高特異高敏感檢測副溶血性弧菌tdh毒素基因的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高特異高敏感檢測副溶血性弧菌TDH毒素基因的方法，包括以下步驟：步驟1）制備反應(yīng)液；步驟2）使用副溶血性弧菌TDH+菌株的核酸、TDH-菌株的核酸，以及若干臨床分離金黃色葡萄球菌、頭皮葡萄球菌、人型葡萄球菌、表皮葡萄球菌、草綠色鏈球菌、大腸桿菌、克雷伯菌的核酸，多次進行反應(yīng)，觀察它們的陰陽性。本發(fā)明通過配制反應(yīng)液，設(shè)計引物序列，能快速、準(zhǔn)確的檢測副溶血性弧菌TDH毒素基因，并及時采取相應(yīng)的措施，減少了疾病的發(fā)生率。
【專利說明】高特異高敏感檢測副溶血性弧菌TDH毒素基因的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及疾病檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，具體的說，是一種高特異高敏感檢測副溶血性弧菌TDH毒素基因的方法。 【背景技術(shù)】
[0002]副溶血性弧菌(Vibrio Parahemolyticus)是一種嗜鹽性細(xì)菌。副溶血性弧菌食物中毒，是進食含有該菌的食物所致，主要來自海產(chǎn)品，如墨魚、海魚、海蝦、海蟹、海蜇，以及含鹽分較高的腌制食品，如咸菜、腌肉等。本菌存活能力強，在抹布和砧板上能生存I個月以上，海水中可存活47天。臨床上以急性起病、腹痛、嘔吐、腹瀉及水樣便為主要癥狀。本病多在夏秋季發(fā)生于沿海地區(qū)，常造成集體發(fā)病。和近年來由于海鮮空運，內(nèi)地城市病例也漸增多。副溶血弧菌有分泌TDH毒素的菌株和分泌TRH毒素的菌株，TDH毒素對心臟有特異性心臟毒，可引起心房纖維性顫動、期前收縮或心肌損害?？焖贆z測副溶血性弧菌的TDH毒素基因，對提聞副溶血性弧菌引起的食物中毒確定有效治療方案具有很大意義。
[0003]環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)是由日本榮研(EIKEN)株式會社開發(fā)的高特異性敏感度的核酸檢測系統(tǒng)，無須昂貴的設(shè)備，已經(jīng)成為核酸快速檢測法的良好手段，本發(fā)明結(jié)合環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)，設(shè)計針對副溶血性弧菌TDH基因基因序列的一對外引物(VPtdh-F3和VPtdh-B3)和一對內(nèi)引物(VPtdh-FIP和VPtdh-BIP)進行環(huán)介導(dǎo)等溫擴增。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明公開了一種高特異高敏感檢測副溶血性弧菌TDH毒素基因的方法，提高了它的檢測和診斷效率。
[0005]為實現(xiàn)上述技術(shù)目的，達(dá)到上述技術(shù)效果，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn):
高特異高敏感檢測副溶血性弧菌TDH毒素基因的方法，包括以下步驟:
步驟I)制備反應(yīng)液 反應(yīng)液組成及含量為
8u/ul Bst核酸聚合酶8u
IOX耐熱聚合酶反應(yīng)緩沖液lX，MgS04 2mM
4M甜菜堿IM
IOmM d-NTP 混合液400 μ M
內(nèi)引物
VPtdh-FIP40umol
VPtdh-BIP40umol
外引物
VPtdh-F35umol
VPtdh-B35umol
標(biāo)本核酸20ng添加焦碳酸二乙酯處理水至總量達(dá)到25ul;
步驟2)使用副溶血性弧菌TDH+菌株的核酸、TDH-菌株的核酸，以及若干臨床分離金黃色葡萄球菌、頭皮葡萄球菌、人型葡萄球菌、表皮葡萄球菌、草綠色鏈球菌、大腸桿菌、克雷伯菌的核酸，多次進行反應(yīng)，觀察它們的陰陽性。
[0006]進一步的，所述外引物VPtdh-F3 的序列為 TGGTCAATCAGTATTCACAAC。
[0007]進一步的，所述外引物VPtdh-B3 的序列為 CTTCACCAACAAAGTTAGCT。
進一步的，所述內(nèi)引物VPtdh-FIP的序列為 CGCTGCCATTGTATAGTCTTTATCA-GTCAGGTACTAAATGGCTGA。
[0008]進一步的，所述內(nèi)引物VPtdh-BIP 的序列為 GTGTCTGGCTATAAGCACGGT-AGAATCATAGGAATGTTGAAGC。
[0009]進一步的，所述反應(yīng)液中加入熒光顯示物質(zhì)溴化乙錠、鈣黃綠素進行實時檢查。
[0010]本發(fā)明的有益效果是:
本發(fā)明通過配制反應(yīng)液，設(shè)計引物序列，能快速、準(zhǔn)確的檢測副溶血性弧菌TDH毒素基因，并及時采取相應(yīng)的措施，減少了疾病的發(fā)生率。
【具體實施方式】
[0011]下面將結(jié)合實施例，來詳細(xì)說明本發(fā)明。
[0012]高特異高敏感檢測副溶血性弧菌TDH毒素基因的方法，包括以下步驟:
步驟I)制備反應(yīng)液
反應(yīng)液組成及含量為
8u/ul Bst核酸聚合酶8u
IOX耐熱聚合酶反應(yīng)緩沖液lX，MgS04 2mM
4M甜菜堿IM
IOmM d-NTP 混合液400 μ M
內(nèi)引物
VPtdh-FIP40umol
VPtdh-BIP40umol
外引物
VPtdh-F35umol
VPtdh-B35umol
標(biāo)本核酸20ng
添加焦碳酸二乙酯處理水至總量達(dá)到25ul。
[0013]參考副溶血性弧菌的基因tdh (基因序列來源美國國立生物技術(shù)信息中心-NCBI)設(shè)計引物。所述外引物VPtdh-F3的序列為TGGTCAATCAGTATTCACAAC，所述外引物VPtdh-B3的序列為CTTCACCAACAAAGTTAGCT，所述內(nèi)引物VPtdh-FIP的序列為
CGCTGCCATTGTATAGTCTTTATCA-GTCAGGTACTAAATGGCTGA,所述內(nèi)引物 VPtdh-BIP 的序列為 GTGTCTGGCTATAAGCACGGT-AGAATCATAGGAATGTTGAAGC。
[0014]進一步的，所述反應(yīng)液中加入熒光顯示物質(zhì)溴化乙錠、鈣黃綠素進行實時檢查。
[0015]步驟2)使用副溶血性弧菌TDH+菌株3株的核酸、TDH-菌株2株的核酸，以及若干臨床分離金黃色葡萄球菌、頭皮葡萄球菌、人型葡萄球菌、表皮葡萄球菌、草綠色鏈球菌、大腸桿菌、克雷伯菌的核酸，多次進行反應(yīng)，觀察它們的陰陽性。結(jié)果顯示:副溶血性弧菌TDH+3株菌株的核酸每次均為陽性，其余菌種為陰性。
[0016]以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等`，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.高特異高敏感檢測副溶血性弧菌TDH毒素基因的方法，其特征在于，包括以下步驟: 步驟I)制備反應(yīng)液 反應(yīng)液組成及含量為 8u/ul Bst核酸聚合酶8u IOX耐熱聚合酶反應(yīng)緩沖液lX，MgS04 2mM4M甜菜堿IM IOmM d-NTP 混合液400 μ M 內(nèi)引物 VPtdh-FIP40umol VPtdh-BIP40umol 外引物 VPtdh-F35umol VPtdh-B35umol標(biāo)本核酸20ng 添加焦碳酸二乙酯處理水至總量達(dá)到25ul; 步驟2)使用副溶血性弧菌TDH+菌株的核酸、TDH-菌株的核酸，以及若干臨床分離金黃色葡萄球菌、頭皮葡萄球菌、人型葡萄球菌、表皮葡萄球菌、草綠色鏈球菌、大腸桿菌、克雷伯菌的核酸，多次進行反應(yīng)，觀察它們的陰陽性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高特異高敏感檢測副溶血性弧菌TDH毒素基因的方法，其特征在于:所述外引物VPtdh-F3的序列為TGGTCAATCAGTATTCACAAC。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的高特異高敏感檢測副溶血性弧菌TDH毒素基因的方法，其特征在于:所述外引物VPtdh-B3的序列為CTTCACCAACAAAGTTAGCT。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的高特異高敏感檢測副溶血性弧菌TDH毒素基因的方法，其特征在于:所述內(nèi)引物VPtdh-FIP的序列為
CGCTGCCATTGTATAGTCTTTATCA-GTCAGGTACTAAATGGCTGA。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的高特異高敏感檢測副溶血性弧菌TDH毒素基因的方法，其特征在于:所述內(nèi)引物 VPtdh-BIP 的序列為 GTGTCTGGCTATAAGCACGGT-AGAATCATAGGAATGTTGAAGC。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的高特異高敏感檢測副溶血性弧菌TDH毒素基因的方法，其特征在于:所述反應(yīng)液中加入熒光顯示物質(zhì)溴化乙錠、鈣黃綠素進行實時檢查。
【文檔編號】C12R1/63GK103725766SQ201210385770
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2012年10月12日 優(yōu)先權(quán)日:2012年10月12日
【發(fā)明者】金京勛 申請人:蘇州四同醫(yī)藥科技有限公司