一種1,5-脫水葡糖醇的氧化酶法測(cè)定方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種1，5-脫水葡糖醇的氧化酶法測(cè)定方法，可廣泛應(yīng)用在醫(yī)學(xué)及生物化學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】。其特點(diǎn)是：通過(guò)葡萄糖激酶(GK)和磷酸葡萄糖異構(gòu)酶(PGI)將樣品中葡萄糖(Glu)轉(zhuǎn)化為果糖-6-磷酸(Fru-6-P)，并通過(guò)系統(tǒng)中的丙酮酸激酶(PK)和磷酸烯醇式丙酮酸鹽(PEP)，建立ATP再生系統(tǒng)，確保Glu向Fru-6-P轉(zhuǎn)化。樣品中1，5-AG經(jīng)吡喃糖氧化酶(PROD)作用生成1，5-脫水果糖(1，5-AF)和H2O2，后者借Trinder’s系統(tǒng)顯色定量。
【專利說(shuō)明】一種1 ’ 5-脫水葡糖醇的氧化酶法測(cè)定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及1，5-脫水葡糖醇(1，5-AG)的氧化法測(cè)定方法，可廣泛應(yīng)用在醫(yī)學(xué)及生物化學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]血清中1，5_脫水葡糖醇濃度不受即時(shí)的飲食、葡萄糖攝食量影響，能快速、靈敏的反映3-5天內(nèi)總血糖變化情況。糖尿病患者血清1，5-AG顯著降低，當(dāng)糖尿病得到良好控制時(shí)，血清1，5-AG的日回升率十分穩(wěn)定，不受冶療方法、性別、年齡、體重、患病時(shí)間和血清中1，5-AG起初的濃度影響，回升幅度和對(duì)糖尿病診斷的敏感性及特異性均明顯大于常用的糖尿病診斷指標(biāo)糖化血紅蛋白(HbAlc)和果糖胺(GSP)。
[0003]文獻(xiàn)報(bào)道測(cè)定1，5_AG的方法有陰離子交換層析法、高效液相色譜法(HPLC)、液相色譜質(zhì)譜法(LC-MS)、全自動(dòng)酶分析法等，前三種方法需要對(duì)1，5-AG進(jìn)行衍生和復(fù)雜的樣品前處理，同時(shí)需特殊、昂貴儀器，不適合臨床常規(guī)分析。全自動(dòng)酶法雖好，但易受血清中高濃度葡萄糖干擾，如Fukumura Y (Clin Chem, 1994,40:2013-2016.)、陳國(guó)軍等(中華醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志，1999，22 (6):358-361.)在測(cè)定1，5-AG時(shí)，將葡萄糖通過(guò)葡萄糖激酶(GK)轉(zhuǎn)化為6-磷酸葡萄糖，然后用吡喃糖氧化酶(PROD)將1，5-AG氧化產(chǎn)生過(guò)氧化氫并偶聯(lián)TrindreJ s反應(yīng)顯色定量。由于PROD酶的底物特異性不佳，反應(yīng)中生成的6-磷酸葡萄糖在丙酮酸激酶等含量不足時(shí)易重新轉(zhuǎn)化為葡萄糖，生成的葡萄糖被PROD酶氧化后參與Trindre^ s反應(yīng)并顯色，從而引起1，5_AG的測(cè)定結(jié)果假性升高。
[0004]本發(fā)明的目 的是為了解決上述技術(shù)的不足，將葡萄糖轉(zhuǎn)化為6-磷酸葡萄糖后，進(jìn)一步利用磷酸葡萄糖異構(gòu)酶的催化作用將6-磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)化為不與PROD酶作用的6-磷酸果糖，并通過(guò)系統(tǒng)中的丙酮酸激酶(PK)和磷酸烯醇式丙酮酸鹽(PEP)，建立ATP再生系統(tǒng)，確保葡萄糖向6-磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)化，該法測(cè)定試劑4°C開(kāi)瓶穩(wěn)定性達(dá)27d，對(duì)1，5-AG具有良好的選擇性，高達(dá)85.0mol/L的葡萄糖不干擾本法測(cè)定。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供了 1，5_脫水葡糖醇(1，5-AG)的氧化酶法測(cè)定方法，用于血清1，5_脫水葡糖醇的測(cè)定。該測(cè)定體系主要是通過(guò)葡萄糖激酶(GK)和磷酸葡萄糖異構(gòu)酶(PGI)將樣品中葡萄糖(Glu)轉(zhuǎn)化為果糖-6-磷酸(Fru-6-P)，并通過(guò)系統(tǒng)中的丙酮酸激酶(PK)和磷酸烯醇式丙酮酸鹽(PEP)，建立ATP再生系統(tǒng)，確保Glu向Fru-6-P轉(zhuǎn)化。樣品中1，5-AG經(jīng)吡喃糖氧化酶(PROD)作用生成1，5-脫水果糖(1，5-AF)和H2O2，后者借Trinder’s系統(tǒng)顯色定量。
[0006]為了達(dá)到理想的檢測(cè)效果，本發(fā)明還特別提供了 1，5_脫水葡糖醇(1，5-AG)的氧化酶法測(cè)定試劑，分為A、B 二個(gè)組份。兩個(gè)組份的具體成份組成可表述如下。
[0007]A 組份:
[0008]
【權(quán)利要求】
1.一種1，5-脫水葡糖醇的氧化酶法測(cè)定方法，其特征是通過(guò)葡萄糖激酶(GK)將主要干擾物葡萄糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖-6磷酸(Glu-6-P)，葡萄糖-6磷酸(Glu-6-P)再經(jīng)磷酸葡萄糖異構(gòu)酶(PGI)轉(zhuǎn)化為果糖-6-磷酸(Fru-6-P)，并通過(guò)系統(tǒng)中的丙酮酸激酶(PK)和磷酸烯醇式丙酮酸鹽(PEP)，建立ATP再生系統(tǒng)，確保Glu向Fru-6-P轉(zhuǎn)化。樣品中1，5-AG經(jīng)吡喃糖氧化酶(PROD)作用生成1，5_脫水果糖(1，5-AF)和H2O2，后者借Trinder’s系統(tǒng)顯色定量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種1，5_脫水葡糖醇的氧化酶法測(cè)定方法，其特征是在將主要干擾物葡萄糖轉(zhuǎn)化為果糖-6-磷酸(Fru-6-P)的同時(shí)，必須建立ATP再生系統(tǒng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種1，5_脫水葡糖醇的氧化酶法測(cè)定方法，其特征是在將主要干擾物葡萄糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖-6磷酸(Glu-6-P)的酶是葡萄糖激酶(GK)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種1，5_脫水葡糖醇的氧化法測(cè)定方法，其特征是將待測(cè)物1，5-脫水葡萄糖醇(1，5-AG)氧化的酶是吡喃糖氧化酶(PROD)。
【文檔編號(hào)】C12Q1/533GK103725749SQ201210417645
【公開(kāi)日】2014年4月16日 申請(qǐng)日期:2012年10月16日 優(yōu)先權(quán)日:2012年10月16日
【發(fā)明者】潘利琴 申請(qǐng)人:溫州市人民醫(yī)院