了 96孔板的排列特性，降低了使用更大的陳列帶來的花費(fèi)和復(fù)雜性。采用多重PCR方法，通過Beckman Coulter染色標(biāo)記,在同一個(gè)EP管中同時(shí)分析多個(gè)基因的表達(dá),能快速有效地檢測基因的表達(dá)狀況，克服了上述發(fā)熱伴出疹病原體的傳統(tǒng)檢測方法存在的缺陷，具有以下優(yōu)點(diǎn):1、高通量:本系統(tǒng)采用雙(96孔)板、自動加樣和樣品追蹤技術(shù)，實(shí)現(xiàn)單個(gè)反應(yīng)檢測30-40個(gè)位點(diǎn)，可同時(shí)做192個(gè)反應(yīng)(如192個(gè)患者樣品，每個(gè)樣品檢測30種腹瀉病毒，30個(gè)位點(diǎn))，一天出結(jié)果 ；對于交叉感染患者，本方法可一次性給出準(zhǔn)確報(bào)告，避免漏檢。2、準(zhǔn)確性強(qiáng):GeXP采用毛細(xì)管電泳對PCR產(chǎn)物進(jìn)行分離檢測，可將非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物、引物二聚體和特異性擴(kuò)增產(chǎn)物分離，最大程度降低假陽性；3、敏感性高，結(jié)果重復(fù)性好:GeXP系統(tǒng)克服了傳統(tǒng)PCR擴(kuò)增方法的不均等擴(kuò)增造成的偏差，提高了對一套目的基因進(jìn)行定量的速度和敏感性，采用激光誘導(dǎo)熒光-PMT，具有超聞靈敏度；4、方法簡便，使用經(jīng)濟(jì)=GeXP提供從試劑、多重PCR引物設(shè)計(jì)、結(jié)果及定量表達(dá)譜分析等全套實(shí)驗(yàn)方案；每個(gè)樣品的檢測成本少于￥50，利于大規(guī)模推廣；5、精確定量、靈活性強(qiáng):可精確定量病原體基因拷貝數(shù)，可隨時(shí)根據(jù)需求調(diào)整檢測的靶基因。6、易于實(shí)現(xiàn)自動化:就樣品制備而言，Biomek系列自動液體處理儀可以與GeXP分析儀和Ampligrid擴(kuò)增儀完全匹配，集成的條形碼閱讀器保證了準(zhǔn)確的樣品追蹤和結(jié)果報(bào)
生口 ο目前，國內(nèi)外還沒有關(guān)于基于GeXP多重基因表達(dá)遺傳分析系統(tǒng)的同步檢測十八種發(fā)熱伴出疹病原體的試劑盒及其檢測方法的相關(guān)研究報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種特異性強(qiáng)、靈敏度高、通量高、可靠性強(qiáng)、成本低、無假陰性結(jié)果的基于GeXP多重基因表達(dá)遺傳分析系統(tǒng)的同步檢測十八種發(fā)熱伴出疹病原體的試劑盒及其檢測方法。本發(fā)明解決上述技 術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為:一種同步檢測十八種發(fā)熱伴出疹病原體的試劑盒，包括DEPC水、5 X RT緩沖液、反轉(zhuǎn)錄引物、反轉(zhuǎn)錄酶、X溶液、10 XPCR緩沖液、PCR引物、25mM氯化鎂溶液、DNA聚合酶和陽性對照品，所述的反轉(zhuǎn)錄引物包括以下表I中五種發(fā)熱伴出疹病原體的R T擴(kuò)增引物及人RNA內(nèi)參的RT擴(kuò)增引物，所述的PCR引物包括表I中余下十三種發(fā)熱伴出疹病原體的正反向PCR擴(kuò)增引物、單純皰疹病毒1，2通用型的正反向PCR擴(kuò)增引物、人DNA內(nèi)參的正反向PCR擴(kuò)增引物、反應(yīng)內(nèi)參的正反向PCR擴(kuò)增引物以及上述五種發(fā)熱伴出疹病原體的PCR擴(kuò)增引物與人RNA內(nèi)參的PCR擴(kuò)增引物，基因序列如下表I所示:
權(quán)利要求
1.一種同步檢測十八種發(fā)熱伴出疹病原體的試劑盒，包括DEPC水、5 X RT緩沖液、反轉(zhuǎn)錄引物、反轉(zhuǎn)錄酶、X溶液、IOXPCR緩沖液、PCR引物、25mM氯化鎂溶液、DNA聚合酶和陽性對照品，所述的反轉(zhuǎn)錄引物包括以下表中五種發(fā)熱伴出疹病原體的RT擴(kuò)增引物及人RNA內(nèi)參的RT擴(kuò)增引物，所述的PCR弓丨物包括表中余下十三種發(fā)熱伴出疹病原體的正反向PCR擴(kuò)增引物、單純皰疹病毒1，2通用型的正反向PCR擴(kuò)增引物、人DNA內(nèi)參的正反向PCR擴(kuò)增引物、反應(yīng)內(nèi)參的正反向PCR擴(kuò)增弓I物以及上述五種發(fā)熱伴出疹病原體的PCR擴(kuò)增引物與人RNA內(nèi)參的PCR擴(kuò)增引物，基因序列如下表所示:
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種同步檢測十八種發(fā)熱伴出疹病原體的試劑盒，其特征在于:所述的X溶液為包括三磷酸脫氧核苷酸和通用引物，所述的通用引物正向擴(kuò)增引物序列為AGGTGACACTATAGAATA ；反向擴(kuò)增弓丨物序列為GTACGACTCACTATAGGGA，所述的通用弓I物正向擴(kuò)增引物帶熒光標(biāo)記。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種同步檢測十八種發(fā)熱伴出疹病原體的試劑盒，其特征在于:所述的陽性對照品連接有設(shè)計(jì)上述十八種發(fā)熱伴出疹病原體、單純皰疹病毒1，2通用型、RNA內(nèi)參、DNA內(nèi)參和反應(yīng)內(nèi)參的引物的基因保守序列的pMD18-T的克隆載體。
4.一種利用權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的同步檢測十八種發(fā)熱伴出疹病原體的試劑盒的檢測發(fā)熱伴出疹病原體的方法，其特征在于具體包括以下步驟: (1)采集樣本并提取核酸采集發(fā)熱伴出疹患者的鼻咽拭子、痰液、皰疹液或血液的分離培養(yǎng)物，從分離培養(yǎng)物中提取核酸； (2)以患者核酸為模板進(jìn)行RT反應(yīng) 取5-20ng/ul的核酸樣品RNA5 μ L，DEPC水8 μ L，5 X RT緩沖液4 μ L，RT引物溶液2 μ L，RT酶IyL混勻后加入到96孔樣品板上進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件:48° Cl分鐘；42° C60分鐘；95° C5分鐘；4° C直至收取RT產(chǎn)物，其中反轉(zhuǎn)錄引物溶液中各RT引物濃度均為500nM，RT引物包括五種發(fā)熱伴出疹病原體的RT擴(kuò)增引物及人RNA內(nèi)參的RT擴(kuò)增引物，基因序列如SEQ ID N0.1 N0.6所示； (3)以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR反應(yīng) 取RT產(chǎn)物8.6 μ L，10 X PCR緩沖液2 μ L，25mM的氯化鎂4 μ L，PCR引物溶液2 μ L，DNA聚合酶1.4 μ L，X溶液2 μ L混勻后加入到96孔樣品板上進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件:95° ClO分鐘；94° C30秒鐘，55° C30秒鐘，70° Cl分鐘，循環(huán)35次；70° Cl分鐘；4° C直至收取PCR產(chǎn)物；其中所述的X溶液為包括三磷酸脫氧核苷酸和通用引物，所述的通用引物正向擴(kuò)增引物序列為AGGTGACACTATAGAATA ;反向擴(kuò)增引物序列為GTACGACTCACTATAGGGA，所述的通用引物正向擴(kuò)增引物帶熒光標(biāo)記，PCR引物溶液中各PCR引物濃度均為200nM，PCR引物包括余下十三種發(fā)熱伴出疹病原體的正反向PCR擴(kuò)增引物、單純皰疹病毒1，2通用型的正反向PCR擴(kuò)增引物、人DNA內(nèi)參的正反向PCR擴(kuò)增引物、反應(yīng)內(nèi)參的正反向PCR擴(kuò)增引物以及上述五種發(fā)熱伴出疹病原體的PCR擴(kuò)增引物與人RNA內(nèi)參的PCR擴(kuò)增引物，基因序列如 SEQ ID N0.7 N0.44 所示； (4)GeXP遺傳分析儀毛細(xì)電泳分離樣品 取PCR產(chǎn)物I μ L，GeXP遺傳分析儀配套的上樣緩沖液38.75 μ L，DNA Marker0.5 μ L，礦物油一滴混合均勻后加入到96孔分離液板上進(jìn)行毛細(xì)電泳分離樣品，將GeXP遺傳分析儀的軟件獲得的圖譜與標(biāo)準(zhǔn)圖譜對比，判斷發(fā)熱伴出疹病原體的種類。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種同步檢測十八種發(fā)熱伴出疹病原體的試劑盒及其檢測方法，該試劑盒包括DEPC水、5×RT緩沖液、反轉(zhuǎn)錄引物、反轉(zhuǎn)錄酶、X溶液、10×PCR緩沖液、PCR引物、25mM氯化鎂溶液、DNA聚合酶和陽性對照品，特點(diǎn)是反轉(zhuǎn)錄引物包括五種發(fā)熱伴出疹病原體及人RNA內(nèi)參的RT引物，序列如SEQ ID NO.1～NO.6所示，PCR引物包括余下十三種發(fā)熱伴出疹病原體、單純皰疹病毒1,2通用型、人DNA內(nèi)參、反應(yīng)內(nèi)參的正反向PCR擴(kuò)增引物以及上述五種發(fā)熱伴出疹病原體與人RNA內(nèi)參的PCR擴(kuò)增引物，基因序列如SEQ ID NO.7～NO.44所示，優(yōu)點(diǎn)是特異性強(qiáng)、靈敏度高、通量高、可靠性強(qiáng)、成本低、無假陰性結(jié)果。
文檔編號C12R1/01GK103146841SQ20131003331
公開日2013年6月12日 申請日期2013年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月25日
發(fā)明者吳勇, 陳燕芬, 南麗, 黃迎彬 申請人:海爾施生物醫(yī)藥股份有限公司