專利名稱：利用aflp指紋技術(shù)鑒定中國(guó)對(duì)蝦種群的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于水產(chǎn)生物種群鑒定分子檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及ー種利用AFLP指紋技術(shù)鑒定中國(guó)對(duì)蝦種群方法。
背景技術(shù)：
AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism,擴(kuò)增長(zhǎng)度多態(tài)性)是在 RFLP和RAPD技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)明的一種新的DNA分子標(biāo)記技木。其基本原理是先利用限制性內(nèi)切酶將基因組DNA酶切，產(chǎn)生不同大小的DNA片段后，將其用雙鏈人工接頭相連接，再以人工接頭的互補(bǔ)鏈為引物進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，選擇性擴(kuò)增所用引物是在接頭互補(bǔ)鏈的基礎(chǔ)上添加1-3個(gè)選擇性核苷酸，對(duì)預(yù)擴(kuò)增模板DNA進(jìn)行選擇性擴(kuò)增之后，根據(jù)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度的不同，檢測(cè)選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性。AFLP分子標(biāo)記技術(shù)自開始應(yīng)用以來，發(fā)展十分迅速，近幾年已經(jīng) 在海洋生物遺傳學(xué)研究以及在對(duì)海洋生物養(yǎng)殖群體和野生群體的種質(zhì)資源評(píng)估等方面得到了廣泛的應(yīng)用。同時(shí)，用AFLP方法得到的指紋圖譜具有穩(wěn)定、可靠且多態(tài)性豐富等優(yōu)點(diǎn)，非常適合于種群的鑒定。中國(guó)對(duì)奸(Fenneropenaeus chinensis)是我國(guó)黃、渤海的主要經(jīng)濟(jì)奸類。由于中國(guó)對(duì)蝦野生資源的急劇減少，從1986年開始，我國(guó)毎年在渤海、黃海北部和山東半島南部進(jìn)行人工培育苗種的放流，年放流規(guī)模達(dá)10億尾以上。但由于中國(guó)對(duì)蝦的長(zhǎng)距離洄游習(xí)性，不同地點(diǎn)放流的個(gè)體會(huì)在越冬場(chǎng)形成混合種群。因此，明確混合種群中中國(guó)對(duì)蝦來源對(duì)于漁業(yè)資源的管理與保護(hù)十分重要。但目前還沒有一種有效的鑒定中國(guó)對(duì)蝦種群歸屬的分子鑒定方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供ー種利用AFLP指紋技術(shù)鑒定中國(guó)對(duì)蝦種群方法，從而彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足。本發(fā)明的ー個(gè)方面是提供一個(gè)用于鑒定中國(guó)對(duì)蝦種群的引物組，包括有四對(duì)引物，每對(duì)引物的正向引物、反向引物的序列分別為SEQ ID NO :1和SEQID NO :2、SEQ ID NO:
I和 SEQ ID NO :3、SEQ ID NO 4 和 SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 6 和 SEQ ID NO :7。本發(fā)明的引物組用于對(duì)中國(guó)對(duì)蝦種群進(jìn)行遺傳鑒定，包括有如下的步驟I)樣品基因組DNA的提??；2)酶切反應(yīng)；用EcoR I和Mse I對(duì)I)中的DNA進(jìn)行酶切3)連接反應(yīng)將2)中獲得的酶切產(chǎn)物連接上EcoR I接頭和Mse I接頭；4)預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)用EcoR I preprimer和Mse I preprimer對(duì)3)中獲得的連接產(chǎn)物進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增；5)選擇性擴(kuò)增將預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋后，分別用SEQ ID NO 1和SEQ ID NO :2、SEQID NO :1 和 SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4 和 SEQ ID NO :5、SEQ IDNO :6 和 SEQ ID NO :7 的引物對(duì)進(jìn)行擴(kuò)增；且序列為SEQ ID NO :1、SEQ IDNO :4、SEQ ID NO 6的引物的5'用FAM熒光標(biāo)記；
6)結(jié)果分析將步驟5)的擴(kuò)增產(chǎn)物用ABI3730條帶分型，讀取結(jié)果后進(jìn)行種群分析。上述的EcoR I preprimer 和 Mse I preprimer 的核苷酸序列分別為 SEQ ID NO:8、SEQ ID NO 9o通過本發(fā)明篩選出的引物組合，可以確定自然海域中國(guó)對(duì)蝦種群的來源和歸屬地，有利于界定不同產(chǎn)卵場(chǎng)對(duì)中國(guó)對(duì)蝦種群的貢獻(xiàn)值。中國(guó)對(duì)蝦在中日韓共享海域中分布廣泛，根據(jù)本發(fā)明篩選的引物組合能夠確定來源于不同產(chǎn)卵水域?qū)补芩蛸Y源的貢獻(xiàn)， 界定資源歸屬比例和應(yīng)獲捕撈配額，對(duì)于維護(hù)我國(guó)海洋權(quán)益和保護(hù)我國(guó)漁業(yè)資源具有重要意義。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通?？砂闯Ｒ?guī)條件，如J.薩姆布魯克(Sambrook)等編寫的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》中所述的條件來進(jìn)行操作。申請(qǐng)人:在長(zhǎng)期的研究中，通過對(duì)不同種群的AFLP分析，篩選到了可以有效的對(duì)中國(guó)對(duì)蝦種群進(jìn)行鑒定的引物對(duì)組合，利用本發(fā)明的引物組對(duì)中國(guó)對(duì)蝦種群進(jìn)行鑒定，步驟如下I、基因組DNA提取提取中國(guó)對(duì)蝦的全基因組DNA，保存于_20°C備用。2、酶切反應(yīng)酶切反應(yīng)體系共20μ L :基因組 DNA 約 100ng、0. 1μ L Trul I (lOu/μΙ)、O. I μ LEcoR I (lOu/μ I)以及 4· Ομ L 10XY+/Tango buffer，加超純水至 20 μ L，于恒溫設(shè)備中65°C酶切，時(shí)間不少于6h。酶切反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)產(chǎn)物置于75°C中加熱15min，使酶失活，4°C保存?zhèn)溆谩?、連接反應(yīng)連接反應(yīng)體系共IOyL:酶切反應(yīng)產(chǎn)物5 μ L、ly L的Solution I,O. IyL EcoRIadapter(序列見表 I)、0· I μ L Mse I adapter(序列見表 I)以及 O. I μ L SolutionII (IOu/μ U，加超純水至10 μ L,室溫下反應(yīng)時(shí)間不少于8h,于4°C保存?zhèn)溆谩?、預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)體系共20yL:連接產(chǎn)物 lyL、2yL10XPCR buffer、2yL dNTP、O. 05 μ L 的 EcoR I preprimer (序列見表 I)、0· 05 μ L 的 Mse I preprimer (序列見表 I)以及O. 15 μ LTaq DNA聚合酶。預(yù)擴(kuò)增PCR 反應(yīng)條件94°C 2min，20 個(gè)循環(huán)(94°C 30s—56°C 60s—72°C 60s)，4°C下保溫。擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物用超純水稀釋10倍，置4°C下保存?zhèn)溆谩?、選擇性擴(kuò)增反應(yīng)在避光條件下，選擇性擴(kuò)增體系20 μ L :5 μ L預(yù)擴(kuò)增稀釋混合液、2 μ LIOXPCRbuffer plus Mg2\2y L dNTP,O. 05 μ L EcoR I 引物(5，端添加 FAM 熒光標(biāo)記)(序列見表1)、0. 05yLMse I引物(序列見表I)，O. 15 μ LTaq DNA聚合酶，加超純水至總體積為
20 μし
PCR 反應(yīng)條件先 94 V 2min,再 94 V 30s,65 V 30s, (Touch down 至 56 °C ),72°C 60s, 10個(gè)循環(huán)后變?yōu)?4°C 30s, 56°C 30s, 72°C 60s, 26個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后用2%瓊脂糖電泳檢測(cè)選擇性擴(kuò)增效果，并將產(chǎn)物濃度稀釋到Marker亮度的1/10。擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物4 °C保存?zhèn)溆谩?、ABI373O 條帶分型將濃度調(diào)整后的選擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到96孔板中，按照每個(gè)反應(yīng)中9 μ L稀釋產(chǎn)物、O. I μ L 內(nèi)標(biāo)(LIZ_500Size Standard, Applied Biosystems)及 O. 9 μ L Hidi 甲酸胺進(jìn)行混合。后將上述混合物至于_20°C冰中冷卻5分鐘后，迅速轉(zhuǎn)移至95°C加熱，使混合物徹底變性。最后，將載有混合物的96孔板置于ABI3730測(cè)序儀中進(jìn)行分型。7、運(yùn)用Genemapper 4. O進(jìn)行條帶讀取與分析。表I本發(fā)明引物序列信息
權(quán)利要求
1.用于鑒定中國(guó)對(duì)蝦種群的引物組，其特征在于，包括有四對(duì)引物，每對(duì)引物的正向引物、反向引物的序列分別為SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :1 和 SEQ ID NO :3、SEQ ID NO 4 和 SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6 和 SEQ ID NO :7。
2.權(quán)利要求I所述的引物組的應(yīng)用，是用于對(duì)中國(guó)對(duì)蝦種群進(jìn)行遺傳鑒定。
3.如權(quán)利要求2所述的遺傳鑒定，包括有如下的步驟 1)樣品基因組DNA的提??； 2)酶切反應(yīng)；用EcoRI和Mse I對(duì)I)中的DNA進(jìn)行酶切 3)連接反應(yīng)將2)中獲得的酶切產(chǎn)物連接上EcoRI接頭和Mse I接頭； 4)預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)用EcoRI preprimer和Mse I preprimer對(duì)3)中獲得的連接產(chǎn)物進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增； 5)選擇性擴(kuò)增將預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋后，分別用SEQID NO :1和SEQ ID NO :2、SEQ IDNO :1 和 SEQ ID NO :3、SEQ ID NO 4 和 SEQ ID NO :5、SEQ IDNO 6 和 SEQ ID NO 7 的引物對(duì)進(jìn)行擴(kuò)增；且序列為SEQ ID NO :1、SEQ IDNO :4、SEQ ID NO 6的引物的5'用FAM熒光標(biāo)記； 6)結(jié)果分析將步驟5)的擴(kuò)增產(chǎn)物用ABI3730條帶分型，讀取結(jié)果后進(jìn)行種群分析。
4.如權(quán)利要求3所述的遺傳鑒定,其特征在于,所述的EcoRI preprimer和Mse Ipreprimer 的核苷酸序列分別為 SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9。
全文摘要
本發(fā)明涉及一個(gè)用于鑒定中國(guó)對(duì)蝦種群的引物組，包括有四對(duì)引物，每對(duì)引物的正向引物、反向引物的序列分別為SEQ ID NO1和SEQ IDNO2、SEQ ID NO1和SEQ ID NO3、SEQ ID NO4和SEQ ID NO5、SEQ ID NO6和SEQ ID NO7。通過本發(fā)明篩選出的引物組合，可以確定自然海域中國(guó)對(duì)蝦種群的來源和歸屬地，有利于界定不同產(chǎn)卵場(chǎng)對(duì)中國(guó)對(duì)蝦種群的貢獻(xiàn)值。中國(guó)對(duì)蝦在中日韓共享海域中分布廣泛，根據(jù)本發(fā)明篩選的引物組合能夠確定來源于不同產(chǎn)卵水域?qū)补芩蛸Y源的貢獻(xiàn)，界定資源歸屬比例和應(yīng)獲捕撈配額，對(duì)于維護(hù)我國(guó)海洋權(quán)益和保護(hù)我國(guó)漁業(yè)資源具有重要意義。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102676687SQ20121018662
公開日2012年9月19日 申請(qǐng)日期2012年6月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月8日
發(fā)明者張朝暉, 張輝, 李鵬飛, 高天翔 申請(qǐng)人:中國(guó)海洋大學(xué)