專利名稱：一種共表達(dá)man5A和AEx11A的酵母系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種共表達(dá)源自黑曲霉(Aspergillus niger)LW_l的β_甘露聚糖酶基因(man5A)和源自米曲霉(Aspergillus oryzae) CICC 40186的β-1，4_木聚糖酶耐熱突變子基因(AExllA)的畢赤酵母新表達(dá)系統(tǒng)，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
半纖維素是自然界的第二大類多糖聚合物，作為木質(zhì)素和纖維素中間的連接物，廣泛存在于植物細(xì)胞壁。半纖維素的降解產(chǎn)物具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值，因此，如何充分利用豐 富的半纖維素資源成為研究的熱點(diǎn)。半纖維素的完全降解需要靠諸如β_1，4-內(nèi)切木聚糖酶、β-甘露聚糖酶、半乳糖苷酶和脫こ?；傅让傅膮f(xié)同作用。β_甘露聚糖酶(β-ι，
4-D-mannanmannohydrolase,EC 3.2. I. 78)是一種能從均一甘露聚糖和異甘露聚糖主鏈的內(nèi)部降解β_1，4-甘露糖苷鍵的水解酶，屬于半纖維素酶類，其廣泛地存在于微生物、植物和動(dòng)物中。β-1，4-內(nèi)切木聚糖酶(endo-β-l,4_xylanase,EC 3. 2. I. 8)是一類能夠?qū)Ｒ唤到饽揪厶菫榈途勰咎呛湍咎堑末`組酶的總稱，主要從主鏈內(nèi)部作用于木糖苷鍵，是木聚糖降解過(guò)程中最重要的酶之一。能夠產(chǎn)生木聚糖酶的微生物有很多，包括絲狀真菌、細(xì)菌、放線菌等。兩種酶均廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、飼料、造紙和印染等領(lǐng)域。在飼料エ業(yè)中，甘露聚糖酶和β_1，4-內(nèi)切木聚糖酶作為新型的飼料添加劑能有效降解植物細(xì)胞壁中的甘露聚糖成分，消除抗?fàn)I養(yǎng)因子，提高能量利用率、改善飼料轉(zhuǎn)化率。在造紙エ業(yè)中，β_甘露聚糖酶和β_1，4-內(nèi)切木聚糖酶等半纖維素降解酶類協(xié)同使用，處理紙漿，能明顯改善紙質(zhì)。此外，β_甘露聚糖酶和β_1，4-內(nèi)切木聚糖酶能增加軟木的水解，進(jìn)而提高木質(zhì)素的轉(zhuǎn)化。早期對(duì)于甘露聚糖酶和β_1，4-內(nèi)切木聚糖酶的研究多集中在產(chǎn)酶菌株的選育、發(fā)酵條件的優(yōu)化、酶的分離純化、酶的理化性質(zhì)、酶的復(fù)合誘變、酶的水解機(jī)理等方面。隨著分子生物學(xué)研究的不斷深入與完善，越來(lái)越多的工作集中于酶的基因克隆和高效表達(dá)方面，如構(gòu)建和篩選優(yōu)良的高效基因工程菌株；基于酶結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，通過(guò)定點(diǎn)誘變改變酶活性位點(diǎn)，從而實(shí)現(xiàn)催化功能的改變，以拓寬其應(yīng)用范圍等。不同來(lái)源的兩種酶基因已經(jīng)被克隆，并在大腸桿菌、釀酒酵母、畢氏酵母等表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行了表達(dá)。然而在畢赤酵母系統(tǒng)中進(jìn)行共表達(dá)的研究尚未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是構(gòu)建ー種新型的共表達(dá)甘露聚糖酶基因和β-1，4_木聚糖酶基因的畢赤酵母工程菌。本發(fā)明的技術(shù)方案所設(shè)計(jì)到的pPICZ a A_man5A和pPIC9k_AExllA均為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建和保藏。所述的重組Man5A和重組AExl IA活性的測(cè)定方法于25mL具塞試管A和B中，各加入質(zhì)量濃度為O. 5%的底物溶液2. 4mL, 50°C預(yù)熱IOmin,在A管中加入O. ImL適當(dāng)稀釋的酶液,50°C反應(yīng)IOmin ;立即各加入2. 5mL 3',5' — ニ硝基水楊酸(DNS)試劑，在B管中再補(bǔ)加O. ImL酶液，A和B管均煮沸7min ;冷卻后各加去離子水5mL，搖勻；540nm處以B管為空白對(duì)照測(cè)定A管吸光度值，并從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的還原糖(分別以甘露糖和木糖計(jì))含量井折算成酶活性単位。其中重組Man5A活性測(cè)定底物為用PH 3. 6、檸檬酸-Na2HPO4緩沖液配制的角豆膠(Sigma，USA)溶液，重組XynII活性測(cè)定底物為用pH 4. 6、檸檬酸-Na2HPO4緩沖液配制的樺木木聚糖(Sigma，USA)溶液。酶活性単位定義在本測(cè)定條件下，以每分鐘產(chǎn)生I μ mol還原糖所需的酶量定義為I個(gè)木聚糖酶活性単位(IU)。所述的重組工程菌的構(gòu)建方法(l)GS115/man5A的構(gòu)建、表達(dá)及活性測(cè)定用Sac I對(duì)pPICZ a A_man5A進(jìn)行線性化，按照畢赤酵母表達(dá)手冊(cè)進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化GS115感受態(tài)細(xì)胞，用Zeocin篩選得到高拷貝的畢赤酵母重組子GS115/man5A ;按照手冊(cè)上的標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，用DNS法測(cè)定重組甘露聚糖酶活性。(2)エ程菌GS115/man5A-AExllA的構(gòu)建用 Sal I 對(duì) pPIC9k_AExllA 進(jìn)行線性化，按照畢赤酵母表達(dá)手冊(cè)進(jìn)行電轉(zhuǎn)化GSl 15/man5A感受態(tài)細(xì)胞，用G418篩選得到高拷貝的畢赤酵母重組子GS115/man5A-AExllA ;按照手冊(cè)上的標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，用DNS法測(cè)定重組甘露聚糖酶和木聚糖酶的活性。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明提供了ー種新型的共表達(dá)β_甘露聚糖酶基因和β -l，4-木聚糖酶基因的エ程菌GS115/man5A-AEXllA的構(gòu)建方法。本發(fā)明不僅實(shí)現(xiàn)對(duì)雙質(zhì)粒體系在共表達(dá)的應(yīng)用進(jìn)行了有益探索，而且實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)酶的共同生產(chǎn)，降低了產(chǎn)物的制備成本，為進(jìn)ー步エ業(yè)化生產(chǎn)復(fù)合酶奠定了基礎(chǔ)。
具體實(shí)施方式

以下結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)ー步闡述本發(fā)明的操作方法。但是這些實(shí)施例僅用于詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例I工程菌GS115/man5A的構(gòu)建、表達(dá)及產(chǎn)物活性測(cè)定用Sac I對(duì)pPICZ ciA-man5A進(jìn)行線性化，按照畢赤酵母表達(dá)手冊(cè)進(jìn)行電轉(zhuǎn)化GSl 15感受態(tài)細(xì)胞，用Zeocin篩選得到高拷貝的畢赤酵母重組子GS115/man5A。該工程菌用I. 0%甲醇誘導(dǎo)96h，DNS法測(cè)得發(fā)酵液中重組甘露聚糖酶活性達(dá)29. 05IU/mL。SDS-PAGE電泳顯示重組甘露聚糖酶分子量為52. OkDa0實(shí)施例2工程菌GS115/man5A-AExllA的構(gòu)建、表達(dá)及產(chǎn)物活性測(cè)定用Sal I對(duì)pPIC9k_AExllA進(jìn)行線性化，按照畢赤酵母表達(dá)手冊(cè)進(jìn)行電轉(zhuǎn)化GSl 15/man5A感受態(tài)細(xì)胞，用G418篩選得到高拷貝的畢赤酵母重組子GSl 15/man5A-AExllA。該工程菌用I. 0%甲醇誘導(dǎo)96h，DNS法測(cè)得發(fā)酵液中重組木聚糖酶活性達(dá)82. 20IU/mL，重組甘露聚糖酶活性仍為29. 05IU/mL。SDS-PAGE電泳顯示重組木聚糖酶和甘露聚糖酶分子量分別為25. IkDa和52。
權(quán)利要求
1.一種共表達(dá)源自黑曲霉(Aspergillus niger)LW_l的β-甘露聚糖酶基因(man5A)和米曲霉(Aspergillus oryzae) CICC 40186的β-1，4-木聚糖酶耐熱突變子基因(AExllA)的畢赤酵母新表達(dá)系統(tǒng)。
2.共表達(dá)man5A和AExllA的畢赤酵母系統(tǒng)的構(gòu)建和表達(dá)方法 (1)GS115/man5A的構(gòu)建、表達(dá)及活性測(cè)定用SacI對(duì)pPICZ a A_man5A進(jìn)行線性化，按照畢赤酵母表達(dá)手冊(cè)進(jìn)行電轉(zhuǎn)化GSl 15感受態(tài)細(xì)胞，用Zeocin篩選得到高拷貝的畢赤酵母重組子GS115/man5A ;按照手冊(cè)上的標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，該工程菌用I. 0%甲醇誘導(dǎo).96h，DNS法測(cè)得發(fā)酵液中重組甘露聚糖酶活性達(dá)29. 05IU/mL ； (2)工程菌GS115/man5A-AExllA的構(gòu)建用SalI對(duì)pPIC9k_xyn II進(jìn)行線性化，按照畢赤酵母表達(dá)手冊(cè)進(jìn)行電轉(zhuǎn)化GSl 15/man5A感受態(tài)細(xì)胞，用G418篩選得到高拷貝的畢赤酵母重組子GS115/man5A-AExllA ;按照手冊(cè)上的標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，該工程菌用I. 0%甲醇誘導(dǎo)96h，DNS法測(cè)得發(fā)酵液中重組木聚糖酶活性達(dá)82. 20IU/mL，重組甘露聚糖酶活性仍為29. 05IU/mL ；SDS-PAGE電泳顯示重組木聚糖酶和甘露聚糖酶分子量分別為25. IkDa和.52. OkDa0
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新型的共表達(dá)源自黑曲霉(Aspergillus niger)LW-1的β-甘露聚糖酶基因和源自米曲霉(Aspergillus oryzae)CICC 40186的β-1，4-木聚糖酶耐熱突變子基因的工程菌GS115/man5A-AEx11A的構(gòu)建方法。所構(gòu)建成的畢赤酵母共表達(dá)系統(tǒng)可用于的β-甘露聚糖酶和β-1，4-木聚糖酶的工業(yè)化生產(chǎn)。所制備的兩種酶具有底物親和力強(qiáng)、催化效率高的特性，具有較大的工業(yè)化生產(chǎn)潛力和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N1/19GK102676411SQ20121018137
公開日2012年9月19日 申請(qǐng)日期2012年6月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月5日
發(fā)明者唐存多, 李劍芳, 鄔敏辰, 高樹娟 申請(qǐng)人:江南大學(xué)