專利名稱：一株穩(wěn)定高產(chǎn)2,3-丁二醇的細(xì)菌及利用低溫等離子體和硫酸二乙酯復(fù)合誘變的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物誘變育種技術(shù)領(lǐng)域，涉及到使用低溫等離子體和硫酸二乙酯復(fù)合誘變產(chǎn)生一株高產(chǎn)2，3- 丁二醇的菌株及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
2，3- 丁二醇(2，3-Butanediol,2, 3-BD)是一種非常重要的化工原料及燃料，在醫(yī)藥、食品、精細(xì)化工等領(lǐng)域有廣泛用途。由于2，3-丁二醇含有兩個手性中心，化學(xué)合成困難，所以以生物質(zhì)資源為原料、經(jīng)微生物法生產(chǎn)2，3-丁二醇具有很大的工業(yè)化前景，其中如何獲得高產(chǎn)2，3- 丁二醇的菌株對于生物法生產(chǎn)2，3- 丁二醇的工業(yè)化具有重要意義。
目前發(fā)酵生產(chǎn)2，3-丁二醇的微生物主要是細(xì)菌類，包括克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、芽孢桿菌(Bacillus)、腸桿菌屬(Enterobacter)、假單孢桿菌屬(Pseudomonad)等。目前肺炎克雷伯氏桿菌發(fā)酵獲得的2，3_ 丁二醇產(chǎn)物濃度最高,也是研究最多的菌種。但此菌屬于條件致病菌，作為一種工業(yè)應(yīng)用菌種具有很大的局限性和不安全性。近年來，國內(nèi)外對2，3- 丁二醇的發(fā)酵的研究很多，主要圍繞著菌種的誘變篩選和基因工程改造等。最常用的誘變方法有紫外誘變、化學(xué)誘變或兩者的結(jié)合。紫外誘變雖然安全，但是操作復(fù)雜，而且誘變效率低?；瘜W(xué)誘變的效果較好，但是一般作用時間長，毒副作用大。低溫等離子體是一種低溫非平衡等離子體，是指氣體在大氣壓下受到外界高能量(高電壓、強電磁場、輻射等)作用時氣體分子被擊穿，產(chǎn)生帶電粒子、自由基、活性物質(zhì)和紫外線等，且整個體系呈現(xiàn)低溫狀態(tài)。低溫等離子處理細(xì)胞時能夠破壞細(xì)胞壁，可以使大量帶電粒子、活性物質(zhì)和紫外線能夠進(jìn)入細(xì)胞直接作用于胞內(nèi)核酸，同時這也使化學(xué)分子能更有效地直接作用于DNA上，減少了處理時間。本發(fā)明使用低溫等離子體和硫酸二乙酯復(fù)合誘變的方法對微生物進(jìn)行誘變育種。該方法中使用的硫酸二乙酯用量低，在空氣中暴露時間短，不僅保證了化學(xué)誘變的高效性，同時增加了操作人員的安全性。采用的復(fù)合誘變方法操作簡單易行、效率高，復(fù)合誘變大大降低了突變菌的回復(fù)率，保證了突變菌的穩(wěn)定性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明內(nèi)容在于使用一種新型的誘變方法一低溫等離子體和硫酸二乙酯復(fù)合誘變法處理微生物，選育一株穩(wěn)定高產(chǎn)2，3- 丁二醇的突變菌株及該菌株在發(fā)酵生產(chǎn)2，3- 丁二醇中的應(yīng)用，解決工業(yè)生產(chǎn)中生產(chǎn)安全和發(fā)酵液2，3-丁二醇濃度低的問題，為2，3-丁二醇的工業(yè)生產(chǎn)及應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，同時也為其他微生物的誘變選育提供了一種新的誘變方法。本發(fā)明提供了一種行之有效的誘變育種新技術(shù)。以Enterobacter cloacae(陰溝腸桿菌)或其他細(xì)菌為原始菌株，首先使用硫酸二乙酯預(yù)處理原始菌株，然后使用低溫等離子體處理含有硫酸二乙酯的菌懸液進(jìn)行復(fù)合誘變，最后通過多重篩選得到穩(wěn)定高產(chǎn)的突變菌株。本發(fā)明的技術(shù)方案如下一株穩(wěn)定高產(chǎn)2，3-丁二醇的細(xì)菌,其分類命名為Enterobacter cloacae DLM,其保藏號為CGMCC 6053。上述細(xì)菌利用低溫等離子體和硫酸二乙酯復(fù)合誘變的方法，包括如下步驟 (I)將原始菌株進(jìn)行硫酸二乙酯預(yù)處理將菌種以1-2%接種量接入種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12_16h后，取菌液離心，棄上清液，殘留菌體用無菌生理鹽水稀釋至細(xì)胞個數(shù)為107-109/mL。向菌懸液中加入1-3% (v/v)的硫酸二乙酯進(jìn)行振蕩混合，處理時間為3-10min。(2)復(fù)合誘變菌株采用介質(zhì)阻擋放電(DBD)裝置。取500uL硫酸二乙酯預(yù)處理過的菌懸液滴加到直徑60_的滅菌冷卻后玻璃圓盤的中央，置于等離子體誘變平臺中。調(diào)節(jié)玻璃圓盤上部的高壓電極與菌液液面的間隙，調(diào)節(jié)電流和電壓，使氣體產(chǎn)生放電，得到均勻的空氣介質(zhì)阻擋放電等離子體，放電處理15-160S。將此菌懸液稀釋涂于平板培養(yǎng)基上，將平板置于25 37° C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為廣2天。計數(shù)平板上的菌落數(shù)，得出致死率，從而確定最佳誘變時間，誘變時間一般選擇致死率約為70%左右的時間點。(3)菌種篩選挑取在平板上生長良好、菌落比較大的菌落至種子培養(yǎng)基中進(jìn)行初篩，搖瓶培養(yǎng)24-48h后，檢測產(chǎn)物濃度；然后將產(chǎn)物濃度明顯提高的突變菌轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行復(fù)篩，3瓶平行培養(yǎng)24-48h，檢測產(chǎn)物濃度；選取高產(chǎn)物濃度的菌株在發(fā)酵罐中培養(yǎng)，驗證其發(fā)酵性能；通過搖瓶傳代，比較不同代菌株的發(fā)酵罐培養(yǎng)實驗結(jié)果，驗證其遺傳穩(wěn)定性。通過上述方法得到的穩(wěn)定高產(chǎn)2，3- 丁二醇的菌株在發(fā)酵生產(chǎn)2，3- 丁二醇中應(yīng)用，其發(fā)酵使用的培養(yǎng)基包括如下成分碳源2-14%、氮源0. 5-3%、無機鹽0. 2-0. 5%，其余為水；其中碳源為葡萄糖、淀粉水解液、菊粉水解液中一種或兩種及以上的混合；所述氮源為無機或有機含氮化合物，其中無機氮源為磷酸氫二銨和尿素中一種或兩種的混合，有機含氮源為酵母粉和玉米漿中一種或兩種的混合；所述無機鹽為鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、磷酸鹽、檸檬酸、亞鐵、錳、鋅和EDTA。
具體實施例方式實施例I本實施例說明使用等離子體和硫酸二乙酯復(fù)合誘變微生物的方法。實驗菌種為Enterobacter cloacae (陰溝腸桿菌),從土壤中篩選得到。實驗中使用的等離子體放電裝置為專利200610047213. 5實施例一中使用的介質(zhì)阻擋放電(DBD)裝置。本實施例使用的種子培養(yǎng)基為葡萄糖40g/L，(NH4)2HPO4 6g/L，KCl I. 8g/L，EDTA0. 51g/L, MgSO4 0. 88g/L, FeSO4 7H20 0. 0225g/L, ZnSO4 7H20 0. 0075g/L, MnSO4 H2O0. 0023g/L，檸檬酸 0. 21g/L，檸檬酸鈉 0. 294g/L，酵母粉 lg/L。
發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖120g/L, (NH4)2HPO4 18g/L，KCl I. 8g/L, EDTA 0. 51g/L,MgSO4 0. 88g/L, ZnSO4 7H20 0. 0075g/L, FeSO4 7H20 0. 0225g/L, MnSO4 H2O 0. 0023g/L,檸檬酸0. 21g/L，檸檬酸鈉0. 294g/L，酵母粉lg/L。培養(yǎng)條件為搖瓶裝液量為體積1/3，溫度37°C，搖床轉(zhuǎn)速200rpm。硫酸二乙酯預(yù)處理將原始菌種以1-2%接種量接種于IOOmL種子培養(yǎng)基中，在37°C、200rpm條件下培養(yǎng)12-16h，得到處于對數(shù)生長期的菌液。取Iml的菌液，12000rpm離心2分鐘，棄上清，殘留菌體用無菌生理鹽水稀釋至細(xì)胞個數(shù)約為107-109/mL。取ImL稀釋后的菌懸液置于離心管中，向懸液中加入2% (v/v)的硫酸二乙酯(約20uL)，置于漩渦振蕩器上處理5min。誘變過程取500uL硫酸二乙酯預(yù)處理過的菌懸液滴加到直徑60mm的經(jīng)酒精消毒滅菌后玻璃圓盤的中央，置于等離子體誘變平臺中，調(diào)整上電極與菌液液面間的距離至3mm，在電壓25v、電流1.2A的條件下放電處理100s。實施例2本實施例說明篩選高產(chǎn)2，3- 丁二醇的突變菌株的方法搖瓶初篩將誘變后的菌液稀釋涂平板，置于37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，挑取平板上菌落形態(tài)良好的菌落接種到50mL種子培養(yǎng)基中，在37°C、200rpm條件下培養(yǎng)36h，氣相檢測2，3- 丁二醇濃度，選取產(chǎn)物濃度高于原始菌20%以上的菌株。搖瓶復(fù)篩將經(jīng)搖瓶初篩得到的菌株轉(zhuǎn)接于200mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，每個樣品做三個平行，置于37°C恒溫?fù)u床中，200rpm振蕩培養(yǎng)36h。氣相檢測2，3-丁二醇濃度，選取產(chǎn)物濃度仍高于原始菌20%以上的菌株。發(fā)酵罐培養(yǎng)驗證用Biotech 5 L全自動發(fā)酵罐，發(fā)酵培養(yǎng)基體積為I. 5 L，溫度為37 °C，攪拌轉(zhuǎn)速為250 rpm,用5 mo I/L NaOH控制pH為5. 9，發(fā)酵過程中保持通200ml/(L min)的壓縮空氣，葡萄糖起始濃度為120 g/L，10%接種，發(fā)酵過程中使用蠕動泵連續(xù)流加800 g/L的高濃度葡萄糖漿，保持發(fā)酵過程中發(fā)酵液中葡萄糖濃度在50 g/L左右，發(fā)酵實驗至少重復(fù)3次。發(fā)酵液中2，3- 丁二醇濃度在110 g/L左右，比原始菌株提高了 26%左右。實施例3本實施例說明突變菌Enterobacter cloacae DLM的遺傳穩(wěn)定性。在以葡萄糖為碳源的種子培養(yǎng)基中連續(xù)傳代，以第一代、第三代和第七代進(jìn)行發(fā)酵罐批式流加實驗,檢查突變株DLM的傳代穩(wěn)定性。實驗結(jié)果如表I所示。表I
StrainFermentation time(h) 2, 3-BD(g/L) 2, 3-BD yield(g/g)
Enterobacter cloacae5687.290. 29權(quán)利要求
1.一株穩(wěn)定高產(chǎn)2，3-丁ニ醇的細(xì)菌,其分類命名為Enterobacter cloacae DLM,其保藏號為CGMCC 6053。
2.使用低溫等離子體和硫酸ニこ酯復(fù)合誘變權(quán)利要求I所述的細(xì)菌的方法，其特征在于 (1)將原始菌株進(jìn)行硫酸ニこ酯預(yù)處理將菌種以1-2%接種量接入種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12-16h后，取菌液離心，棄上清液，殘留菌體用無菌生理鹽水稀釋至細(xì)胞個數(shù)為IO7-IO9/mL ;向菌懸液中加入廣3% (v/v)的硫酸ニこ酯進(jìn)行振蕩混合，處理時間為3-10min ； (2)復(fù)合誘變菌株采用介質(zhì)阻擋放電(DBD)裝置，取500uL處理過的菌懸液滴加到直徑60_的滅菌冷卻后玻璃圓盤的中央，置于等離子體誘變平臺中；調(diào)節(jié)玻璃圓盤上部的高壓電極與菌液液面的間隙，調(diào)節(jié)電流和電壓，使氣體產(chǎn)生放電，得到均勻的空氣介質(zhì)阻擋放電等離子體，放電處理15-160S ;將此菌懸液稀釋涂于平板培養(yǎng)基上，將平板置于25 37° C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為廣2天； (3)菌種篩選挑取在平板上生長良好的菌落依次進(jìn)行種子培養(yǎng)基搖瓶初篩、發(fā)酵培養(yǎng)基搖瓶復(fù)篩，獲得產(chǎn)物濃度明顯提高的突變菌株，然后進(jìn)行發(fā)酵罐培養(yǎng)驗證其發(fā)酵性能；通過搖瓶傳代，比較不同代菌株的發(fā)酵罐培養(yǎng)實驗結(jié)果，驗證其遺傳穩(wěn)定性。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，發(fā)酵使用的培養(yǎng)基包括如下成分碳源2-14%、氮源O. 5-3%、無機鹽O. 2-0. 5%，其余為水；其中碳源為葡萄糖、淀粉水解液、菊粉水解液中ー種或兩種及以上的混合；所述氮源為無機或有機氮化合物，其中無機氮源為磷酸氫ニ銨和尿素中ー種或兩種的混合，有機氮源為酵母粉和玉米漿中ー種或兩種的混合；所述無機鹽為鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、磷酸鹽、檸檬酸、亞鐵、錳、鋅和EDTA。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株穩(wěn)定高產(chǎn)2,3-丁二醇的陰溝腸桿菌及利用低溫等離子體和硫酸二乙酯復(fù)合誘變的方法，其分類命名為Enterobacter cloacae DLM，其保藏號為CGMCC 6053。該誘變方法特征是將細(xì)菌懸浮于生理鹽水中，依次進(jìn)行“硫酸二乙酯預(yù)處理→低溫等離子體和硫酸二乙酯復(fù)合誘變”。該菌株能有效利用不同碳源發(fā)酵生產(chǎn)2,3-丁二醇，糖的轉(zhuǎn)化率高，2,3-丁二醇濃度高；葡萄糖或菊糖水解液為碳源時，5L發(fā)酵罐中2,3-丁二醇濃度分別達(dá)到125.2g/l和120.2g/l。本發(fā)明使用的誘變方法操作簡單易行、誘變處理時間短等特點，為微生物的誘變育種提供了一種可靠方法。
文檔編號C12R1/01GK102660481SQ20121014990
公開日2012年9月12日 申請日期2012年5月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月16日
發(fā)明者修志龍, 戴建英, 程小龍 申請人:大連理工大學(xué)