專利名稱：一種具備疏密結(jié)構(gòu)的多孔細(xì)菌纖維素皮膚修復(fù)材料及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種多孔細(xì)菌纖維素皮膚修復(fù)材料及其制備方法，特別是涉及一種具備疏密結(jié)構(gòu)的多孔細(xì)菌纖維素皮膚修復(fù)材料及其制備方法，具體地說(shuō)是一種通過(guò)調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)液上方空氣氣壓以及氧氣濃 度來(lái)實(shí)現(xiàn)細(xì)菌纖維素薄膜的密疏雙層結(jié)構(gòu)，并在培養(yǎng)過(guò)程中加入緩釋微球制得具備疏密結(jié)構(gòu)的多孔細(xì)菌纖維素皮膚修復(fù)材料。
背景技術(shù)：
皮膚被覆蓋于人體全身表面，與外界環(huán)境直接接觸，是解剖學(xué)和生理學(xué)上的重要邊界器官。皮膚不僅能使人體不受到污染物或細(xì)菌的侵襲，也能保持人體水分不流失。由于皮膚對(duì)人體的重要保護(hù)作用，因此一旦皮膚發(fā)生大面積損傷或缺失時(shí)，便會(huì)對(duì)人體造成致命的傷害。皮膚不具備自修復(fù)的功能，為了修復(fù)、代替缺損的皮膚組織，各國(guó)的科學(xué)家都在致力于開發(fā)具有良好治療效果的人造皮膚。從結(jié)構(gòu)上來(lái)說(shuō)人體皮膚由表皮層和真皮層組成。表皮層在皮膚的最外層，表皮細(xì)胞彼此聯(lián)接緊密，主要起到抵抗外界刺激以及防御的功能，因此是皮膚結(jié)構(gòu)中最致密的一層。真皮層主要由膠原纖維和彈性纖維組成，主要起到保持皮膚彈性和張力的作用。由于真皮層中還富含血管、淋巴管以及毛發(fā)、皮脂腺、汗腺和肌肉，因此真皮層相較于表皮層結(jié)構(gòu)更為疏松。因此，從表皮層到真皮層，人體的皮膚在結(jié)構(gòu)上是具備一定梯度性的。早期的人造皮膚主要有網(wǎng)狀編織類人造皮膚，聚氨酯人造皮膚以及有機(jī)硅膜人造皮膚。這些早期人造皮膚無(wú)梯度變化，為均一結(jié)構(gòu)，因此應(yīng)用于臨床治療時(shí)不利于細(xì)胞的附著生長(zhǎng)，造成新生皮膚生長(zhǎng)緩慢從而延長(zhǎng)了傷口愈合時(shí)間和治療周期。具有梯度結(jié)構(gòu)的人造皮膚從結(jié)構(gòu)上來(lái)看更接近真實(shí)的皮膚，因此可以有效誘導(dǎo)缺損組織處細(xì)胞的遷移、增殖和分化。利用具有梯度結(jié)構(gòu)的人造皮膚原位誘導(dǎo)缺損皮膚再生，可以大大的縮短傷口愈合周期。此外，還可以增強(qiáng)創(chuàng)面愈合后的皮膚彈性、柔韌性和機(jī)械耐磨性以及減少瘢痕增生。因此，在設(shè)計(jì)人造皮膚材料時(shí)，通常應(yīng)模擬皮膚的表皮和真皮雙層結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)具有模擬表皮層和真皮層的雙層結(jié)構(gòu)人造皮膚。隨著組織工程技術(shù)的發(fā)展，組織工程皮膚已成為皮膚缺損治療的熱點(diǎn)，理想的組織工程皮膚能夠模擬天然皮膚的雙層結(jié)構(gòu)，具有三維多孔結(jié)構(gòu)能夠提供細(xì)胞向材料內(nèi)部粘附、增殖、分化的空間，同時(shí)多孔結(jié)構(gòu)也是獲得營(yíng)養(yǎng)和氧氣、排出代謝產(chǎn)物的通道以及血管化的場(chǎng)所。近幾年來(lái)，關(guān)于具有梯度結(jié)構(gòu)的人造皮膚的研究已經(jīng)取得了不少的成果。CN101716375公開了一種由純天然原料制備的具有梯度孔結(jié)構(gòu)和性能的人工皮膚，這種人工皮膚由表皮層和真皮層構(gòu)成，其中表皮層是由纖維蛋白或絲素蛋白等蛋白與殼聚糖等多糖構(gòu)成的薄膜結(jié)構(gòu)，真皮層的主要成分是膠原蛋白。CN 101716376A公開了一種生長(zhǎng)因子緩釋型雙層人工皮膚，這種人工皮膚的表皮層是具有防水、透氣、保護(hù)功能的聚氨酯或硅橡膠或聚乙二醇微孔薄膜，真皮層是由絲素蛋白和殼聚糖構(gòu)成的生物大分子薄膜。CN 102526810A公開了一種人工皮膚替代材料及制備方法，這種替代材料具有雙層結(jié)構(gòu)，其中基層為聚氨酯材料，在基層表面覆蓋一層聚氨酯與聚N-異丙基丙烯酰胺經(jīng)接枝共聚改性形成的結(jié)構(gòu)層。這種替代物具有與真實(shí)皮膚相近的良好力學(xué)性能。CN 102526808A公開了一種人工皮膚及制備方法，該人工皮膚包括微孔膜狀表皮層以及天然高分子仿生真皮層。表皮層的主要成分為聚偏氟乙烯和/或其共聚物聚偏氟乙烯-三氟乙烯，真皮層是膠原膜。CN 1785444A公開了一種膠原-殼聚糖和硅橡膠雙層皮膚再生支架及其制備方法，該皮膚再生支架由膠原/殼聚糖多孔支架通過(guò)生物相容性良好的膠黏劑粘合而成。目前已經(jīng)公開的具有雙層結(jié)構(gòu)的人工皮膚制備技術(shù)主要通過(guò)涂膜、膠粘、噴淋成膜、熱壓成膜等復(fù)合方式人為地將人造表皮層與人造真皮層結(jié)合。其中涂膜與噴淋成膜是將表皮膠液噴涂到成型的人造真皮層表面，形成表面化學(xué)鍵合后得到人造皮膚；膠粘與熱壓成膜是指利用粘合劑通過(guò)分子間氫鍵與范德華力將已經(jīng)成型的表皮層與真皮層結(jié)合?，F(xiàn)有技術(shù)的人造皮膚在表皮層與真皮層結(jié)合界面存在結(jié)構(gòu)上的突變，在各層內(nèi)部不存在結(jié)構(gòu)的梯度變化，只是簡(jiǎn)單的上密下疏結(jié)構(gòu)。這樣的構(gòu)造不僅使皮膚組織細(xì)胞在材料疏密層結(jié)合界面處生長(zhǎng)緩慢，還會(huì)破壞新生皮膚真皮層與表皮層結(jié)構(gòu)的連續(xù)性，從而延長(zhǎng)了治療周期并且會(huì)使傷口處形成明顯的疤痕。此外，膠粘與涂膜的制備工藝會(huì)在較大程度上影響表 皮層與真皮層之間連通性最終影響人造皮膚材料的透氣性能?，F(xiàn)有技術(shù)中涉及的人造皮膚真皮層材料通常選用生物相容性良好的膠原蛋白，絲束蛋白，表皮層材料通常選用可降解材料(聚乳酸，聚乙二醇)或者惰性材料(硅橡膠，聚偏氟乙烯，聚氨酯)，使其制備成本十分高昂，同時(shí)表皮層與真皮層由兩種不同材料構(gòu)成也增加了人為復(fù)合保證兩種材料結(jié)合緊密的難度。細(xì)菌纖維素(Bacterial Cellulose,也稱微生物纖維素)，是世界上公認(rèn)的性能優(yōu)異的新型生物材料。細(xì)菌纖維素的物理、化學(xué)和機(jī)械性能具有許多獨(dú)特的性質(zhì)超細(xì)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；高抗張強(qiáng)度和彈性模量；具有較高親水性的同時(shí)，兼具良好的透氣、吸水、透水性能，并有非凡的持水性和高濕強(qiáng)度。大量研究表明細(xì)菌纖維素具有良好的體內(nèi)、體外生物相容性和良好的生物可降解性，極好的形狀維持性能和形狀可調(diào)控性。因此采用細(xì)菌纖維素作為皮膚修復(fù)材料具有以往其它生物材料、織物等無(wú)可比擬的優(yōu)點(diǎn)，它是一種較理想的皮膚修復(fù)材料。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明專利通過(guò)控制BC的培養(yǎng)條件并在培養(yǎng)過(guò)程中加入緩釋微球，能夠快速簡(jiǎn)便地制備出一種具有類似人體皮膚“上密下疏”的生物結(jié)構(gòu)的多孔細(xì)菌纖維素皮膚修復(fù)材料。與現(xiàn)有技術(shù)中多層狀復(fù)合相比，本發(fā)明是使用細(xì)菌纖維素作為皮膚修復(fù)材料的基材。細(xì)菌纖維素具有良好的生物相容性以及細(xì)胞活性，是一種應(yīng)用廣泛的組織工程支架材料。本發(fā)明通過(guò)控制細(xì)菌纖維素培養(yǎng)過(guò)程中的培養(yǎng)條件，使β -I, 4-葡萄糖鏈構(gòu)成的纖維素微纖絲在通過(guò)分子內(nèi)與分子間氫鍵結(jié)合并結(jié)晶成型的過(guò)程中，自發(fā)、有序地形成疏松到致密漸變的結(jié)構(gòu)。結(jié)合程度更深，不僅局限于材料表面。與現(xiàn)有技術(shù)人為構(gòu)造表皮層與真皮層相t匕，本發(fā)明制備得到的具有疏密結(jié)構(gòu)的多孔細(xì)菌纖維素皮膚修復(fù)材料無(wú)明顯物理分層，結(jié)構(gòu)連續(xù)性十分良好，不存在現(xiàn)有技術(shù)人造皮膚產(chǎn)品在兩層界面處結(jié)構(gòu)不連續(xù)的缺點(diǎn)；其次，疏松層與致密層內(nèi)也存在結(jié)構(gòu)的梯度變化，使得材料在最大程度上模仿了人體皮膚上密下疏的漸變梯度結(jié)構(gòu)，能夠明顯縮短傷口愈合周期，并有效減少愈合后瘢痕的增生；此外，均勻的多孔結(jié)構(gòu)能夠加快血管化也可以作為組織工程皮膚的支架材料應(yīng)用于皮膚修復(fù)。由于成型過(guò)程連續(xù)，本發(fā)明制備得到的具有疏密結(jié)構(gòu)的多孔細(xì)菌纖維素皮膚修復(fù)材料保持了細(xì)菌纖維素材料良好的透氣性與持水性，能夠長(zhǎng)時(shí)間地使病患的創(chuàng)面維持一個(gè)濕態(tài)的環(huán)境，更有利于創(chuàng)面的愈合。具有疏密結(jié)構(gòu)的多孔細(xì)菌纖維素皮膚修復(fù)材料的成型過(guò)程簡(jiǎn)單，培養(yǎng)周期短，制備過(guò)程綠色環(huán)保、簡(jiǎn)便快速、制備成本低廉，是一種理想的皮膚修復(fù)材料。本發(fā)明的一種具備疏密結(jié)構(gòu)的多孔細(xì)菌纖維素皮膚修復(fù)材料，是由兩層結(jié)合緊密的細(xì)菌纖維素膜構(gòu)成，所述的兩層結(jié)合緊密的細(xì)菌纖維素膜為致密層與疏松層；所述的結(jié)合緊密是指所述致密層的纖維素微纖絲與所述疏松層的纖維素微纖絲通過(guò)β -I, 4-葡萄糖鏈中的分子內(nèi)與分子間氫鍵結(jié)合，形成分子層，層與層之間也通過(guò)分子內(nèi)與分子間氫鍵結(jié)合，無(wú)明顯物理分層；組成細(xì)菌纖維素的基本單元并非單根β_1，4-葡萄糖鏈，而是預(yù)微纖絲(premicrofibril),其由β _1，4-葡萄糖鏈組成,每9根β _1，4-葡萄糖鏈相互平行，通過(guò)分子內(nèi)與分子間氫鍵結(jié)合，呈左手三螺旋狀，是組成微纖絲(miCTofibril)的基本單位，直徑為I. 5nm。微纖絲(microfibril)直徑為3. 5nm,微纖與微纖之間通過(guò)分子內(nèi)與分子間氫鍵結(jié)合，β -I, 4-葡萄糖鏈呈平行排布，形成纖維素I型結(jié)晶結(jié)構(gòu)。其中所述致密層中的纖維素含量O. 7Χ 10_2 I. OX 10_2g/cm3 ;所述疏松層中的纖維素含量O. 2 X IO-2 O. 5X l(T2g/cm3，所述疏松層中均勻分布有孔徑為50 250mm的微孔，孔隙率在80%以上。作為優(yōu)選的技術(shù)方案如上所述的一種具備疏密結(jié)構(gòu)的多孔細(xì)菌纖維素皮膚修復(fù)材料，所述的細(xì)菌纖維素膜是由菌種在靜置培養(yǎng)條件下，消耗糖源，與細(xì)胞內(nèi)合成β -I, 4-葡萄糖鏈并擠出細(xì)胞體外。3 4條β-1，4-葡萄糖鏈通過(guò)分子內(nèi)與分子間氫鍵作用形成脂多糖層，4 5個(gè)脂多糖層通過(guò)分子內(nèi)與分子間氫鍵形成直徑在I. 5nm左右的類晶團(tuán)聚體，3 5個(gè)類晶團(tuán)聚體通過(guò)分子內(nèi)與分子間氫鍵形成直徑在3. 5nm左右的纖維素微纖絲，多條微纖絲通過(guò)分子內(nèi)與分子間氫鍵作用形成纖維素絲束，多條絲束通過(guò)分子內(nèi)與分子間氫鍵作用形成纖維素絲帶。菌種細(xì)胞在發(fā)酵培養(yǎng)液表面無(wú)序運(yùn)動(dòng)，即使細(xì)胞發(fā)生分裂也不會(huì)影響纖維素絲帶發(fā)生斷裂。由β_1，4-葡萄糖鏈通過(guò)分子內(nèi)與分子間氫鍵形成的纖維素微纖絲相互交織，彼此通過(guò)分子內(nèi)與分子間氫鍵相互作用，最終在液面形成類似與無(wú)紡布結(jié)構(gòu)的細(xì)菌纖維素膜。如上所述的一種具備疏密結(jié)構(gòu)的多孔細(xì)菌纖維素皮膚修復(fù)材料，所述的具備疏密結(jié)構(gòu)的多孔細(xì)菌纖維素皮膚修復(fù)材料的厚度為8 15mm,其中所述疏松層的厚度為6 13mm。本發(fā)明還提供了一種具備疏密結(jié)構(gòu)的多孔細(xì)菌纖維素皮膚修復(fù)材料的制備方法，包括以下步驟I)發(fā)酵培養(yǎng)液的調(diào)配；發(fā)酵培養(yǎng)液組分，以質(zhì)量百分?jǐn)?shù)計(jì)，單位為wt% :葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇2 5，蛋白胨O. 05 O. 5，酵母膏O. 05 O. 5，檸檬酸O. 01 O. 1，磷酸氫二鈉O. 02 O. 2，磷酸二氫鉀O. 01 O. I ;發(fā)酵培養(yǎng)液的pH為4. O 6. O ;將上述組分混合后經(jīng)高壓蒸汽滅菌后紫外輻照并冷卻至室溫，通純氧，即得發(fā)酵培養(yǎng)液；
2)菌種擴(kuò)培；將所述的發(fā)酵培養(yǎng)液接入菌液和擴(kuò)培；擴(kuò)培程度菌種細(xì)胞數(shù)目在2X IO5 2X IO7 個(gè)/ml。3)靜置培養(yǎng)；將擴(kuò)培后的菌液轉(zhuǎn)移至裝有發(fā)酵培養(yǎng)液的培養(yǎng)容器中，放置于恒溫培養(yǎng)箱中，28 32 °C靜置培養(yǎng)；通過(guò)分步調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)液上方空氣整體氣壓以及氧氣分壓來(lái)實(shí)現(xiàn)細(xì)菌纖維素薄膜的上密下疏的雙層結(jié)構(gòu)。通過(guò)在疏松層靜置培養(yǎng)過(guò)程中添加緩釋微球，使纖維素微纖絲之間通過(guò)分子內(nèi)與分子間氫鍵結(jié)合，結(jié)晶形成細(xì)菌纖維素的過(guò)程中，原位包覆緩釋微球，微 球降解后，形成疏松層內(nèi)部多孔結(jié)構(gòu)；a.細(xì)菌纖維素生長(zhǎng)誘導(dǎo)期I 2天控制與發(fā)酵培養(yǎng)液液面相接觸的空氣壓力為I個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，直至細(xì)菌將發(fā)酵培養(yǎng)液中溶解的氧氣消耗殆盡后浮上液面，液面出現(xiàn)一層半透明的細(xì)菌纖維素薄膜；b.細(xì)菌纖維素快速生長(zhǎng)期2 3天控制與細(xì)菌纖維素膜上表面空氣壓力為I個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，同時(shí)保持氧氣濃度在10 15% ;至細(xì)菌纖維素薄膜厚度達(dá)到O. 3mm O. 5mm ;c.細(xì)菌纖維素平穩(wěn)生長(zhǎng)期3 4天平穩(wěn)生長(zhǎng)期分兩個(gè)階段致密層形成階段，加壓使與細(xì)菌纖維素膜上表面相接觸的空氣壓力在I. I I. 5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓范圍內(nèi)，同時(shí)提高氧氣濃度至50 100%范圍內(nèi)；直至細(xì)菌纖維素膜厚度達(dá)到I 4mm ；疏松層形成階段，維持與細(xì)菌纖維素膜上表面相接觸的空氣壓力為I個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，同時(shí)維持氧氣濃度為10 15%，直至細(xì)菌纖維素薄膜厚度增長(zhǎng)至2 8mm時(shí)，在細(xì)菌纖維素薄膜上表面均勻加入緩釋微球；維持與細(xì)菌纖維素膜上表面接觸的空氣壓力為I個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，同時(shí)維持氧氣濃度為10 15%，直至細(xì)菌纖維素膜厚度達(dá)到8 15mm時(shí)將其取出，即得到具備疏密結(jié)構(gòu)的多孔細(xì)菌纖維素薄膜；需要指出的是平穩(wěn)期生長(zhǎng)階段中，先培養(yǎng)疏松層，再培養(yǎng)致密層也能得到相同結(jié)構(gòu)的具備疏密結(jié)構(gòu)的多孔細(xì)菌纖維素皮膚修復(fù)材料。4)后處理；靜置培養(yǎng)結(jié)束后，將上述的具備疏密結(jié)構(gòu)的多孔細(xì)菌纖維素薄膜浸泡至濃度為I 10wt%的氫氧化鈉溶液中，煮沸保持2 10小時(shí)，用純凈水清洗至pH為7. 0，材料內(nèi)毒素〈O. 5EU/ml，再將處理后的細(xì)菌纖維素薄膜高壓滅菌并包裝低溫封存，即為具備疏密結(jié)構(gòu)的多孔細(xì)菌纖維素皮膚修復(fù)材料。如上所述的菌種是指能夠生物合成纖維素的微生物，包括木醋桿菌、產(chǎn)醋桿菌、醋化桿菌、巴氏醋桿菌、葡萄糖桿菌、農(nóng)桿菌、根瘤菌、八疊球菌、洋蔥假單胞菌、椰毒假單胞菌或空腸彎曲菌中的一種或幾種。如上所述的一種具備疏密結(jié)構(gòu)的多孔細(xì)菌纖維素皮膚修復(fù)材料的制備方法，所述的緩釋微球?yàn)榫哂衅ば窘Y(jié)構(gòu)，外徑為50 250 μ m ;其中，緩釋微球內(nèi)部含有過(guò)氧化合物、葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇；緩釋微球囊壁材料為明膠、聚乳酸、聚羥基乙酸、聚乳酸-羥基乙酸共聚物、殼聚糖或膠原。所述的均勻加入是指將緩釋微球均勻分散在經(jīng)過(guò)滅菌處理，調(diào)配好的發(fā)酵培養(yǎng)液中，速率在I 10mL/min范圍內(nèi)，由細(xì)菌纖維素薄膜上方噴淋至細(xì)菌纖維素薄膜上表面，液滴直徑范圍在50 250 μ m,其中80%的液滴直徑小于150 μ m,噴淋時(shí)間在5 10分鐘范圍內(nèi)。所述的緩釋微球均勻加入至細(xì)菌纖維素薄膜上表面后，在24 72小時(shí)內(nèi)持續(xù)釋放緩釋微球內(nèi)部物質(zhì)，并在內(nèi)部物質(zhì)釋放完畢后的48小時(shí)內(nèi)，緩釋微球囊壁以溶解或降解的方式消失。如上所述的一種具備疏密結(jié)構(gòu)的多孔細(xì)菌纖維素皮膚修復(fù)材料的制備方法，所述的高壓蒸汽滅菌后紫外輻照是指將所述發(fā)酵培養(yǎng)液置于高壓滅菌鍋內(nèi)121°C滅菌處理30分鐘后取出置于紫外燈下輻照冷卻至室溫。如上所述的一種具備疏密結(jié)構(gòu)的多孔細(xì)菌纖維素皮膚修復(fù)材料的制備方法，所述的通純氧是指將醫(yī)用氧以lL/min的速度通入上述的發(fā)酵培養(yǎng)液中，并維持30分鐘；所述的接種是指用滅菌后的接種環(huán)鉤取適量保存于4°C下試管中的菌種，并轉(zhuǎn)移至上述的發(fā)酵培養(yǎng)液中；所述的擴(kuò)培是指將接入菌種后的發(fā)酵培養(yǎng)液于28 32°C下?lián)u床培養(yǎng)8 24小時(shí)。 如上所述的一種具備疏密結(jié)構(gòu)的多孔細(xì)菌纖維素皮膚修復(fù)材料的制備方法，所述的加壓為連續(xù)增壓或階段性增壓。如上所述的一種具備疏密結(jié)構(gòu)的多孔細(xì)菌纖維素皮膚修復(fù)材料的制備方法，所述的連續(xù)增壓是指每分鐘向容器內(nèi)充入壓力百分?jǐn)?shù)為I. 32 X 10_2 5. 63 X 10_2%的空氣，基數(shù)是I個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，直至容器內(nèi)空氣壓力為I. I I. 5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓時(shí)不再增加壓力；所述的階段性增壓是指每小時(shí)向容器內(nèi)充入壓力百分?jǐn)?shù)為O. 797 3. 437%的空氣，基數(shù)同樣是I個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，直至容器內(nèi)空氣壓力為I. I I. 5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓時(shí)不再增加壓力。如上所述的一種具備疏密結(jié)構(gòu)的多孔細(xì)菌纖維素皮膚修復(fù)材料的制備方法，所述的提高氧氣濃度為連續(xù)增加或階段性增加；所述的連續(xù)增加是指氧氣濃度每分鐘增加O. 05 O. 06%，直至氧氣濃度達(dá)到50%時(shí)不再增加；所述的階段性增加是指在上述連續(xù)增壓或階段性增壓過(guò)程中，使氧氣濃度每小時(shí)增加2. 92 3. 33%，直至氧氣濃度達(dá)到50%時(shí)不再增加。如上所述的一種具備疏密結(jié)構(gòu)的多孔細(xì)菌纖維素皮膚修復(fù)材料的制備方法，所述的高壓滅菌是指將所述后處理后的具備疏密結(jié)構(gòu)的多孔細(xì)菌纖維素薄膜浸泡在純凈水中置于高壓滅菌鍋內(nèi)121°C滅菌處理30分鐘后取出冷卻至室溫；所述的低溫封存是指將高壓滅菌后的具備疏密結(jié)構(gòu)的多孔細(xì)菌纖維素皮膚修復(fù)材料置于4°C下保存。本發(fā)明的一種具備疏密結(jié)構(gòu)的多孔細(xì)菌纖維素皮膚修復(fù)材料，所述具有疏密結(jié)構(gòu)的多孔細(xì)菌纖維素皮膚修復(fù)材料與細(xì)胞生長(zhǎng)因子、活性多肽以及抗菌物質(zhì)通過(guò)物理吸附的方式進(jìn)行復(fù)合；分別配置濃度為5 10wt%的細(xì)胞生長(zhǎng)因子、活性多肽、抗菌物質(zhì)的溶液，將材料在27 35°C的條件下分別在上述溶液中浸泡5 10天，隨后經(jīng)過(guò)清洗、滅菌，即可得到復(fù)合了細(xì)胞生長(zhǎng)因子、活性多肽以及抗菌物質(zhì)的皮膚修復(fù)材料。細(xì)菌纖維素作為一種新型的天然水凝膠具有其獨(dú)特的物理、化學(xué)和機(jī)械性質(zhì)超細(xì)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；高抗張強(qiáng)度和彈性模量；高親水性，良好的透氣、吸水、透水性能，并有非凡的持水性和高濕強(qiáng)度。細(xì)菌纖維素的微纖絲束直徑為3 4nm，而由微纖維束連接成的纖維絲帶寬度為70 80nm,長(zhǎng)度為I 9 μ m,是目前最細(xì)的天然纖維。大量研究表明細(xì)菌纖維素具有良好的體內(nèi)、體外生物相容性。極好的形狀維持性能和原位成型性?？梢匀我獠眉襞c皮膚有極好的伏貼性；獨(dú)特的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)使得其能夠在很長(zhǎng)一段時(shí)間里保持濕潤(rùn)的狀態(tài)，濕潤(rùn)的環(huán)境易于組織再生、還可以有效地減輕患者的疼痛，特殊的納米結(jié)構(gòu)促進(jìn)細(xì)胞的相互作用、促進(jìn)組織再生及減少疤痕組織生成；同時(shí)，還有利于材料在傷口處安全、方便地釋放負(fù)載的藥物，進(jìn)一步促進(jìn)傷口愈合。本發(fā)明的一種具備疏密結(jié)構(gòu)的多孔細(xì)菌纖維素皮膚修復(fù)材料，其納米三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)為細(xì)胞、組織的重建提供了必要的三維空間和力學(xué)支持，起到模擬細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellularmatrix,ECM)的作用。多孔結(jié)構(gòu)的微孔能夠提供細(xì)胞向材料內(nèi)部粘附、增殖、分化的空間，同時(shí)多孔結(jié)構(gòu)也是獲得營(yíng)養(yǎng)和氧氣、排出代謝產(chǎn)物的通道以及血管化的場(chǎng)所。具有良好的組織相容性；生物可降解性和適合的降解率。本專利發(fā)明的一種具有疏密結(jié)構(gòu)的多孔細(xì)菌纖維素皮膚修復(fù)材料能夠作為敷料產(chǎn)品根據(jù)患者病情的實(shí)際情況培養(yǎng)得到與患者傷口皮膚相似上密下疏的生物結(jié)構(gòu)，可以在很大程度上縮短患者傷口愈合的周期，并且明顯減少愈合后疤痕的產(chǎn)生。同時(shí)，也可以作為組織工程支架材料應(yīng)用于皮膚修復(fù)領(lǐng)域。
有益效果與現(xiàn)有技術(shù)先比，本發(fā)明的有益效果是(I) 一種具有疏密結(jié)構(gòu)的多孔細(xì)菌纖維素皮膚修復(fù)材料成型過(guò)程連續(xù)，疏松層與致密層之間由納米微纖絲通過(guò)分子內(nèi)與分子間氫鍵結(jié)合。使β_1，4-葡萄糖鏈構(gòu)成的纖維素微纖絲在通過(guò)分子內(nèi)與分子間氫鍵結(jié)合并結(jié)晶成型的過(guò)程中，自發(fā)、有序地形成疏松到致密漸變的結(jié)構(gòu)。結(jié)合程度更深，不僅局限于材料表面。(2) 一種具有疏密結(jié)構(gòu)的多孔細(xì)菌纖維素皮膚修復(fù)材料無(wú)明顯物理分層，結(jié)構(gòu)連續(xù)性十分良好，不存在現(xiàn)有技術(shù)人造皮膚產(chǎn)品在兩層界面處結(jié)構(gòu)不連續(xù)的缺點(diǎn)；其次，制備過(guò)程中加入緩釋微球制備出一種具有類似人體皮膚“上密下疏”結(jié)構(gòu)的多孔細(xì)菌纖維素皮膚修復(fù)材料。疏松層與致密層內(nèi)存在結(jié)構(gòu)的梯度變化，疏松層中具有均勻分布的多孔，最大程度模仿了人體皮膚上密下疏的漸變梯度結(jié)構(gòu)。(3) 一種具有疏密結(jié)構(gòu)的多孔細(xì)菌纖維素皮膚修復(fù)材料在現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ)上，通過(guò)增加培養(yǎng)過(guò)程中與細(xì)菌纖維素薄膜相接觸的空氣壓力，使得細(xì)菌纖維素薄膜內(nèi)部有氧區(qū)面積增加；同時(shí)精確控制壓力，不使細(xì)菌纖維素薄膜下沉。改善了現(xiàn)有技術(shù)中只依靠提高氧氣分壓來(lái)構(gòu)造疏密結(jié)構(gòu)的單一工藝，同時(shí)也解決了氧氣分壓過(guò)高所導(dǎo)致纖維素增長(zhǎng)速度變緩的缺陷。(4) 一種具有疏密結(jié)構(gòu)的多孔細(xì)菌纖維素皮膚修復(fù)材料保持了細(xì)菌纖維素材料良好的透氣性與持水性，能夠長(zhǎng)時(shí)間地使病患的創(chuàng)面維持一個(gè)濕態(tài)的環(huán)境，更有利于創(chuàng)面的愈合。能夠明顯縮短傷口愈合周期，并有效減少愈合后瘢痕的增生。(5) 一種具有疏密結(jié)構(gòu)的多孔細(xì)菌纖維素皮膚修復(fù)材料(6) —種具有疏密結(jié)構(gòu)的多孔細(xì)菌纖維素皮膚修復(fù)材料成型過(guò)程簡(jiǎn)單，培養(yǎng)周期短，制備過(guò)程綠色環(huán)保、簡(jiǎn)便快速、制備成本低廉，是一種理想的皮膚修復(fù)材料。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式
，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。本發(fā)明的一種具備疏密結(jié)構(gòu)的多孔細(xì)菌纖維素皮膚修復(fù)材料，是由兩層結(jié)合緊密的細(xì)菌纖維素膜構(gòu)成，所述的兩層結(jié)合緊密的細(xì)菌纖維素膜為致密層與疏松層；所述的結(jié)合緊密是指所述致密層的纖維素微纖絲與所述疏松層的纖維素微纖絲通過(guò)β -I, 4-葡萄糖鏈中的分子內(nèi)與分子間氫鍵結(jié)合，形成分子層，層與層之間也通過(guò)分子內(nèi)與分子間氫鍵結(jié)合，無(wú)明顯物理分層；組成細(xì)菌纖維素的基本單元并非單根β_1，4-葡萄糖鏈，而是預(yù)微纖絲(premicrofibril),其由β _1，4-葡萄糖鏈組成,每9根β _1，4-葡萄糖鏈相互平行，通過(guò)分子內(nèi)與分子間氫鍵結(jié)合，呈左手三螺旋狀，是組成微纖絲(miCTofibril)的基本單位，直徑為I. 5nm。微纖絲(microfibril)直徑為3. 5nm,微纖與微纖之間通過(guò)分子內(nèi)與分子間氫鍵結(jié)合，β -I, 4-葡萄糖鏈呈平行排布，形成纖維素I型結(jié)晶結(jié)構(gòu)。其中所述致密層中的纖維素含量O. 7Χ 10_2 I. OX 10_2g/cm3，所述疏松層中的纖 維素含量O. 2 X Kr2 O. 5X l(T2g/cm3。所述疏松層中均勻分布有孔徑為50 250mm的微孔，孔隙率在80%以上。所述的細(xì)菌纖維素膜是由菌種消耗糖源，分泌纖維素微纖絲通過(guò)分子內(nèi)與分子間氫鍵結(jié)合形成。所述的具備疏密結(jié)構(gòu)的多孔細(xì)菌纖維素皮膚修復(fù)材料的厚度為8 15mm，其中所述疏松層的厚度為6 13mm。低溫封存，即為具備疏密結(jié)構(gòu)的多孔細(xì)菌纖維素皮膚修復(fù)材料。實(shí)施例II)發(fā)酵培養(yǎng)液的調(diào)配；培養(yǎng)液組分，以質(zhì)量百分?jǐn)?shù)計(jì)，單位為wt% :葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇2，蛋白胨
O.05，酵母膏O. 05，檸檬酸O. 01，磷酸氫二鈉O. 02，磷酸二氫鉀O. 01 ；培養(yǎng)液的pH為4. O ;將上述組分混合后經(jīng)高壓蒸汽滅菌后紫外輻照并冷卻至室溫，通純氧，即得發(fā)酵培養(yǎng)液；2)菌種擴(kuò)培；將所述的發(fā)酵培養(yǎng)液接種和擴(kuò)培；擴(kuò)培程度菌種細(xì)胞數(shù)目在2X105個(gè)/mL。3)靜置培養(yǎng)；將擴(kuò)培后的菌液轉(zhuǎn)移至裝有發(fā)酵培養(yǎng)液的培養(yǎng)容器中，放置于恒溫培養(yǎng)箱中，28 °C靜置培養(yǎng)；通過(guò)分步調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)液上方空氣整體氣壓以及氧氣分壓來(lái)實(shí)現(xiàn)細(xì)菌纖維素薄膜的上密下疏的雙層結(jié)構(gòu)。通過(guò)在疏松層靜置培養(yǎng)過(guò)程中添加緩釋微球，使纖維素微纖絲之間通過(guò)分子內(nèi)與分子間氫鍵結(jié)合，結(jié)晶形成細(xì)菌纖維素的過(guò)程中，原位包覆緩釋微球，微球降解后，形成疏松層內(nèi)部多孔結(jié)構(gòu)；a.細(xì)菌纖維素生長(zhǎng)誘導(dǎo)期I天控制與發(fā)酵培養(yǎng)液液面相接觸的空氣壓力為I個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，直至細(xì)菌將發(fā)酵培養(yǎng)液中溶解的氧氣消耗殆盡后浮上液面，液面出現(xiàn)一層半透明的細(xì)菌纖維素薄膜；b.細(xì)菌纖維素快速生長(zhǎng)期2天控制與細(xì)菌纖維素膜上表面空氣壓力為I個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，同時(shí)保持氧氣濃度在10% ;至細(xì)菌纖維素薄膜厚度達(dá)到O. 3 O. 5mm ;
c.細(xì)菌纖維素平穩(wěn)生長(zhǎng)期3天平穩(wěn)生長(zhǎng)期分兩個(gè)階段致密層形成階段，加壓使與細(xì)菌纖維素膜上表面相接觸的空氣壓力在I. I個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓范圍內(nèi)，同時(shí)提高氧氣濃度至50% ;直至細(xì)菌纖維素膜厚度達(dá)到I 4mm ;疏松層形成階段，維持與細(xì)菌纖維素膜上表面相接觸的空氣壓力為I個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，同時(shí)維持氧氣濃度為10%，直至細(xì)菌纖維素薄膜厚度增長(zhǎng)至2 8mm時(shí)，在細(xì)菌纖維素薄膜上表面均勻加入緩釋微球；維持與細(xì)菌纖維素膜上表面接觸的空氣壓力為I個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，同時(shí)維持氧氣濃度為10%，直至細(xì)菌纖維素膜厚度達(dá)到8 15mm時(shí)將其取出，即得到具備疏密結(jié)構(gòu)的多孔細(xì)菌纖維素薄膜；4)后處理；
、
靜置培養(yǎng)結(jié)束后，將上述的具備疏密結(jié)構(gòu)的多孔細(xì)菌纖維素薄膜浸泡至濃度為lwt%的氫氧化鈉溶液中，煮沸保持2小時(shí)，用純凈水清洗至pH為7. 0，材料內(nèi)毒素〈O. 5EU/ml，再將處理后的細(xì)菌纖維素薄膜高壓滅菌并包裝低溫封存，即為具備疏密結(jié)構(gòu)的多孔細(xì)菌纖維素皮膚修復(fù)材料。實(shí)施例2I)發(fā)酵培養(yǎng)液的調(diào)配；培養(yǎng)液組分，以質(zhì)量百分?jǐn)?shù)計(jì)，單位為wt% :葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇5，蛋白胨
O.5，酵母膏O. 5，檸檬酸O. I，磷酸氫二鈉O. 2，磷酸二氫鉀O. I ；培養(yǎng)液的pH為6. O ;將上述組分混合后經(jīng)高壓蒸汽滅菌后紫外輻照并冷卻至室溫，通純氧，即得發(fā)酵培養(yǎng)液；2)菌種擴(kuò)培；將所述的發(fā)酵培養(yǎng)液接種和擴(kuò)培；擴(kuò)培程度菌種細(xì)胞數(shù)目在2X107個(gè)/mL。3)靜置培養(yǎng)；將擴(kuò)培后的菌液轉(zhuǎn)移至裝有發(fā)酵培養(yǎng)液的培養(yǎng)容器中，放置于恒溫培養(yǎng)箱中，32 °C靜置培養(yǎng)；通過(guò)分步調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)液上方空氣整體氣壓以及氧氣分壓來(lái)實(shí)現(xiàn)細(xì)菌纖維素薄膜的上密下疏的雙層結(jié)構(gòu)。通過(guò)在疏松層靜置培養(yǎng)過(guò)程中添加緩釋微球，使纖維素微纖絲之間通過(guò)分子內(nèi)與分子間氫鍵結(jié)合，結(jié)晶形成細(xì)菌纖維素的過(guò)程中，原位包覆緩釋微球，微球降解后，形成疏松層內(nèi)部多孔結(jié)構(gòu)；a.細(xì)菌纖維素生長(zhǎng)誘導(dǎo)期2天控制與發(fā)酵培養(yǎng)液液面相接觸的空氣壓力為I個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，直至細(xì)菌將發(fā)酵培養(yǎng)液中溶解的氧氣消耗殆盡后浮上液面，液面出現(xiàn)一層半透明的細(xì)菌纖維素薄膜；b.細(xì)菌纖維素快速生長(zhǎng)期3天控制與細(xì)菌纖維素膜上表面空氣壓力為I個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，同時(shí)保持氧氣濃度在15% ;至細(xì)菌纖維素薄膜厚度達(dá)到O. 3 O. 5mm ;c.細(xì)菌纖維素平穩(wěn)生長(zhǎng)期4天平穩(wěn)生長(zhǎng)期分兩個(gè)階段致密層形成階段，加壓使與細(xì)菌纖維素膜上表面相接觸的空氣壓力在I. 5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓范圍內(nèi)，同時(shí)提高氧氣濃度至100% ;直至細(xì)菌纖維素膜厚度達(dá)到I 4mm ;
疏松層形成階段，維持與細(xì)菌纖維素膜上表面相接觸的空氣壓力為I個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，同時(shí)維持氧氣濃度為15%，直至細(xì)菌纖維素薄膜厚度增長(zhǎng)至2 8mm時(shí)，在細(xì)菌纖維素薄膜上表面均勻加入緩釋微球；維持與細(xì)菌纖維素膜上表面接觸的空氣壓力為I個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，同時(shí)維持氧氣濃度為15%，直至細(xì)菌纖維素膜厚度達(dá)到8 15mm時(shí)將其取出，即得到具備疏密結(jié)構(gòu)的多孔細(xì)菌纖維素薄膜；4)后處理；靜置培養(yǎng)結(jié)束后，將上述的具備疏密結(jié)構(gòu)的多孔細(xì)菌纖維素薄膜浸泡至濃度為10wt%的氫氧化鈉溶液中，煮沸保持10小時(shí)，用純凈水清洗至pH為7. O,材料內(nèi)毒素〈O. 5EU/ml，再將處理后的細(xì)菌纖維素薄膜高壓滅菌并包裝低溫封存，即為具備疏密結(jié)構(gòu)的多孔細(xì)菌纖維素皮膚修復(fù)材料。實(shí)施例3
I)發(fā)酵培養(yǎng)液的調(diào)配；發(fā)酵培養(yǎng)液組分，以質(zhì)量百分?jǐn)?shù)計(jì)，單位為wt% :葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇3，蛋白胨O. 3，酵母膏O. 3，檸檬酸O. 05，磷酸氫二鈉O. I，磷酸二氫鉀O. 05 ；發(fā)酵培養(yǎng)液的pH為5. O ;將上述組分混合后經(jīng)高壓蒸汽滅菌后紫外輻照并冷卻至室溫，通純氧，即得發(fā)酵培養(yǎng)液；2)菌種擴(kuò)培；將所述的發(fā)酵培養(yǎng)液接種和擴(kuò)培；擴(kuò)培程度菌種細(xì)胞數(shù)目在2X107個(gè)/mL。3)靜置培養(yǎng)；將擴(kuò)培后的菌液轉(zhuǎn)移至裝有發(fā)酵培養(yǎng)液的培養(yǎng)容器中，放置于恒溫培養(yǎng)箱中，30°C靜置培養(yǎng)；通過(guò)分步調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)液上方空氣整體氣壓以及氧氣分壓來(lái)實(shí)現(xiàn)細(xì)菌纖維素薄膜的上密下疏的雙層結(jié)構(gòu)。通過(guò)在疏松層靜置培養(yǎng)過(guò)程中添加緩釋微球，使纖維素微纖絲之間通過(guò)分子內(nèi)與分子間氫鍵結(jié)合，結(jié)晶形成細(xì)菌纖維素的過(guò)程中，原位包覆緩釋微球，微球降解后，形成疏松層內(nèi)部多孔結(jié)構(gòu)；a.細(xì)菌纖維素生長(zhǎng)誘導(dǎo)期I天控制與發(fā)酵培養(yǎng)液液面相接觸的空氣壓力為I個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，直至細(xì)菌將發(fā)酵培養(yǎng)液中溶解的氧氣消耗殆盡后浮上液面，液面出現(xiàn)一層半透明的細(xì)菌纖維素薄膜；b.細(xì)菌纖維素快速生長(zhǎng)期2天控制與細(xì)菌纖維素膜上表面空氣壓力為I個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，同時(shí)保持氧氣濃度在12. 5% ;至細(xì)菌纖維素薄膜厚度達(dá)到O. 3 O. 5mm ;c.細(xì)菌纖維素平穩(wěn)生長(zhǎng)期4天平穩(wěn)生長(zhǎng)期分兩個(gè)階段致密層形成階段，加壓使與細(xì)菌纖維素膜上表面相接觸的空氣壓力在I. 3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓范圍內(nèi)，同時(shí)提高氧氣濃度至75% ;直至細(xì)菌纖維素膜厚度達(dá)到I 4mm ;疏松層形成階段，維持與細(xì)菌纖維素膜上表面相接觸的空氣壓力為I. 3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，同時(shí)維持氧氣濃度為12. 5%，直至細(xì)菌纖維素薄膜厚度增長(zhǎng)至2 8mm時(shí)，在細(xì)菌纖維素薄膜上表面均勻加入緩釋微球；維持與細(xì)菌纖維素膜上表面接觸的空氣壓力為I個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，同時(shí)維持氧氣濃度為12. 5%，直至細(xì)菌纖維素膜厚度達(dá)到8 15mm時(shí)將其取出，即得到具備疏密結(jié)構(gòu)的多孔細(xì)菌纖維素薄膜；4)后處理；靜置培養(yǎng)結(jié)束后，將上述的具備疏密結(jié)構(gòu)的多孔細(xì)菌纖維素薄膜浸泡至濃度為2wt%的氫氧化鈉溶液中，煮沸保持4小時(shí)，用純凈水清洗至pH為7. 0，材料內(nèi)毒素〈O. 5EU/ml，再將處理后的細(xì)菌纖維素薄膜高壓滅菌并包裝低溫封存，即為具備疏密結(jié)構(gòu)的多孔細(xì)菌纖維素皮膚修復(fù)材料。實(shí)施例4I)發(fā)酵培養(yǎng)液的調(diào)配；發(fā)酵培養(yǎng)液組分，以質(zhì)量百分?jǐn)?shù)計(jì)，單位為wt% :葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇5，蛋白胨O. 5，酵母膏O. 5，檸檬酸O. I，磷酸氫二鈉O. 2，磷酸二氫鉀O. I ； 發(fā)酵培養(yǎng)液的pH為5. O ;將上述組分混合后經(jīng)高壓蒸汽滅菌后紫外輻照并冷卻至室溫，通純氧，即得發(fā)酵培養(yǎng)液；2)菌種擴(kuò)培；將所述的發(fā)酵培養(yǎng)液接種和擴(kuò)培；擴(kuò)培程度菌種細(xì)胞數(shù)目在2X107個(gè)/mL。3)靜置培養(yǎng)；將擴(kuò)培后的菌液轉(zhuǎn)移至裝有發(fā)酵培養(yǎng)液的培養(yǎng)容器中，放置于恒溫培養(yǎng)箱中，30°C靜置培養(yǎng)；通過(guò)分步調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)液上方空氣整體氣壓以及氧氣分壓來(lái)實(shí)現(xiàn)細(xì)菌纖維素薄膜的上密下疏的雙層結(jié)構(gòu)；a.細(xì)菌纖維素生長(zhǎng)誘導(dǎo)期I天控制與發(fā)酵培養(yǎng)液液面相接觸的空氣壓力為I個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，直至細(xì)菌將發(fā)酵培養(yǎng)液中溶解的氧氣消耗殆盡后浮上液面，液面出現(xiàn)一層半透明的細(xì)菌纖維素薄膜；b.細(xì)菌纖維素快速生長(zhǎng)期2天控制與細(xì)菌纖維素膜上表面空氣壓力為I個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，同時(shí)保持氧氣濃度在10% ;至細(xì)菌纖維素薄膜厚度達(dá)到O. 5mm ；c.細(xì)菌纖維素平穩(wěn)生長(zhǎng)期4天平穩(wěn)生長(zhǎng)期分兩個(gè)階段致密層形成階段，采用連續(xù)增壓，每分鐘向容器內(nèi)充入壓力百分?jǐn)?shù)I. 32X10_2%的空氣，基數(shù)是一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，直至容器內(nèi)空氣壓力為1.1個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓時(shí)不再增加壓力。使與細(xì)菌纖維素膜上表面相接觸的空氣壓力在I. I個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，同時(shí)采用連續(xù)增加氧氣濃度的方式，使氧氣濃度每分鐘增加O. 05%，直至氧氣濃度達(dá)到50%時(shí)不再增加；當(dāng)細(xì)菌纖維素膜厚度達(dá)到8mm時(shí)，將其取出，即得到具備疏密結(jié)構(gòu)的細(xì)菌纖維素薄膜；疏松層形成階段，維持與細(xì)菌纖維素膜上表面相接觸的空氣壓力為I個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，同時(shí)維持氧氣濃度為10%，直至細(xì)菌纖維素薄膜厚度增長(zhǎng)至2 8mm時(shí)，在細(xì)菌纖維素薄膜上表面均勻加入緩釋微球；維持與細(xì)菌纖維素膜上表面接觸的空氣壓力為I個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，同時(shí)維持氧氣濃度為10%，直至細(xì)菌纖維素膜厚度達(dá)到8 15mm時(shí)將其取出，即得到具備疏密結(jié)構(gòu)的多孔細(xì)菌纖維素薄膜；4)后處理；靜置培養(yǎng)結(jié)束后，將上述的具備疏密結(jié)構(gòu)的細(xì)菌纖維素薄膜浸泡至濃度為lwt%的氫氧化鈉溶液中，煮沸保持2小時(shí)，用純凈水清洗至pH為7. O，材料內(nèi)毒素〈O. 5EU/ml，再將處理后的細(xì)菌纖維素薄膜高壓滅菌并包裝低溫封存，即為具備疏密結(jié)構(gòu)的多孔細(xì)菌纖維素皮膚修復(fù)材料。實(shí)施例5I)發(fā)酵培養(yǎng)液的調(diào)配；發(fā)酵培養(yǎng)液組分，以質(zhì)量百分?jǐn)?shù)計(jì)，單位為wt% :葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇5，蛋白胨O. 5，酵母膏O. 5，檸檬酸O. I，磷酸氫二鈉O. 2，磷酸二氫鉀O. I ；發(fā)酵培養(yǎng)液的pH為5. O ;將上述組分混合后經(jīng)高壓蒸汽滅菌后紫外輻照并冷卻至室溫，通純氧，即得發(fā)酵培養(yǎng)液；2)菌種擴(kuò)培；將所述的發(fā)酵培養(yǎng)液接種和擴(kuò)培；擴(kuò)培程度菌種細(xì)胞數(shù)目在2X107個(gè)/mL。3)靜置培養(yǎng)；將擴(kuò)培后的菌液轉(zhuǎn)移至裝有發(fā)酵培養(yǎng)液的培養(yǎng)容器中，放置于恒溫培養(yǎng)箱中，30°C靜置培養(yǎng)；通過(guò)分步調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)液上方空氣整體氣壓以及氧氣分壓來(lái)實(shí)現(xiàn)細(xì)菌纖維素薄膜的上密下疏的雙層結(jié)構(gòu)；a.細(xì)菌纖維素生長(zhǎng)誘導(dǎo)期I天控制與發(fā)酵培養(yǎng)液液面相接觸的空氣壓力為I個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，直至細(xì)菌將發(fā)酵培養(yǎng)液中溶解的氧氣消耗殆盡后浮上液面，液面出現(xiàn)一層半透明的細(xì)菌纖維素薄膜；b.細(xì)菌纖維素快速生長(zhǎng)期2天控制與細(xì)菌纖維素膜上表面空氣壓力為I個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，同時(shí)保持氧氣濃度在10%范圍內(nèi)；至細(xì)菌纖維素薄膜厚度達(dá)到O. 5mm ；c.細(xì)菌纖維素平穩(wěn)生長(zhǎng)期4天平穩(wěn)生長(zhǎng)期分兩個(gè)階段致密層形成階段，采用連續(xù)增壓，每分鐘向容器內(nèi)充入壓力百分?jǐn)?shù)5. 63X10_2%的空氣，基數(shù)是一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，直至容器內(nèi)空氣壓力為I. 5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓時(shí)不再增加壓力。使與細(xì)菌纖維素膜上表面相接觸的空氣壓力在I. 5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，同時(shí)采用連續(xù)增加氧氣濃度的方式，使氧氣濃度每分鐘增加O. 06%，直至氧氣濃度達(dá)到50%時(shí)不再增加；當(dāng)細(xì)菌纖維素膜厚度達(dá)到8mm時(shí)，將其取出，即得到具備疏密結(jié)構(gòu)的細(xì)菌纖維素薄膜；疏松層形成階段，維持與細(xì)菌纖維素膜上表面相接觸的空氣壓力為I個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，同時(shí)維持氧氣濃度為10%，直至細(xì)菌纖維素薄膜厚度增長(zhǎng)至2 8mm時(shí)，在細(xì)菌纖維素薄膜上表面均勻加入緩釋微球；維持與細(xì)菌纖維素膜上表面接觸的空氣壓力為I個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，同時(shí)維持氧氣濃度為10%，直至細(xì)菌纖維素膜厚度達(dá)到8 15mm時(shí)將其取出，即得到具備疏密結(jié)構(gòu)的多孔細(xì)菌纖維素薄膜；4)后處理；靜置培養(yǎng)結(jié)束后，將上述的具備疏密結(jié)構(gòu)的細(xì)菌纖維素薄膜浸泡至濃度為lwt%的氫氧化鈉溶液中，煮沸保持2小時(shí)，用純凈水清洗至pH為7. O，材料內(nèi)毒素〈O. 5EU/ml，再將處理后的細(xì)菌纖維素薄膜高壓滅菌并包裝低溫封存，即為具備疏密結(jié)構(gòu)的多孔細(xì)菌纖維素皮膚修復(fù)材料。
實(shí)施例6I)發(fā)酵培養(yǎng)液的調(diào)配；發(fā)酵培養(yǎng)液組分，以質(zhì)量百分?jǐn)?shù)計(jì)，單位為wt% :葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇5，蛋白胨O. 5，酵母膏O. 5，檸檬酸O. I，磷酸氫二鈉O. 2，磷酸二氫鉀O. I ；發(fā)酵培養(yǎng)液的pH為5. O ;將上述組分混合后經(jīng)高壓蒸汽滅菌后紫外輻照并冷卻至室溫，通純氧，即得發(fā)酵培養(yǎng)液；
2)菌種擴(kuò)培；將所述的發(fā)酵培養(yǎng)液接種和擴(kuò)培；擴(kuò)培程度菌種細(xì)胞數(shù)目在2X107個(gè)/mL。3)靜置培養(yǎng)；將擴(kuò)培后的菌液轉(zhuǎn)移至裝有發(fā)酵培養(yǎng)液的培養(yǎng)容器中，放置于恒溫培養(yǎng)箱中，30°C靜置培養(yǎng)；通過(guò)分步調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)液上方空氣整體氣壓以及氧氣分壓來(lái)實(shí)現(xiàn)細(xì)菌纖維素薄膜的上密下疏的雙層結(jié)構(gòu)；a.細(xì)菌纖維素生長(zhǎng)誘導(dǎo)期I天控制與發(fā)酵培養(yǎng)液液面相接觸的空氣壓力為I個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，直至細(xì)菌將發(fā)酵培養(yǎng)液中溶解的氧氣消耗殆盡后浮上液面，液面出現(xiàn)一層半透明的細(xì)菌纖維素薄膜；b.細(xì)菌纖維素快速生長(zhǎng)期2天控制與細(xì)菌纖維素膜上表面空氣壓力為I個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，同時(shí)保持氧氣濃度在10%范圍內(nèi)；至細(xì)菌纖維素薄膜厚度達(dá)到O. 5mm ；c.細(xì)菌纖維素平穩(wěn)生長(zhǎng)期4天平穩(wěn)生長(zhǎng)期分兩個(gè)階段致密層形成階段，采用階段性增壓，每小時(shí)向容器內(nèi)充入壓力百分?jǐn)?shù)O. 797%的空氣，基數(shù)是一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，直至容器內(nèi)空氣壓力為1.1個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓時(shí)不再增加壓力。使與細(xì)菌纖維素膜上表面相接觸的空氣壓力在I. I個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，同時(shí)采用階段性增加氧氣濃度的方式，使氧氣濃度每小時(shí)增加2. 92%，直至氧氣濃度達(dá)到50%時(shí)不再增加；當(dāng)細(xì)菌纖維素膜厚度達(dá)到8mm時(shí)，將其取出，即得到具備疏密結(jié)構(gòu)的細(xì)菌纖維素薄膜；疏松層形成階段，維持與細(xì)菌纖維素膜上表面相接觸的空氣壓力為I個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，同時(shí)維持氧氣濃度為10%，直至細(xì)菌纖維素薄膜厚度增長(zhǎng)至2 8mm時(shí)，在細(xì)菌纖維素薄膜上表面均勻加入緩釋微球；維持與細(xì)菌纖維素膜上表面接觸的空氣壓力為I個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，同時(shí)維持氧氣濃度為10%，直至細(xì)菌纖維素膜厚度達(dá)到8 15mm時(shí)將其取出，即得到具備疏密結(jié)構(gòu)的多孔細(xì)菌纖維素薄膜；4)后處理；靜置培養(yǎng)結(jié)束后，將上述的具備疏密結(jié)構(gòu)的細(xì)菌纖維素薄膜浸泡至濃度為lwt%的氫氧化鈉溶液中，煮沸保持2小時(shí)，用純凈水清洗至pH為7. O，材料內(nèi)毒素〈O. 5EU/ml，再將處理后的細(xì)菌纖維素薄膜高壓滅菌并包裝低溫封存，即為具備疏密結(jié)構(gòu)的多孔細(xì)菌纖維素皮膚修復(fù)材料。實(shí)施例7I)發(fā)酵培養(yǎng)液的調(diào)配；發(fā)酵培養(yǎng)液組分，以質(zhì)量百分?jǐn)?shù)計(jì)，單位為wt% :葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇5，蛋白胨O. 5，酵母膏O. 5，檸檬酸O. I，磷酸氫二鈉O. 2，磷酸二氫鉀O. I ；發(fā)酵培養(yǎng)液的pH為5. O ;將上述組分混合后經(jīng)高壓蒸汽滅菌后紫外輻照并冷卻至室溫，通純氧，即得發(fā)酵培養(yǎng)液；2)菌種擴(kuò)培；將所述的發(fā)酵培養(yǎng)液接 和擴(kuò)培；擴(kuò)培程度菌種細(xì)胞數(shù)目在2X107個(gè)/mL。3)靜置培養(yǎng)；將擴(kuò)培后的菌液轉(zhuǎn)移至裝有發(fā)酵培養(yǎng)液的培養(yǎng)容器中，放置于恒溫培養(yǎng)箱中，30°C靜置培養(yǎng)；通過(guò)分步調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)液上方空氣整體氣壓以及氧氣分壓來(lái)實(shí)現(xiàn)細(xì)菌纖維素薄膜的上密下疏的雙層結(jié)構(gòu)；a.細(xì)菌纖維素生長(zhǎng)誘導(dǎo)期I天控制與發(fā)酵培養(yǎng)液液面相接觸的空氣壓力為I個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，直至細(xì)菌將發(fā)酵培養(yǎng)液中溶解的氧氣消耗殆盡后浮上液面，液面出現(xiàn)一層半透明的細(xì)菌纖維素薄膜；b.細(xì)菌纖維素快速生長(zhǎng)期2天控制與細(xì)菌纖維素膜上表面空氣壓力為I個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，同時(shí)保持氧氣濃度在10%范圍內(nèi)；至細(xì)菌纖維素薄膜厚度達(dá)到O. 5mm ；c.細(xì)菌纖維素平穩(wěn)生長(zhǎng)期4天平穩(wěn)生長(zhǎng)期分兩個(gè)階段致密層形成階段，采用階段性增壓，每小時(shí)向容器內(nèi)充入壓力百分?jǐn)?shù)3. 437%的空氣，基數(shù)是一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，直至容器內(nèi)空氣壓力為I. 5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓時(shí)不再增加壓力。使與細(xì)菌纖維素膜上表面相接觸的空氣壓力在I. 5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，同時(shí)采用階段性增加氧氣濃度的方式，使氧氣濃度每小時(shí)增加3. 33%，直至氧氣濃度達(dá)到50%時(shí)不再增加；當(dāng)細(xì)菌纖維素膜厚度達(dá)到8mm時(shí)，將其取出，即得到具備疏密結(jié)構(gòu)的細(xì)菌纖維素薄膜；疏松層形成階段，維持與細(xì)菌纖維素膜上表面相接觸的空氣壓力為I個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，同時(shí)維持氧氣濃度為10%，直至細(xì)菌纖維素薄膜厚度增長(zhǎng)至2 8mm時(shí)，在細(xì)菌纖維素薄膜上表面均勻加入緩釋微球；維持與細(xì)菌纖維素膜上表面接觸的空氣壓力為I個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，同時(shí)維持氧氣濃度為10%，直至細(xì)菌纖維素膜厚度達(dá)到8 15mm時(shí)將其取出，即得到具備疏密結(jié)構(gòu)的多孔細(xì)菌纖維素薄膜；4)后處理；靜置培養(yǎng)結(jié)束后，將上述的具備疏密結(jié)構(gòu)的細(xì)菌纖維素薄膜浸泡至濃度為lwt%的氫氧化鈉溶液中，煮沸保持2小時(shí)，用純凈水清洗至pH為7. O，材料內(nèi)毒素〈O. 5EU/ml，再將處理后的細(xì)菌纖維素薄膜高壓滅菌并包裝低溫封存，即為具備疏密結(jié)構(gòu)的多孔細(xì)菌纖維素皮膚修復(fù)材料。實(shí)施例8I)發(fā)酵培養(yǎng)液的調(diào)配；發(fā)酵培養(yǎng)液組分，以質(zhì)量百分?jǐn)?shù)計(jì)，單位為wt% :葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇5，蛋白胨O. 5，酵母膏O. 5，檸檬酸O. I，磷酸氫二鈉O. 2，磷酸二氫鉀O. I ；發(fā)酵培養(yǎng)液的pH為5. O ;將上述組分混合后經(jīng)高壓蒸汽滅菌后紫外輻照并冷卻至室溫，通純氧，即得發(fā)酵培養(yǎng)液；2)菌種擴(kuò)培；將所述的發(fā)酵培養(yǎng)液接種和擴(kuò)培；擴(kuò)培程度菌種細(xì)胞數(shù)目在2X107個(gè)/mL。3)靜置培養(yǎng)；將擴(kuò)培后的菌液轉(zhuǎn)移至裝有發(fā)酵培養(yǎng)液的培養(yǎng)容器中，放置于恒溫培養(yǎng)箱中，30°C靜置培養(yǎng)；通過(guò)分步調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)液上方空氣整體氣壓以及氧氣分壓來(lái)實(shí)現(xiàn)細(xì)菌纖維素薄膜的上密下疏的雙層結(jié)構(gòu)；a.細(xì)菌纖維素生長(zhǎng)誘導(dǎo)期I天控制與發(fā)酵培養(yǎng)液液面相接觸的空氣壓力為I個(gè) 標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，直至細(xì)菌將發(fā)酵培養(yǎng)液中溶解的氧氣消耗殆盡后浮上液面，液面出現(xiàn)一層半透明的細(xì)菌纖維素薄膜；b.細(xì)菌纖維素快速生長(zhǎng)期2天控制與細(xì)菌纖維素膜上表面空氣壓力為I個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，同時(shí)保持氧氣濃度在10%范圍內(nèi)；至細(xì)菌纖維素薄膜厚度達(dá)到O. 5mm ；c.細(xì)菌纖維素平穩(wěn)生長(zhǎng)期4天平穩(wěn)生長(zhǎng)期分兩個(gè)階段致密層形成階段，采用連續(xù)增壓，每分鐘向容器內(nèi)充入壓力百分?jǐn)?shù)3. OOX 10_2%的空氣，基數(shù)是一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，直至容器內(nèi)空氣壓力為I. 3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓時(shí)不再增加壓力。使與細(xì)菌纖維素膜上表面相接觸的空氣壓力在I. 3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，同時(shí)采用連續(xù)增加氧氣濃度的方式，使氧氣濃度每分鐘增加O. 55%，直至氧氣濃度達(dá)到50%時(shí)不再增加；當(dāng)細(xì)菌纖維素膜厚度達(dá)到8mm時(shí)，將其取出，即得到具備疏密結(jié)構(gòu)的細(xì)菌纖維素薄膜；疏松層形成階段，維持與細(xì)菌纖維素膜上表面相接觸的空氣壓力為I個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，同時(shí)維持氧氣濃度為10%，直至細(xì)菌纖維素薄膜厚度增長(zhǎng)至2 8mm時(shí)，在細(xì)菌纖維素薄膜上表面均勻加入緩釋微球；維持與細(xì)菌纖維素膜上表面接觸的空氣壓力為I個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，同時(shí)維持氧氣濃度為10%，直至細(xì)菌纖維素膜厚度達(dá)到8 15mm時(shí)將其取出，即得到具備疏密結(jié)構(gòu)的多孔細(xì)菌纖維素薄膜；4)后處理；靜置培養(yǎng)結(jié)束后，將上述的具備疏密結(jié)構(gòu)的細(xì)菌纖維素薄膜浸泡至濃度為lwt%的氫氧化鈉溶液中，煮沸保持2小時(shí)，用純凈水清洗至pH為7. O，材料內(nèi)毒素〈O. 5EU/ml，再將處理后的細(xì)菌纖維素薄膜高壓滅菌并包裝低溫封存，即為具備疏密結(jié)構(gòu)的多孔細(xì)菌纖維素皮膚修復(fù)材料。實(shí)施例9I)發(fā)酵培養(yǎng)液的調(diào)配；發(fā)酵培養(yǎng)液組分，以質(zhì)量百分?jǐn)?shù)計(jì)，單位為wt% :葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇5，蛋白胨O. 5，酵母膏O. 5，檸檬酸O. I，磷酸氫二鈉O. 2，磷酸二氫鉀O. I ；發(fā)酵培養(yǎng)液的pH為5. O ;將上述組分混合后經(jīng)高壓蒸汽滅菌后紫外輻照并冷卻至室溫，通純氧，即得發(fā)酵培養(yǎng)液；2)菌種擴(kuò)培；將所述的發(fā)酵培養(yǎng)液接種和擴(kuò)培；擴(kuò)培程度菌種細(xì)胞數(shù)目在2X107個(gè)/mL。
3)靜置培養(yǎng)；將擴(kuò)培后的菌液轉(zhuǎn)移至裝有發(fā)酵培養(yǎng)液的培養(yǎng)容器中，放置于恒溫培養(yǎng)箱中，30°C靜置培養(yǎng)；通過(guò)分步調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)液上方空氣整體氣壓以及氧氣分壓來(lái)實(shí)現(xiàn)細(xì)菌纖維素薄膜的上密下疏的雙層結(jié)構(gòu)；a.細(xì)菌纖維素生長(zhǎng)誘導(dǎo)期I天控制與發(fā)酵培養(yǎng)液液面相接觸的空氣壓力為I個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，直至細(xì)菌將發(fā)酵培養(yǎng)液中溶解的氧氣消耗殆盡后浮上液面，液面出現(xiàn)一層半透明的細(xì)菌纖維素薄膜；b.細(xì)菌纖維素快速生長(zhǎng)期2天控制與細(xì)菌纖維素膜上表面空氣壓力為I個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，同時(shí)保持氧氣濃度在10%范圍內(nèi)；至細(xì)菌纖維素薄膜厚度達(dá)到O. 5mm ； c.細(xì)菌纖維素平穩(wěn)生長(zhǎng)期4天平穩(wěn)生長(zhǎng)期分兩個(gè)階段致密層形成階段，采用階段性增壓，每小時(shí)向容器內(nèi)充入壓力百分?jǐn)?shù)I. 50%的空氣，基數(shù)是一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，直至容器內(nèi)空氣壓力為I. 3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓時(shí)不再增加壓力。使與細(xì)菌纖維素膜上表面相接觸的空氣壓力在I. 3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，同時(shí)采用階段性增加氧氣濃度的方式，使氧氣濃度每小時(shí)增加3. 00%，直至氧氣濃度達(dá)到50%時(shí)不再增加；當(dāng)細(xì)菌纖維素膜厚度達(dá)到8mm時(shí)，將其取出，即得到具備疏密結(jié)構(gòu)的細(xì)菌纖維素薄膜；疏松層形成階段，維持與細(xì)菌纖維素膜上表面相接觸的空氣壓力為I個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，同時(shí)維持氧氣濃度為10%，直至細(xì)菌纖維素薄膜厚度增長(zhǎng)至2 8mm時(shí)，在細(xì)菌纖維素薄膜上表面均勻加入緩釋微球；維持與細(xì)菌纖維素膜上表面接觸的空氣壓力為I個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，同時(shí)維持氧氣濃度為10%，直至細(xì)菌纖維素膜厚度達(dá)到8 15mm時(shí)將其取出，即得到具備疏密結(jié)構(gòu)的多孔細(xì)菌纖維素薄膜；4)后處理；靜置培養(yǎng)結(jié)束后，將上述的具備疏密結(jié)構(gòu)的細(xì)菌纖維素薄膜浸泡至濃度為lwt%的氫氧化鈉溶液中，煮沸保持2小時(shí)，用純凈水清洗至pH為7. 0，材料內(nèi)毒素〈O. 5EU/ml，再將處理后的細(xì)菌纖維素薄膜高壓滅菌并包裝低溫封存，即為具備疏密結(jié)構(gòu)的多孔細(xì)菌纖維素皮膚修復(fù)材料。實(shí)施例10I)發(fā)酵培養(yǎng)液的調(diào)配；發(fā)酵培養(yǎng)液組分，以質(zhì)量百分?jǐn)?shù)計(jì)，單位為wt% :葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇5，蛋白胨O. 5，酵母膏O. 5，檸檬酸O. I，磷酸氫二鈉O. 2，磷酸二氫鉀O. I ；發(fā)酵培養(yǎng)液的pH為5. O ;將上述組分混合后經(jīng)高壓蒸汽滅菌后紫外輻照并冷卻至室溫，通純氧，即得發(fā)酵培養(yǎng)液；2)菌種擴(kuò)培；將所述的發(fā)酵培養(yǎng)液接種和擴(kuò)培；擴(kuò)培程度菌種細(xì)胞數(shù)目在2X107個(gè)/mL。3)靜置培養(yǎng)；將擴(kuò)培后的菌液轉(zhuǎn)移至裝有發(fā)酵培養(yǎng)液的培養(yǎng)容器中，放置于恒溫培養(yǎng)箱中，30°C靜置培養(yǎng)；
通過(guò)分步調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)液上方空氣整體氣壓以及氧氣分壓來(lái)實(shí)現(xiàn)細(xì)菌纖維素薄膜的上密下疏的雙層結(jié)構(gòu)；a.細(xì)菌纖維素生長(zhǎng)誘導(dǎo)期I天控制與發(fā)酵培養(yǎng)液液面相接觸的空氣壓力為I個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，直至細(xì)菌將發(fā)酵培養(yǎng)液中溶解的氧氣消耗殆盡后浮上液面，液面出現(xiàn)一層半透明的細(xì)菌纖維素薄膜；b.細(xì)菌纖維素快速生長(zhǎng)期2天控制與細(xì)菌纖維素膜上表面空氣壓力為I個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，同時(shí)保持氧氣濃度在10% ;至細(xì)菌纖維素薄膜厚度達(dá)到O. 5mm ；c.細(xì)菌纖維素平穩(wěn)生長(zhǎng)期4天平穩(wěn)生長(zhǎng)期分兩個(gè)階段疏松層形成階段，維持與細(xì)菌纖維素膜上表面相接觸的空氣壓力為I個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，同時(shí)維持氧氣濃度為10%，直至細(xì)菌纖維素薄膜厚度增長(zhǎng)至2 8mm時(shí)，在細(xì)菌纖維素薄 膜上表面均勻加入緩釋微球；維持與細(xì)菌纖維素膜上表面接觸的空氣壓力為I個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，同時(shí)維持氧氣濃度為10%，直至細(xì)菌纖維素膜厚度達(dá)到8 15mm時(shí)將其取出，即得到具備疏密結(jié)構(gòu)的多孔細(xì)菌纖維素薄膜；致密層形成階段，采用連續(xù)增壓，每分鐘向容器內(nèi)充入壓力百分?jǐn)?shù)I. 32X10_2%的空氣，基數(shù)是一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，直至容器內(nèi)空氣壓力為I. I個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓時(shí)不再增加壓力。使與細(xì)菌纖維素膜上表面相接觸的空氣壓力在I. I個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，同時(shí)采用連續(xù)增加氧氣濃度的方式，使氧氣濃度每分鐘增加O. 05%，直至氧氣濃度達(dá)到50%時(shí)不再增加；當(dāng)細(xì)菌纖維素膜厚度達(dá)到8mm時(shí)，將其取出，即得到具備疏密結(jié)構(gòu)的細(xì)菌纖維素薄膜；4)后處理；靜置培養(yǎng)結(jié)束后，將上述的具備疏密結(jié)構(gòu)的細(xì)菌纖維素薄膜浸泡至濃度為lwt%的氫氧化鈉溶液中，煮沸保持2小時(shí)，用純凈水清洗至pH為7. O，材料內(nèi)毒素〈O. 5EU/ml，再將處理后的細(xì)菌纖維素薄膜高壓滅菌并包裝低溫封存，即為具備疏密結(jié)構(gòu)的多孔細(xì)菌纖維素皮膚修復(fù)材料。
權(quán)利要求
1.一種具備疏密結(jié)構(gòu)的多孔細(xì)菌纖維素皮膚修復(fù)材料，其特征是具備疏密結(jié)構(gòu)的多孔細(xì)菌纖維素皮膚修復(fù)材料是由兩層結(jié)合緊密的細(xì)菌纖維素膜構(gòu)成，所述的兩層結(jié)合緊密的細(xì)菌纖維素膜為致密層與疏松層；所述的結(jié)合緊密是指所述致密層的纖維素微纖絲與所述疏松層的纖維素微纖絲通過(guò)P -I, 4-葡萄糖鏈中的分子內(nèi)與分子間氫鍵結(jié)合，形成分子層，層與層之間也通過(guò)分子內(nèi)與分子間氫鍵結(jié)合，無(wú)明顯物理分層； 其中所述致密層中的纖維素含量0. 7X 10_2 I. OX 10_2g/cm3 ;所述疏松層中的纖維素含量0. 2 X Kr2 0. 5X l(T2g/cm3，所述疏松層中均勻分布有孔徑為50 250mm的微孔，孔隙率在80%以上。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種具備疏密結(jié)構(gòu)的多孔細(xì)菌纖維素皮膚修復(fù)材料，其特征在于，所述的細(xì)菌纖維素膜是由菌種消耗糖源，分泌纖維素微纖絲通過(guò)分子內(nèi)與分子間氫鍵結(jié)合形成；所述的菌種是指能夠生物合成纖維素的微生物，包括木醋桿菌、產(chǎn)醋桿菌、醋化桿菌、巴氏醋桿菌、葡萄糖桿菌、農(nóng)桿菌、根瘤菌、八疊球菌、洋蔥假單胞菌、椰毒假單胞菌或空腸彎曲菌中的一種或幾種。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種具備疏密結(jié)構(gòu)的多孔細(xì)菌纖維素皮膚修復(fù)材料，其特征在于，所述的具備疏密結(jié)構(gòu)的多孔細(xì)菌纖維素皮膚修復(fù)材料的厚度為8 15mm，其中所述疏松層的厚度為6 13mm。
4.如權(quán)利要求I所述的一種具備疏密結(jié)構(gòu)的多孔細(xì)菌纖維素皮膚修復(fù)材料的制備方法，其特征是包括以下步驟 1)發(fā)酵培養(yǎng)液的調(diào)配； 發(fā)酵培養(yǎng)液組分，以質(zhì)量百分?jǐn)?shù)計(jì)，單位為wt% :葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇2 5，蛋白胨0. 05 0. 5，酵母膏0. 05 0. 5，檸檬酸0. 01 0. 1，磷酸氫二鈉0. 02 0. 2，磷酸二氫鉀0. 01 0. I,余量為水； 發(fā)酵培養(yǎng)液的pH為4. 0 6. 0 ; 將上述組分混合后經(jīng)高壓蒸汽滅菌后紫外輻照并冷卻至室溫，通純氧，即得發(fā)酵培養(yǎng)液； 2)菌種擴(kuò)培； 將所述的發(fā)酵培養(yǎng)液接種和擴(kuò)培；擴(kuò)培程度菌種細(xì)胞數(shù)目在2 X IO5 2 X IO7個(gè)/ml ; 3)靜置培養(yǎng)； 將擴(kuò)培后的菌液轉(zhuǎn)移至裝有發(fā)酵培養(yǎng)液的培養(yǎng)容器中，放置于恒溫培養(yǎng)箱中，28 .32 °C靜置培養(yǎng)； 通過(guò)分步調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)液上方空氣整體氣壓以及氧氣分壓來(lái)實(shí)現(xiàn)細(xì)菌纖維素薄膜的疏密雙層結(jié)構(gòu)；通過(guò)在疏松層靜置培養(yǎng)過(guò)程中添加緩釋微球，使纖維素微纖絲之間通過(guò)分子內(nèi)與分子間氫鍵結(jié)合，結(jié)晶形成細(xì)菌纖維素的過(guò)程中，原位包覆緩釋微球，微球降解后，形成疏松層內(nèi)部多孔結(jié)構(gòu)； a.細(xì)菌纖維素生長(zhǎng)誘導(dǎo)期I 2天控制與發(fā)酵培養(yǎng)液液面相接觸的空氣壓力為I個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，直至細(xì)菌將發(fā)酵培養(yǎng)液中溶解的氧氣消耗殆盡后浮上液面，液面出現(xiàn)一層半透明的細(xì)菌纖維素薄膜； b.細(xì)菌纖維素快速生長(zhǎng)期2 3天控制與細(xì)菌纖維素膜上表面空氣壓力為I個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，同時(shí)保持氧氣體積濃度在10 15%范圍內(nèi)；至細(xì)菌纖維素薄膜厚度達(dá)到0. 3 ,0.5mm ； c.細(xì)菌纖維素平穩(wěn)生長(zhǎng)期3 4天 平穩(wěn)生長(zhǎng)期分兩個(gè)階段 致密層形成階段，加壓使與細(xì)菌纖維素膜上表面相接觸的空氣壓力在I. I I. 5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓范圍內(nèi)，同時(shí)提高氧氣濃度至50 100%范圍內(nèi)；直至細(xì)菌纖維素膜厚度達(dá)到I 4mm ； 疏松層形成階段，維持與細(xì)菌纖維素膜上表面相接觸的空氣壓力為I個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，同時(shí)維持氧氣濃度為10 15%，直至細(xì)菌纖維素薄膜厚度增長(zhǎng)至2 8mm時(shí)，在細(xì)菌纖維素薄膜上表面均勻加入緩釋微球；維持與細(xì)菌纖維素膜上表面接觸的空氣壓力為I個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，同時(shí)維持氧氣濃度為10 15%，直至細(xì)菌纖維素膜厚度達(dá)到8 15mm時(shí)將其取出，SP得到具備疏密結(jié)構(gòu)的多孔細(xì)菌纖維素薄膜； 4)后處理； 靜置培養(yǎng)結(jié)束后，將上述的具備疏密結(jié)構(gòu)的多孔細(xì)菌纖維素薄膜浸泡至濃度為I 10wt%的氫氧化鈉溶液中，煮沸保持2 10小時(shí)，用純凈水清洗至pH為7. 0，材料內(nèi)毒素〈O. 5EU/ml，再將處理后的細(xì)菌纖維素薄膜高壓滅菌并包裝低溫封存，即為具備疏密結(jié)構(gòu)的多孔細(xì)菌纖維素皮膚修復(fù)材料。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種具備疏密結(jié)構(gòu)的多孔細(xì)菌纖維素皮膚修復(fù)材料的制備方法，其特征在于，所述的緩釋微球?yàn)榫哂衅ば窘Y(jié)構(gòu)，外徑為50 250 ii m ;其中，緩釋微球內(nèi)部含有過(guò)氧化合物、葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇；緩釋微球囊壁材料為明膠、聚乳酸、聚羥基乙酸、聚乳酸-羥基乙酸共聚物、殼聚糖或膠原；所述的均勻加入是指將緩釋微球均勻分散在經(jīng)過(guò)滅菌處理，調(diào)配好的發(fā)酵培養(yǎng)液中，速率在I lOmL/min范圍內(nèi)，由細(xì)菌纖維素薄膜上方噴淋至細(xì)菌纖維素薄膜上表面，液滴直徑范圍在50 250 ii m，其中80%的液滴直徑小于150 V- m,噴淋時(shí)間在5 10分鐘范圍內(nèi)；所述的緩釋微球均勻加入至細(xì)菌纖維素薄膜上表面后，在24 72小時(shí)內(nèi)持續(xù)釋放緩釋微球內(nèi)部物質(zhì)，并在內(nèi)部物質(zhì)釋放完畢后的48小時(shí)內(nèi)，緩釋微球囊壁以溶解或降解的方式消失。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種具備疏密結(jié)構(gòu)的多孔細(xì)菌纖維素皮膚修復(fù)材料的制備方法，其特征在于，所述的高壓蒸汽滅菌后紫外輻照是指將所述發(fā)酵培養(yǎng)液置于高壓滅菌鍋內(nèi)121°C滅菌處理30分鐘后取出置于紫外燈下輻照冷卻至室溫。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種具備疏密結(jié)構(gòu)的多孔細(xì)菌纖維素皮膚修復(fù)材料的制備方法，其特征在于，所述的通純氧是指將醫(yī)用氧以lL/min的速度通入上述的發(fā)酵培養(yǎng)液中，并維持30分鐘；所述的接種是指用滅菌后的接種環(huán)鉤取適量保存于4°C下試管中的菌種，并轉(zhuǎn)移至上述的發(fā)酵培養(yǎng)液中；所述的擴(kuò)培是指將接入菌種后的發(fā)酵培養(yǎng)液于28 32°C下?lián)u床培養(yǎng)8 24小時(shí)。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種具備疏密結(jié)構(gòu)的多孔細(xì)菌纖維素皮膚修復(fù)材料的制備方法，其特征在于，所述的加壓為連續(xù)增壓或階段性增壓；所述的連續(xù)增壓是指每分鐘向容器內(nèi)充入壓力百分?jǐn)?shù)為I. 32X10_2 5. 63X10_2%的空氣，基數(shù)是I個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，直至容器內(nèi)空氣壓力為I. I I. 5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓時(shí)不再增加壓力；所述的階段性增壓是指每小時(shí)向容器內(nèi)充入壓力百分?jǐn)?shù)為0. 797 3. 437%的空氣，基數(shù)是I個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，直至容器內(nèi)空氣壓力為L(zhǎng) I L 5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓時(shí)不再增加壓力。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種具備疏密結(jié)構(gòu)的多孔細(xì)菌纖維素皮膚修復(fù)材料的制備方法，其特征在于，所述的提高氧氣濃度為連續(xù)增加或階段性增加；所述的連續(xù)增加是指氧氣濃度每分鐘增加0. 05 0. 06%，直至氧氣濃度達(dá)到50%時(shí)不再增加；所述的階段性增加是指在上述連續(xù)增壓或階段性增壓過(guò)程中，使氧氣濃度每小時(shí)增加2. 92 3. 33%，直至氧氣濃度達(dá)到50%時(shí)不再增加。
10.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種具備疏密結(jié)構(gòu)的多孔細(xì)菌纖維素皮膚修復(fù)材料的制備方法，其特征在于，所述的高壓滅菌是指將所述后處理后的具備疏密結(jié)構(gòu)的多孔細(xì)菌纖維素薄膜浸泡在純凈水中置于高壓滅菌鍋內(nèi)121°C滅菌處理30分鐘后取出冷卻至室溫；所述的低溫封存是指將高壓滅菌后的具備疏密結(jié)構(gòu)的多孔細(xì)菌纖維素皮膚修復(fù)材料置于4°C下保存。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種具備疏密結(jié)構(gòu)的多孔細(xì)菌纖維素皮膚修復(fù)材料及其制備方法。通過(guò)控制細(xì)菌纖維素的培養(yǎng)條件并在培養(yǎng)過(guò)程中加入緩釋微球制備出一種具有類似人體皮膚“上密下疏”結(jié)構(gòu)的多孔細(xì)菌纖維素皮膚修復(fù)材料。疏松層與致密層結(jié)合緊密，無(wú)明顯物理分層，結(jié)構(gòu)連續(xù)性好；疏松層與致密層內(nèi)存在結(jié)構(gòu)的梯度變化，疏松層中具有均勻分布的多孔，最大程度模仿了人體皮膚上密下疏的漸變梯度結(jié)構(gòu)。有利于細(xì)胞進(jìn)入材料內(nèi)部，明顯縮短傷口愈合周期并有效減少愈合后瘢痕的增生；同時(shí)保持了細(xì)菌纖維素良好的透氣性與持水性，能夠使創(chuàng)面維持濕態(tài)的環(huán)境，更利于創(chuàng)面的愈合。成型過(guò)程簡(jiǎn)單，培養(yǎng)周期短，制備過(guò)程綠色環(huán)保、簡(jiǎn)便快速、制備成本低廉。
文檔編號(hào)C12P19/04GK102973985SQ20121057550
公開日2013年3月20日 申請(qǐng)日期2012年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月26日
發(fā)明者李喆, 楊敬軒, 王利群, 鄭羿, 張?jiān)? 王華平, 陳仕艷 申請(qǐng)人:東華大學(xué)