用于診斷純發(fā)-甲外胚葉發(fā)育不良的方法和組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明鑒定了與純發(fā)-甲外胚葉發(fā)育不良(pure?hair-nail?ectodermal?dysplasias，PHNED，MIM?602032)相關(guān)的致病基因，HOXC13基因。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明提供了突變的HOXC13基因及其用途，包含突變的HOXC13基因的載體、宿主細(xì)胞以及試劑盒。此外，本發(fā)明還提供了用于診斷或治療純發(fā)-甲外胚葉發(fā)育不良的方法，用于所述方法的診斷劑或治療劑，以及包含所述診斷劑或治療劑的試劑盒。
【專利說(shuō)明】用于診斷純發(fā)-甲外胚葉發(fā)育不良的方法和組合物
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子遺傳學(xué)領(lǐng)域以及疾病診斷和治療領(lǐng)域。特別地，本發(fā)明鑒定了與純發(fā)-甲外胚葉發(fā)育不良(pure hair-nail ectodermal dysplasias,PHNED,MIM 602032)相關(guān)的致病基因，H0XC13基因。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明提供了突變的H0XC13基因及其用途，包含突變的H0XC13基因的載體、宿主細(xì)胞以及試劑盒。此外，本發(fā)明還提供了用于診斷或治療純發(fā)-甲外胚葉發(fā)育不良的方法，用于所述方法的診斷劑或治療劑，以及包含所述診斷劑或治療劑的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]只累及毛發(fā)和指甲，而不伴有其他外胚葉異常的一類遺傳性外胚葉發(fā)育不良的疾病稱為純發(fā)-甲外胚葉發(fā)育不良。此類疾病的臨床表現(xiàn)主要是少毛或者無(wú)毛以及甲營(yíng)養(yǎng)不良，并且其遺傳模式可以是常染色體顯性或隱性遺傳。Naeem等人對(duì)幾個(gè)近親結(jié)婚的常染色體隱性遺傳的PHNED家系進(jìn)行了連鎖分析，將此類疾病的致病基因定位于17pl2_q21.2以及12pll.l-q21.1兩個(gè)區(qū)域。隨后他們?cè)谝粋€(gè)表現(xiàn)為先天性普禿伴二十甲營(yíng)養(yǎng)不良的巴基斯坦家系中發(fā)現(xiàn)，KRT85 (MM602767，之前也稱為hHb5)是致病基因。Shimomura等人也證實(shí)，KRT85的功能喪失突變是PHNED的致病原因。然而，在其他一些團(tuán)隊(duì)報(bào)道的PHNED中并未發(fā)現(xiàn)KRT85基因突變。此外，我們對(duì)一個(gè)中國(guó)回族五代近親結(jié)婚的家系進(jìn)行了 KRT85基因的檢測(cè)，未發(fā)現(xiàn)有意義的突變。因此，此類疾病存在臨床表現(xiàn)和遺傳的異質(zhì)性，其致病的分子機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究證實(shí)。
[0003]最近,外顯子組測(cè)序(exome sequencing)已成功地應(yīng)用于發(fā)現(xiàn)稀有單基因疾病的致病基因，如Freeman-Sheldon綜合征的MYH3基因，Schinzel-Giedion綜合征的SETBPl基因，以及嚴(yán)重大腦畸形的 TOR62 基因等(Ng SB, Turner EH, Robertson PD, et al, Targetedcapture and massively pa rallel sequencing of 12 human exomes.Nature2009, 461(7261):272-276;Hoischen A, van Bon BW, Gilissen C, et al.De novo mutations of SETBPlcause Schinzel-Giedion syndrome.Nat Genet 2010:42(6):483-5;Bilguvar K,Oz turkAK,Louvi A, et al, ffhole-exome sequencing identifies recessive WDR62 mutations insevere brain malformations.Nature2010, 467 (7312): 207-210)。外顯子組測(cè)序技術(shù)已被證明為減少稀有單基因疾病的候選基因個(gè)數(shù)甚至發(fā)現(xiàn)其致病基因的有力、有效手段。通過(guò)對(duì)很少的幾個(gè)個(gè)體(包括患者及正常對(duì)照)進(jìn)行外顯子組測(cè)序，以篩選與疾病相關(guān)的變異，其成功率大為提升。
[0004]本發(fā)明基于外顯子組測(cè)序技術(shù)鑒定了與PHNED相關(guān)的致病基因-H0XC13基因。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明提供了突變的H0XC13基因及其用途，包含突變的H0XC13基因的載體、宿主細(xì)胞以及試劑盒。此外，本發(fā)明還提供了用于診斷或治療PHNED的方法，用于所述方法的診斷劑或治療劑，以及包含所述診斷劑或治療劑的試劑盒。本發(fā)明所鑒定的PHNED致病基因，為進(jìn)一步探明該疾病的發(fā)病機(jī)制奠定了重要基礎(chǔ)，并且有可能為患者的治療方案提供全新的理論依據(jù)。同時(shí)，PHNED的致病基因的鑒定對(duì)研究毛發(fā)指甲發(fā)育生長(zhǎng)的生理過(guò)程和研究其他先天或者后天性脫發(fā)疾病有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]在本發(fā)明中，除非另有說(shuō)明，否則本文中使用的科學(xué)和技術(shù)名詞具有本領(lǐng)域技術(shù)人員所通常理解的含義。并且，本文中所用的分子遺傳學(xué)、核酸化學(xué)和分子生物學(xué)相關(guān)術(shù)語(yǔ)和實(shí)驗(yàn)室操作步驟均為相應(yīng)領(lǐng)域內(nèi)廣泛使用的術(shù)語(yǔ)和常規(guī)步驟。同時(shí)，為了更好地理解本發(fā)明，下面提供相關(guān)術(shù)語(yǔ)的定義和解釋。
[0006]如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“H0XC13基因”是指同源異形盒基因C13(H0ME0B0X C13，H0XC13，MM142976)，其屬于轉(zhuǎn)錄因子的同源異形盒家族。H0XC13基因含有2個(gè)外顯子，其示例性cDNA序列如SEQ ID NO:1所示。如本文中所使用的，H0XC13基因的第N個(gè)外顯子被簡(jiǎn)稱為外顯子N (N為1-2的整數(shù))。
[0007]如本文中所使用的，當(dāng)用具體的序列來(lái)描述基因或核酸時(shí)，其不僅包括該具體序列所代表的基因或核酸，而且包括該具體序列的互補(bǔ)序列所代表的基因或核酸。在本申請(qǐng)中，雖然為了方便起見，在多數(shù)情況下針對(duì)基因或核酸只給出了一條鏈的序列，然而本領(lǐng)域技術(shù)人員可以明確獲知其互補(bǔ)鏈 的序列。因此，本申請(qǐng)事實(shí)上也公開了所述互補(bǔ)鏈的序列。
[0008]例如，當(dāng)提及H0XC13基因的cDNA序列時(shí)，其不僅包括cDNA的實(shí)際序列，而且包括所述實(shí)際序列的互補(bǔ)序列。又如，當(dāng)提及SEQ ID NO:1時(shí)，其不僅包括SEQ ID NO:1所示的序列，而且包括SEQ ID NO:1的互補(bǔ)序列。
[0009]本申請(qǐng)中的核酸序列包括DNA形式和RNA形式。除非上下文特別指明，否則本發(fā)明的核酸序列不僅包括DNA形式，而且包括RNA形式。例如，當(dāng)提及SEQ ID NO:1時(shí)，其不僅包括DNA形式(例如，cDNA序列),而且包括RNA形式(例如，mRNA序列)。
[0010]如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“突變”，當(dāng)用于描述基因或DNA時(shí)，是指基因序列或DNA序列中一個(gè)或多個(gè)(例如，幾個(gè))堿基的添加、缺失和/或置換；當(dāng)用于描述蛋白質(zhì)時(shí)，是指蛋白質(zhì)氨基酸序列中一個(gè)或多個(gè)(例如，幾個(gè))氨基酸殘基的添加、缺失和/或置換。
[0011]如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“沉默突變”是指這樣的基因突變，其引起mRNA中的密碼子發(fā)生改變，但由于密碼子的簡(jiǎn)并性而未引起編碼的氨基酸發(fā)生改變。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“非沉默突變”是指除了沉默突變以外的基因突變，包括但不限于，錯(cuò)義突變、無(wú)義突變和移碼突變等。
[0012]如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“功能喪失性突變”是指這樣的突變，其導(dǎo)致突變基因所編碼的蛋白喪失了其生物學(xué)功能。
[0013]如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“雜合突變”是指這樣的突變，其僅存在于一對(duì)等位基因中的一個(gè)基因中。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“純合突變”是指這樣的突變，其在一對(duì)等位基因中的兩個(gè)基因中同時(shí)存在。
[0014]如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“c.390”是指cDNA序列的第390位堿基(以起始密碼子ATG的堿基A為第I位堿基)，其中“c.”表示cDNA，數(shù)字“390”表示第390位堿基。本文中所使用的其他類似的術(shù)語(yǔ)具有類似的含義。
[0015]如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“P.130”是指蛋白質(zhì)序列的第130位氨基酸殘基，其中“P.”表達(dá)蛋白質(zhì)，數(shù)字“130”表示第130位氨基酸殘基。本文中所使用的其他類似的術(shù)語(yǔ)具有類似的含義。[0016]如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“c.390C — A”是指cDNA序列的第390位堿基(以起始密碼子ATG的堿基A為第I位堿基)由C突變?yōu)锳。本文中所使用的其他類似的術(shù)語(yǔ)具有類似的含義。
[0017]如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“p.Tyrl30*”是指蛋白質(zhì)序列的第130位氨基酸殘基由Tyr突變?yōu)榻K止密碼子(*)。本文中所使用的其他類似的術(shù)語(yǔ)具有類似的含義。
[0018]如本文中所使用的，氨基酸通常用本領(lǐng)域公知的單字母和三字母縮寫來(lái)表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表示。另外，還用“ ”表示終止密碼子。
[0019]如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“載體(vector)”是指，可將多聚核苷酸插入其中的一種核酸運(yùn)載工具。當(dāng)載體能使插入的多核苷酸編碼的蛋白獲得表達(dá)時(shí)，載體稱為表達(dá)載體。此類載體可以通過(guò)轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)導(dǎo)或者轉(zhuǎn)染導(dǎo)入宿主細(xì)胞，使其攜帶的遺傳物質(zhì)元件在宿主細(xì)胞中獲得表達(dá)。載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，包括但不限于:質(zhì)粒；噬菌體；柯斯質(zhì)粒等等。[0020]載體中可包含與目的基因可操作地連接的表達(dá)控制序列。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“可操作地連接”是指所連接的分子的連接方式使得能夠?qū)崿F(xiàn)預(yù)期的功能。例如，表達(dá)控制序列與基因編碼序列的可操作的連接可實(shí)現(xiàn)表達(dá)控制序列對(duì)基因編碼序列的表達(dá)的控制作用。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“表達(dá)控制序列”是實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)所需要的控制序列，其是本領(lǐng)域熟知的。表達(dá)控制序列通常必須包括啟動(dòng)子，常常也包括轉(zhuǎn)錄終止序列，并且還可以包含其他序列，如增強(qiáng)子序列。基因表達(dá)對(duì)于siRNA、miRNA等而言是指轉(zhuǎn)錄，并且還可以包括轉(zhuǎn)錄后加工；對(duì)于蛋白質(zhì)編碼序列而言通常是指轉(zhuǎn)錄和翻譯，產(chǎn)生蛋白質(zhì)。
[0021]另外，載體中還可包含選擇標(biāo)記。此類選擇標(biāo)記是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的,例如但不限于抗生素抗性基因，例如青霉素抗性基因、紅霉素抗性基因等等。
[0022]如本文中所使用的，“PCR引物”指用于在PCR反應(yīng)中擴(kuò)增靶標(biāo)核酸的多核苷酸片段，其通常為寡核苷酸，例如含有至少5個(gè)堿基，例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50個(gè)或者更多個(gè)堿基的多核苷酸片段。
[0023]本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，引物不必與待擴(kuò)增的目的基因或其互補(bǔ)鏈完全互補(bǔ)，只要其能夠特異性擴(kuò)增目的基因。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“特異性擴(kuò)增”是指弓丨物能夠通過(guò)PCR反應(yīng)擴(kuò)增目的基因，而不擴(kuò)增其他基因。例如，特異性擴(kuò)增H0XC13基因是指，在PCR反應(yīng)中引物只擴(kuò)增H0XC13基因，而不擴(kuò)增其他基因。此類引物的設(shè)計(jì)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，參見例如，Sambrook等人，Molecular Cloning: ALaboratory Manual,第 2 版，Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989);和 Ausubel 等人,CurrentProtocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992)。
[0024]通常，引物與待擴(kuò)增的目的基因或其互補(bǔ)鏈具有大體上的同一性，從而能夠特異性擴(kuò)增目的基因。例如，引物與待擴(kuò)增的目的基因或其互補(bǔ)鏈具有至少60%的序列同一性,例如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一'I"生。
[0025]如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“同一性”用于指兩個(gè)多肽之間或兩個(gè)核酸之間序列的匹配情況。當(dāng)兩個(gè)進(jìn)行比較的序列中的某個(gè)位置都被相同的堿基或氨基酸單體亞單元占據(jù)時(shí)(例如，兩個(gè)DNA分子的每一個(gè)中的某個(gè)位置都被腺嘌呤占據(jù)，或兩個(gè)多肽的每一個(gè)中的某個(gè)位置都被賴氨酸占據(jù))，那么各分子在該位置上是同一的。兩個(gè)序列之間的“百分?jǐn)?shù)同一性”是由這兩個(gè)序列共有的匹配位置數(shù)目除以進(jìn)行比較的位置數(shù)目XlOO的函數(shù)。例如，如果兩個(gè)序列的10個(gè)位置中有6個(gè)匹配，那么這兩個(gè)序列具有60%的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50%的同一性(總共6個(gè)位置中有3個(gè)位置匹配)。通常，在將兩個(gè)序列比對(duì)以產(chǎn)生最大同一性時(shí)進(jìn)行比較。這樣的比對(duì)可通過(guò)使用，例如，可通過(guò)計(jì)算機(jī)程序例如 Align 程序(DNAstar，Inc.)方便地進(jìn)行的 Needleman 等人(1970) J.Mol.Biol.48:443-453的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。[0026]如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“雜交”是指相互間具有互補(bǔ)序列的兩個(gè)單鏈核酸分子在一定條件下(適宜的溫度及離子強(qiáng)度等)按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則退火形成雙鏈核酸的過(guò)程。核酸雜交可以在DNA-DNA之間，也可在DNA-RNA或RNA-RNA之間進(jìn)行，只要它們之間存在互補(bǔ)序列，可以進(jìn)行堿基配對(duì)。一般而言，雜交的雙方是待測(cè)核酸分子和已知核酸分子。在雜交體系中已知的核酸分子稱作探針(probe)。核酸雜交包括固-液相雜交和液相雜交。液相雜交是在溶液中進(jìn)行的雜交反應(yīng)，其是指待測(cè)核酸分子與已知核酸分子(探針)在溶液中退火形成雜交復(fù)合物。
[0027]如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“特異性檢測(cè)H0XC13基因突變”是指探針能夠區(qū)分出含有突變的H0XC13基因與不含有突變的H0XC13基因。一般而言，可以通過(guò)控制雜交條件的嚴(yán)緊性，使得探針能夠區(qū)分出含有突變的基因與不含有突變的基因。例如，在高度嚴(yán)緊條件下，與H0XC13基因精確互補(bǔ)的探針可以與不含有突變的H0XC13基因雜交，而不與甚至只包含一個(gè)點(diǎn)突變的突變的H0XC13基因雜交，從而將二者區(qū)分開。同樣，還可以設(shè)計(jì)與突變的H0XC13基因精確互補(bǔ)的探針，從而其在高度嚴(yán)緊條件下與突變的H0XC13基因雜交，而不與不含有突變的H0XC13基因雜交。
[0028]在分子生物學(xué)領(lǐng)域中，探針的設(shè)計(jì)和雜交技術(shù)是熟知的，參見例如Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第 2版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989);和 Ausubel 等人，Current Protocols inMolecular Biology, Greene Publishing Associates (1992)。為了舉例說(shuō)明的目的，雜交的條件可以是嚴(yán)緊條件，例如與濾膜結(jié)合的DNA在6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中約45°C下雜交，之后在0.2XSSC/0.1%SDS中于約50 — 65°C下進(jìn)行一次或多次洗滌；高度嚴(yán)緊條件，例如與濾膜結(jié)合的核酸在6XSSC中約45°C下雜交，之后在0.1XSSC/0.2%SDS中于約68°C下進(jìn)行一次或多次洗滌；或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它嚴(yán)緊雜交條件。
[0029]通常，探針是經(jīng)標(biāo)記的，從而在雜交反應(yīng)結(jié)束后，通過(guò)利用探針上的標(biāo)記物，可以分離和檢測(cè)雜交后的雙鏈。同樣，也可以對(duì)引物進(jìn)行標(biāo)記，從而在PCR后，通過(guò)利用引物上的標(biāo)記物，可以分離和檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物?？捎糜跇?biāo)記探針和引物的標(biāo)記物在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的，包括但不限于，放射性同位素如1251、酶、酶的底物、發(fā)光物質(zhì)如異魯米諾和吖啶酯、熒光物質(zhì)如熒光素和羅丹明、生物素和有色物質(zhì)如乳膠顆粒和膠體金等。標(biāo)記用的酶可以是過(guò)氧化物酶(如辣根過(guò)氧化物酶HRP)、堿性磷酸酶、β半乳糖苷酶和葡萄糖氧化酶。對(duì)于這些反應(yīng)中合適的底物有2，2’ -連氮基-雙(3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸)、魯米諾-過(guò)氧化氫、鄰苯二胺-過(guò)氧化氫(針對(duì)過(guò)氧化物酶)、對(duì)硝基苯磷酸鹽、4-甲基磷酸傘型酮、3-(2’-螺旋金剛燒)-4-甲氧基-4-(3〃-憐酸基)苯基-1，2-二乙氧基燒(針對(duì)喊性憐酸酶)、對(duì)硝基苯-β-D-半乳糖和甲基傘形酮-β-D-半乳糖(針對(duì)β半乳糖苷酶)。其它的標(biāo)記包括量子點(diǎn)標(biāo)記、生色團(tuán)標(biāo)記、酶標(biāo)記、親和配體標(biāo)記、電磁自旋標(biāo)記、重原子標(biāo)記、標(biāo)記有納米微粒光散射標(biāo)記或其它納米微粒的探針、異硫氰酸熒光素(FITC)、TRITC、羅丹明、四甲基羅丹明、R-藻紅蛋白、Cy-3、Cy-5、Cy_7、得克薩斯紅、Phar-Red、異藻紅蛋白(APC)、以及酶標(biāo)記如堿性磷酸酶、辣根過(guò)氧化物酶、I2-半乳糖苷酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰膽堿酯酶和半抗原偶聯(lián)物如洋地黃毒苷或二硝基苯酚、或能夠形成配合物的結(jié)合配對(duì)如鏈霉抗生物素蛋白/生物素、抗生物素蛋白/生物素或抗原/抗體配合物如包括兔IgG和抗-兔I gG;突光基團(tuán)如傘形三糖(umbelliferone)、突光素、異硫氰酸突光素、羅丹明、四甲基羅丹明、伊紅、綠熒光蛋白、藻紅、香豆素、甲基香豆素、芘、孔雀綠、二苯乙烯、熒光黃、Cascade藍(lán)、二氯三嗪基熒光素、丹磺酰氯、藻紅蛋白、熒光鑭系絡(luò)合物如包括銪和鋪、Cy3、Cy5、分子信標(biāo)(molecular beacons)和其突光衍生物、發(fā)光材料如魯米諾；光散射或細(xì)胞質(zhì)基因組共振材料如金或銀顆?；蛄孔影?quantum dot):或放射性材料如14C、1231、1241、1311、Tc99m、35S或3H ;或球珠(spherical shell),以及標(biāo)記有本領(lǐng)域已知的任何其它信號(hào)產(chǎn)生標(biāo)記物的探針。例如，可檢測(cè)的分子包括但不限于熒光基團(tuán)以及前面所述其它已知的，如在 Joseph R.Lakowicz (Editor)所編的 Principles of FluorescenceSpectroscopy, Plenum Pub Corp,第二版(July 1999)和 Richard P.Hoagland 的第六版的Molecular Probes Handbook所描述的。在某些實(shí)施方式中，標(biāo)記物包括半導(dǎo)體納米微晶如量子斑(即 Qdots),參見 U.S.P6, 207，392。Qdots 可從 Quantum Dot Corporation 購(gòu)得。用于本發(fā)明的半導(dǎo)體納米微晶包括Group I1-V半導(dǎo)體的納米微晶如MgS、MgSe、MgTe、CaS、CaSe, CaTe, SrS, SrSe, SrTe, BaS, BaSe、BaTe、ZnS, ZnSe, ZnTe, CdS, CdSe, CdTe, HgS,HgSe, HgTe和其混合物以及Group II1-V半導(dǎo)體的納米微晶如GaAs、InGaAs, InP、InAs和其混合物。Group IV半導(dǎo)體如鍺或硅的使用，或有機(jī)半導(dǎo)體的使用，在某些條件下可能是方便可行的。半導(dǎo)體納米微晶也可以包括合金，其含有兩種或多種選自于Group II1-V化合物、Group I1-VI化合物、Group IV元素和其組合物的半導(dǎo)體。根據(jù)使用的標(biāo)記物,相應(yīng)的核酸分離和檢測(cè)方法在本領(lǐng)域內(nèi)也是已知的。參見例如，Henegariu O等人，(1999).uCustomfluorescent-nucleotide synthesis as an alternative method for nucleicacid labeling”，Nature Biotechnology 18:345-348 ;EzakiT 等，1989.FluorometricDeoxyribonucleic Acid-Deoxyribonucleic Acid Hybridization in MicrodilutionWellsas an Alternative to Membrane Filter Hybridization in which RadioisotopesAre Used To Determine Genetic Relatedness among Bacterial Strains.1nt.J.0fSystemic Bacteriology29 (3): 224-229 ;和 Herrington C 等人，1998.PCR3:PCR in situhybridization:a practical approach, Volume3.0xford:Oxford University Press。
[0030]如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的載體和/或賦形劑”是指在藥理學(xué)和/或生理學(xué)上與受試者和活性成分相容的載體和/或賦形劑，其是本領(lǐng)域公知的(參見例如 Remington’s Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR, 19thed.Pennsylvania:Mack Publishing Company, 1995),并且包括但不限于:pH 調(diào)節(jié)劑，表面活性劑，佐劑，離子強(qiáng)度增強(qiáng)劑。例如，pH調(diào)節(jié)劑包括但不限于磷酸鹽緩沖液；表面活性劑包括但不限于陽(yáng)離子，陰離子或者非離子型表面活性劑，例如Tween-80 ;離子強(qiáng)度增強(qiáng)劑包括但不限于氯化鈉。
[0031]如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“有效量”是指足以獲得或至少部分獲得期望的效果的量。例如，預(yù)防疾病(例如PHNED )有效量是指，足以預(yù)防，阻止，或延遲疾病(例如PHNED )的發(fā)生的量；治療疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并發(fā)癥的量。測(cè)定這樣的有效量完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)。例如，對(duì)于治療用途有效的量將取決于待治療的疾病的嚴(yán)重度、患者自己的免疫系統(tǒng)的總體狀態(tài)、患者的一般情況例如年齡，體重和性別，藥物的施用方式，以及同時(shí)施用的其他治療等等。
[0032]本發(fā)明至少部分基于發(fā)明人的發(fā)現(xiàn):H0XC13基因的突變或表達(dá)水平的降低可導(dǎo)致PHNED。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明提供了突變的H0XC13基因及其用途，包含突變的H0XC13基因的載體、宿主細(xì)胞以及試劑盒。
[0033]此外，本發(fā)明還提供了用于診斷或治療PHNED的方法，用于所述方法的診斷劑或治療劑，以及包含所述診斷劑或治療劑的試劑盒。
[0034]因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了突變的H0XC13基因，其與SEQ ID N0:1相比具有至少I個(gè)非沉默突變，并且所述突變的H0XC13基因編碼功能喪失的蛋白或?qū)е翽HNED的發(fā)生。
[0035]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述非沉默突變選自添加，缺失和置換中的一種或多種。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述非沉默突變位于H0XC13基因的外顯子區(qū)域。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述非沉默突變位于H0XC13基因的第I個(gè)外顯子。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述非沉默突變位于:c.390。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述非沉默突變是:c.390C — A0
[0036]在另一個(gè)方面，本 發(fā)明提供了包含上述突變的H0XC13基因的載體。
[0037]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述載體包括但不限于克隆載體和表達(dá)載體。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述載體是例如質(zhì)粒，粘粒，噬菌體，柯斯質(zhì)粒等等。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述載體是商購(gòu)可得的。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述載體包含與上述突變的H0XC13基因可操作地連接的表達(dá)控制序列，例如但不限于啟動(dòng)子，增強(qiáng)子和終止子。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述載體任選地還包含選擇標(biāo)記。
[0038]在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含上述突變的H0XC13基因和/或載體的宿主細(xì)胞。此類宿主細(xì)胞包括但不限于，原核細(xì)胞例如大腸桿菌細(xì)胞，以及真核細(xì)胞例如酵母細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞，植物細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞(如哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如小鼠細(xì)胞、人細(xì)胞等)。本發(fā)明的宿主細(xì)胞還可以是細(xì)胞系，例如293T細(xì)胞。
[0039]本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，可將致病基因用于產(chǎn)生疾病動(dòng)物模型和/或用作藥物靶點(diǎn)，從而研究疾病的發(fā)病機(jī)制和開發(fā)有效治療疾病的藥物。因此，在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了上述突變的H0XC13基因的用途，其用于產(chǎn)生PHNED動(dòng)物模型，或用作藥物靶點(diǎn)，或用于制備試劑盒，所述試劑盒用于產(chǎn)生PHNED動(dòng)物模型，或用作藥物靶點(diǎn)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述動(dòng)物包括但不限于，哺乳動(dòng)物，例如小鼠，大鼠，兔和猴。
[0040]在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了上述載體或宿主細(xì)胞的用途，其用于產(chǎn)生PHNED動(dòng)物模型，或用于制備試劑盒，所述試劑盒用于產(chǎn)生PHNED動(dòng)物模型。
[0041]在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了試劑盒，其包含上述突變的H0XC13基因和/或載體和/或宿主細(xì)胞。
[0042]在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于診斷PHNED的診斷劑，其包含能夠特異性擴(kuò)增HOXC13基因的引物，或能夠特異性檢測(cè)H0XC13基因突變的探針。
[0043]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述引物能夠特異性擴(kuò)增H0XC13基因的外顯子，優(yōu)選第I個(gè)外顯子。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述引物的序列選自SEQ ID N0:3、4、5和6。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述引物是如SEQ ID N0:3和4所示的引物對(duì)，或如SEQ ID NO:5和6所示的引物對(duì)。
[0044]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述突變位于H0XC13基因的外顯子，優(yōu)選第I個(gè)外顯子，更優(yōu)選地位于:c.390。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述突變是c.390C — A0
[0045]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述引物或探針是經(jīng)標(biāo)記的。
[0046]在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了試劑盒，其包含上文所述的診斷劑。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述試劑盒還包含其他試劑，例如用于PCR的試劑(例如dNTP和聚合酶)，用于提取核酸的試劑等。
[0047]在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于治療PHNED的治療劑，其包含分離的正常的H0XC13基因，或含有所述基因的載體，或具有正常生物學(xué)功能的H0XC13蛋白。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“正常的H0XC13基因”是指編碼具有正常生物學(xué)功能的H0XC13蛋白的H0XC13基因，其例如但不限于，如SEQ ID N0:1所示的H0XC13基因。
[0048]在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，其包含上文所述的治療劑，和藥學(xué)上可接受的載體和/或賦形劑。
[0049]在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了診斷受試者是否患有PHNED或處于發(fā)展PHNED的風(fēng)險(xiǎn)中的方法，其包括，檢測(cè)受試者的H0XC13基因是否存在非沉默突變，如果存在所述非沉默突變，則判斷受試者患有PHNED或處于發(fā)展PHNED的風(fēng)險(xiǎn)中。
[0050]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述非沉默突變選自添加，缺失和置換中的一種或多種。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中， 所述非沉默突變位于H0XC13基因的外顯子區(qū)域。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述非沉默突變位于H0XC13基因的第I個(gè)外顯子。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述非沉默突變位于c.390。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述非沉默突變是c.390C — A0
[0051]在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了診斷受試者是否患有PHNED或處于發(fā)展PHNED的風(fēng)險(xiǎn)中的方法，其包括:
[0052]I)獲得來(lái)自所述受試者的核酸樣品(例如，基因組DNA樣品或總mRNA樣品)；
[0053]2)在所述核酸樣品中確定H0XC13基因中是否存在導(dǎo)致H0XC13基因編碼功能喪失的蛋白的非沉默突變；和
[0054]3)如果存在所述非沉默突變，則判斷受試者患有PHNED或處于發(fā)展PHNED的風(fēng)險(xiǎn)中。
[0055]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述非沉默突變選自添加，缺失和置換中的一種或多種。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述非沉默突變位于H0XC13基因的外顯子區(qū)域。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述非沉默突變位于H0XC13基因的第I個(gè)外顯子。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述非沉默突變位于c.390。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述非沉默突變是c.390C — A0
[0056]在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了檢測(cè)H0XC13基因的突變的方法，其包括使用上文所述的診斷劑。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述方法不是診斷方法。例如，所述方法可以用于研究目的。
[0057]在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了治療受試者的PHNED的方法，其包括給有此需要的受試者施用有效量的上文所述的治療劑。
[0058]在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了上文所述的診斷劑在制備用于檢測(cè)H0XC13基因的突變和/或用于診斷PHNED的試劑盒中的用途。
[0059]在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了上文所述的治療劑在制備用于治療PHNED的藥物組合物中的用途。
[0060]在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了診斷受試者是否患有PHNED或處于發(fā)展PHNED的風(fēng)險(xiǎn)中的方法，其包括，測(cè)量H0XC13基因在來(lái)自受試者的測(cè)試樣品(例如皮膚樣品)中的表達(dá)水平，其中，與對(duì)照樣品(例如來(lái)自正常人的樣品)中的表達(dá)水平相比，H0XC13基因在測(cè)試樣品中的表達(dá)水平的下降指示，受試者患有PHNED或處于發(fā)展PHNED的風(fēng)險(xiǎn)中。
[0061]在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于測(cè)量H0XC13基因的表達(dá)水平的試劑(例如本發(fā)明的引物和/或探針和/或抗體)在制備診斷劑中的用途，所述診斷劑通過(guò)下列來(lái)診斷受試者是否患有PHNED或處于發(fā)展PHNED的風(fēng)險(xiǎn)中:測(cè)量H0XC13基因在來(lái)自受試者的測(cè)試樣品(例如皮膚樣品沖的表達(dá)水平，其中，與對(duì)照樣品(例如來(lái)自正常人的樣品沖的表達(dá)水平相t匕，H0XC13基因在測(cè)試樣品中的表達(dá)水平的下降指示，受試者患有PHNED或處于發(fā)展PHNED的風(fēng)險(xiǎn)中。一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述試劑是能特異性擴(kuò)增H0XC13基因的引物，和/或能與H0XC13基因特異性雜交的探針，和/或能特異性識(shí)別H0XC13蛋白的抗體。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述引物的序列選自SEQ ID N0:3、4、5、6、7和8。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述引物是如SEQ ID N0:3和4所示的引物對(duì)，或如SEQ ID N0:5和6所示的引物對(duì)，或如SEQ ID N0:7和8所示的引物對(duì)。
[0062]在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于診斷受試者是否患有PHNED或處于發(fā)展PHNED的風(fēng)險(xiǎn)中的診斷劑，其包含能特異性擴(kuò)增H0XC13基因的引物，和/或能與H0XC13基因特異性雜交的探針，和/或能特異性識(shí)`別H0XC13蛋白的抗體。
[0063]本發(fā)明的試劑、試劑組合物、藥物組合物或試劑盒中可進(jìn)一步包含與活性成分相容的緩沖液、載體或媒介等，例如選自下列的一種或多種:水、生理鹽水、磷酸緩沖液、左旋糖、甘油、乙醇和其他類似物，以及上述物質(zhì)的組合。此類緩沖液、載體或媒介可進(jìn)一步包括微量輔助物質(zhì)，例如濕潤(rùn)劑、乳化劑、表面活性劑、防腐劑或助懸劑等。
[0064]發(fā)明的有益效果
[0065]本發(fā)明通過(guò)外顯子組測(cè)序技術(shù)確定了 PHNED的致病基因，這至少帶來(lái)了以下有益效果。
[0066]一方面，本發(fā)明為PHNED的診斷和治療提供了新的方法和工具。特別地，本發(fā)明所提供的診斷方法以及用于該方法的引物和/或探針可用于快速、有效地確定受試者是否患有PHNED或處于發(fā)展PHNED的風(fēng)險(xiǎn)中。
[0067]另一方面，本發(fā)明為PHNED的發(fā)病機(jī)制研究奠定了重要基礎(chǔ)，為PHNED患者的治療提供全新的理論依據(jù)。特別地，PHNED的致病基因的鑒定對(duì)研究毛發(fā)指甲發(fā)育生長(zhǎng)的生理過(guò)程和研究其他先天或者后天性脫發(fā)疾病有重要意義。此外，利用PHNED致病基因所獲得的疾病動(dòng)物模型是研究PHNED的發(fā)病機(jī)制和治療方法的有力工具。
[0068]下面將結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，下列附圖和實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不是對(duì)本發(fā)明的范圍的限定。根據(jù)附圖和優(yōu)選實(shí)施方案的下列詳細(xì)描述，本發(fā)明的各種目的和有利方面對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)將變得顯然。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0069]圖1展示了實(shí)施例1中所使用的PHNED家系的家系圖譜。其中，d表示正常女性；[:]表示正常男性；.表示男性攜帶者；.，表示女性攜帶者_(dá)表示男性患者；?表示女性患者。
[0070]圖2示例性顯示了患者、攜帶者和正常人的H0XC13基因的測(cè)序結(jié)果，其中患者具有純合的c.390C — A (p.Tyrl30*)突變，攜帶者具有雜合的c.390C — A (p.Tyrl30*)突變，而正常人不具有該突變。
[0071]圖3A示例性顯示了患者、攜帶者和正常人的H0XC13基因的測(cè)序結(jié)果。圖3B顯示了通過(guò)RT-PCR法來(lái)檢測(cè)H0XC13基因在正常人和患者(個(gè)體V2)皮膚中的表達(dá)水平的結(jié)果。圖3C顯示了通過(guò)探針法(RNA印跡法)來(lái)檢測(cè)H0XC13基因在正常人和患者(個(gè)體V2)皮膚中的表達(dá)水平的結(jié)果。
[0072]序列信息[0073]本發(fā)明涉及的序列的信息提供于下面的表1中。
[0074]
【權(quán)利要求】
1.突變的H0XC13基因，其與SEQID NO:1相比具有至少I個(gè)非沉默突變，并且所述突變的H0XC13基因編碼功能喪失的蛋白或?qū)е翽HNED的發(fā)生； 例如，所述非沉默突變選自添加，缺失和置換中的一種或多種； 例如，所述非沉默突變位于H0XC13基因的外顯子區(qū)域； 例如，所述非沉默突變位于H0XC13基因的第I個(gè)外顯子； 例如，所述非沉默突變位于:c.390 ； 例如，所述非沉默突變是:c.390C — A。
2.一種載體，其包含權(quán)利要求1的突變的HOXC13基因； 例如，所述載體選自克隆載體和表達(dá)載體； 例如，所述載體還包含與所述突變的HOXC13基因可操作地連接的表達(dá)控制序列，例如但不限于啟動(dòng)子，增強(qiáng)子和終止子； 例如，所述載體還包含選擇標(biāo)記。
3.一種宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求1的突變的HOXC13基因或權(quán)利要求2的載體。
4.權(quán)利要求2的載體或權(quán)利要求3的宿主細(xì)胞的用途，其用于產(chǎn)生PHNED動(dòng)物模型，或用于制備試劑盒，所述試劑盒用于產(chǎn)生PHNED動(dòng)物模型。
5.診斷受試者是否患有PHNED或處于發(fā)展PHNED的風(fēng)險(xiǎn)中的方法，其包括，` 1)獲得來(lái)自所述受試者的核酸樣品(例如，基因組DNA樣品或總mRNA樣品)； 2)在所述核酸樣品中確定HOXC13基因中是否存在導(dǎo)致HOXC13基因編碼功能喪失的蛋白的非沉默突變；和 3)如果存在所述非沉默突變，則判斷受試者患有PHNED或處于發(fā)展PHNED的風(fēng)險(xiǎn)中； 例如，所述非沉默突變選自添加，缺失和置換中的一種或多種； 例如，所述非沉默突變位于HOXC13基因的外顯子區(qū)域； 例如，所述非沉默突變位于HOXC13基因的第I個(gè)外顯子； 例如，所述非沉默突變位于:c.390 ； 例如，所述非沉默突變是:c.390C — A。
6.用于診斷PHNED的診斷劑，其包含能夠特異性擴(kuò)增HOXC13基因的引物，或能夠特異性檢測(cè)HOXC13基因突變的探針； 例如，所述引物能夠特異性擴(kuò)增HOXC13基因的外顯子，優(yōu)選第I個(gè)外顯子； 例如，所述引物的序列選自SEQ ID NO:3、4、5和6; 例如，所述引物是如SEQ ID NO:3和4所示的引物對(duì)，或如SEQ ID NO:5和6所示的引物對(duì)； 例如，所述突變位于HOXC13基因的外顯子，優(yōu)選第I個(gè)外顯子，更優(yōu)選地位于:c.390 ； 例如，所述突變是c.390C — A ； 例如，所述引物或探針是經(jīng)標(biāo)記的。
7.一種試劑盒，其包含權(quán)利要求6的診斷劑； 優(yōu)選地，所述試劑盒還包含其他試劑，例如用于PCR的試劑(例如dNTP和聚合酶)，用于提取核酸的試劑。
8.權(quán)利要求6的診斷劑在制備用于檢測(cè)HOXC13基因的突變和/或用于診斷PHNED的試劑盒中的用途。
9.用于測(cè)量H0XC13基因的表達(dá)水平的試劑(例如，引物和/或探針和/或抗體)在制備診斷劑中的用途，所述診斷劑通過(guò)下列來(lái)診斷受試者是否患有PHNED或處于發(fā)展PHNED的風(fēng)險(xiǎn)中:測(cè)量H0XC13基因在來(lái)自受試者的測(cè)試樣品(例如皮膚樣品)中的表達(dá)水平，其中，與對(duì)照樣品(例如來(lái)自正常人的樣品)中的表達(dá)水平相比，H0XC13基因在測(cè)試樣品中的表達(dá)水平的下降指示，受試者患有PHNED或處于發(fā)展PHNED的風(fēng)險(xiǎn)中； 例如，所述試劑是能特異性擴(kuò)增H0XC13基因的引物，和/或能與H0XC13基因特異性雜交的探針，和/或能特異性識(shí)別H0XC13蛋白的抗體； 例如，所述引物的序列選自SEQ ID N0:3、4、5、6、7和8 ; 例如，所述引物是如SEQ ID N0:3和4所示的引物對(duì)，或如SEQ ID N0:5和6所示的引物對(duì)，或如SEQ ID NO: 7和8所示的引物對(duì)。
10.用于診斷受試者是否患有PHNED或處于發(fā)展PHNED的風(fēng)險(xiǎn)中的診斷劑，其包含能特異性擴(kuò)增HOXC13基因的引物，和/或能與HOXC13基因特異性雜交的探針，和/或能特異性識(shí)別HOXC13蛋 白的抗體。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103525821SQ201210230242
【公開日】2014年1月22日 申請(qǐng)日期:2012年7月5日 優(yōu)先權(quán)日:2012年7月5日
【發(fā)明者】劉軒竹, 戴蘭蘭, 管李萍, 楊勇, 林志淼, 陳荃, 王俊, 汪建, 楊煥明 申請(qǐng)人:深圳華大基因科技有限公司