專利名稱：一種非解乳糖鏈球菌及其應(yīng)用的制作方法
一種非解乳糖鏈球菌及其應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了一株非解乳糖鏈球菌LZMYFGM9，該菌株的拉丁文分類命名為Streptococcus alactolyticus ,該菌株已于2010年10月19日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(保藏單位簡稱<6110，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號)，保藏編號為CGMCC No. 4227。本發(fā)明涉及發(fā)酵領(lǐng)域，具體地，涉及一種非解乳糖鏈球菌{Streptococcusalactolyticus ) LZMYFGM9 CGMCC No. 4227 及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
對非解乳糖鏈球菌的相關(guān)研究還較少，《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》也沒有收錄非解乳糖鏈球菌，1984年由Farraw等首次發(fā)現(xiàn)。1984年，F(xiàn)arrow等人利用遺傳學(xué)分類方法將馬腸鏈球菌/牛鏈球菌復(fù)合群(Streptococcus bovis/Streptococcus equinuscomplex)劃分為6個不同的DNA群，其中，DNA群I包含馬腸鏈球菌和牛鏈球菌。馬腸鏈球菌與牛鏈球菌的全基因組和16SrDNA序列高度同源，屬于同一個種。但命名上卻難以統(tǒng)一，因為馬腸鏈球菌的命名較早，而在醫(yī)學(xué)中廣泛用于代表這類菌株的是牛鏈球菌。DNA群2、3、4則對應(yīng)于三個不同的未命名的基因種。DNA群5命名為解糖鏈球菌，DNA群6命名為非解乳糖鏈球菌。Schlegel等人將馬腸鏈球菌/牛鏈球菌復(fù)合群進(jìn)行了重新劃分，認(rèn)為該復(fù)合群包括7個不同的種和亞種，即馬腸鏈球菌(S. equinus)、解沒食子酸鏈球菌解沒食子酸亞種(S. gallolyticus subsp. gallolyticus)、解沒食子酸鏈球菌巴氏亞種(S. gallolyticus subsp. pasteurianus)、解沒食子酸鏈球菌馬其頓亞種(S.gallolyticus subsp . macedonicus)、嬰兒鏈球菌嬰兒亞種(S. infantarius subsp.infantarius)、嬰兒鏈球菌結(jié)腸亞種(S. infantariussubsp. coli)和非解乳鏈球菌(S.alactolyticus)。而對于非解乳鏈球菌的變異種及應(yīng)用則少之又少。黃芪多糖是中藥黃芪有效成分，由a-糖甙鍵連接而成的分子量為37 500左右的植物多糖，水解后可檢出葡萄糖、豐乳糖和阿拉伯糖，三種糖克分子比為1:0. 95:0. 70。黃芪多糖是一種有效免疫增強(qiáng)劑，并能誘導(dǎo)機(jī)體益生菌增殖，促進(jìn)機(jī)體微生態(tài)平衡。研究報道表明黃芪多糖還具有增強(qiáng)細(xì)胞新陳代謝、促進(jìn)血液循環(huán)、抗病毒、抗腫瘤、抗應(yīng)激等保健功效，已被廣泛應(yīng)用作功能性配料或直接服用。目前，國內(nèi)外市場上的黃芪多糖均靠提取而來，據(jù)資料查新可知的黃芪多糖提取方法有8種，包括傳統(tǒng)的水提醇沉法、超微粉碎法、超聲細(xì)胞粉碎法、超濾法、微波提取法、纖維素酶法、堿水提取法、醇堿提取法。傳統(tǒng)水提醇沉法是目前最常用的提取方法，黃芪多糖的提取率平均為5. 34%左右；超微粉碎法，超微粉中黃芪多糖的提取率為4. 69%左右，而粗粉中黃芪多糖的提取率僅為2. 16%左右；超聲細(xì)胞粉碎法黃芪多糖的提取率為7. 6%左右；微波提取法黃芪多糖的提取率為6. 55%左右；超濾法提黃芪多糖得率低于水提醇沉法，但產(chǎn)物中多糖含量高；堿水提取法得黃芪多糖的提取率在4. 7-19. 2%之間，穩(wěn)定性較差；醇喊提取法得黃苗多糖的提取率最聞可達(dá)19. 15% ;纖維素酶法的黃苗多糖提取率聞于水提醇沉法，提取物多糖含量高，但因提取不穩(wěn)定而沒有科學(xué)的提取率參考數(shù)據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有的缺陷，提供了一種非解乳糖鏈球菌及生產(chǎn)用的包含該菌株的發(fā)酵菌劑
一種非解乳糖鏈球菌{Streptococcus alactolyticus^) LZMYFGM9,該菌株的保藏編號為 CGMCC No. 4227。一種包含非解乳糖鏈球菌(Stre/ (ococctts alactoIyti cus) LZMYFGM9 CGMCCNo. 4227的發(fā)酵菌劑，所述發(fā)酵菌劑經(jīng)以下步驟制得
(1)將非解乳糖鏈球菌alactolyticus) LZMYFGM9 CGMCC No. 4227 菌株接入MRS培養(yǎng)基斜面進(jìn)行培養(yǎng)，接種量為IO3Cfu ；
(2)將步驟(I)得到的培養(yǎng)物接入一級或二級種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)后得到發(fā)酵菌劑，接種量為 103cfu。具體地，所述步驟(I)的培養(yǎng)條件為時間16-20小時；環(huán)境厭氧發(fā)酵 ’溫度:36. 5-37. 50C ;初始 pH :6. 0-6. 4。具體地，所述步驟(2)的培養(yǎng)條件為時間16-20小時；環(huán)境厭氧發(fā)酵 ’溫度:
36.5-37. 50C ;初始 pH :5. 5-5. 9。非解乳糖鏈球菌(Stre/ (ococctts alac toIyticus )LZMYFGM9 CGMCC No. 4227 在提取黃芪多糖中的應(yīng)用。相關(guān)實(shí)驗
(一)非解乳糖鏈球菌alactoIyticus^LlWLVQW CGMCC No. 4227 的分離和篩選
準(zhǔn)備6支無菌試管并編號后，分別加入9. 5mL樣品稀釋液(質(zhì)量濃度0. 9%的生理鹽水)。將蘭州市上西園村16月齡健康蛋用土雞宰殺后，從盲腸中取腸內(nèi)容物，準(zhǔn)確稱取0. 50g加入編號I的試管中快速振蕩混勻。從I號試管中吸取0. 5mL液體加入2號試管,快速振蕩混勻后吸取0. 5mL加入3號試管，以此類推。將樣品稀釋成10'10_2、10_3、10_4、10_5、10_6 6個稀釋度。準(zhǔn)確吸取10_4、10_5、10_6 3個稀釋度樣品50 L接入事先準(zhǔn)備好的改良GAM瓊脂平板上，用涂布器快速涂布均勻后，放入?yún)捬豕蕖Ｔ趨捬豕拗屑尤胫甘緞?美蘭試紙)、催化齊IJ (鈀粒)和產(chǎn)氣袋(產(chǎn)氣袋中主要成分為硼氫化鈉、碳酸氫鈉、磷酸氫二鉀和磷酸二氫鉀)后密封培養(yǎng)，培養(yǎng)至平板長出成熟菌落。鑒定并分離純化(溶血試驗出現(xiàn)a溶血，生化鑒定出現(xiàn)苦杏仁苷、纖維二糖、七葉靈、果糖、半乳糖、葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、甘露糖、蜜二糖、棉子糖、水楊苷、鹿糖和海藻糖的陽性反應(yīng)；乳糖、接觸酶、氧化酶、阿拉伯糖、葡萄糖酸鈉、松三糖鼠李糖、核糖、山梨醇和木糖的陰性反應(yīng)，并用劃線培養(yǎng)挑單個菌落的方法純化菌種)非解乳糖鏈球菌落，將菌落接種MRS瓊脂斜面，并接種搖瓶，初篩利用硫酸-蒽酮法測定產(chǎn)黃芪多糖的轉(zhuǎn)化率，根據(jù)搖瓶產(chǎn)黃芪多糖的轉(zhuǎn)化率水平，選擇轉(zhuǎn)化率最高者，篩選出斜面出發(fā)菌種非解乳糖鏈球菌種FGMl。采用紫外線誘變處理，通過產(chǎn)黃芪多糖的轉(zhuǎn)化率測定篩選得到優(yōu)良的高產(chǎn)菌株，用于厭氧發(fā)酵黃芪多糖的生產(chǎn)。具體操作步驟如下菌種紫外誘變接種環(huán)挑取非解乳糖鏈球菌種FGMl斜面菌種于裝有無菌水的三角瓶中，置于磁力攪拌器振蕩均勻。將菌懸液倒入無菌平皿。打開平皿蓋，在事先預(yù)熱好的15W的紫外燈下30cm處照射0s、30s、60s、90s、120s、150s、180s、210s，不同照射劑量菌懸液稀釋到10'再用生理鹽水分別稀釋菌懸液到10_3，吸取稀釋好的菌懸液0. 05mL涂布5%黃芪MRS平板，每個稀釋度涂布3個平板。置于厭氧罐中培養(yǎng)至長出成熟菌落，統(tǒng)計致死率。篩選選取平板菌落進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，利用硫酸-蒽酮法測定轉(zhuǎn)化率。轉(zhuǎn)化率測定以5%黃芪粉溶液為底物，加入適量菌體細(xì)胞，總體積為20mL，置于三角瓶中在最適反應(yīng)溫度，轉(zhuǎn)速為120r/min的恒溫?fù)u床中反應(yīng)48h,取出于4000r/min臺式離心機(jī)離心lOmin，取上清液，乙醇沉淀，取沉淀作為測定黃芪多糖含量物。從中篩選出黃芪多糖提取率穩(wěn)定在10. 06%-15. 46%的高轉(zhuǎn)化率菌株非解乳糖鏈球菌種(St印
alac tolyticus ) LZMYFGM9。
(二)利用非解乳糖鏈球菌(Stre/ (ococctts alactolyticus)LlWYQW 制備生產(chǎn)用的包含非解乳糖鏈球菌alac tolyti cus )LZMYFGM9 CGMCC No. 4227 的發(fā)酵菌劑
(I)將非解乳糖鏈球菌alactolyticus ) LZMYFGM9 CGMCC No. 4227 菌株(接種量為IO3Cfu)接入MRS培養(yǎng)基斜面進(jìn)行培養(yǎng)時間16-20小時；環(huán)境厭氧發(fā)酵；溫度36. 5-37. 50C ;初始 pH :6. 0-6. 4。MRS斜面培養(yǎng)基為市售商品，(生產(chǎn)廠家廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；批號200904172)其成份為1%蛋白胨，1%牛肉浸膏，0. 5%酵母粉，0. 2%枸櫞酸二銨，2%葡萄糖，0. 5% 乙酸鈉，0. 2% 磷酸氫二鉀，0. 058% 的 MgSO4 7H20，0. 025% 的 MnSO4 4H20，0. 1% (V/V)的吐溫80，pH6. 5，3%瓊脂。(2)將上步得到的培養(yǎng)物(接種量為IO3Cfu)接入一級或二級種子培養(yǎng)基培養(yǎng)時間16-20小時；環(huán)境厭氧發(fā)酵；溫度:36. 5-37. 5°C ;初始pH :5. 5-5. 9，培養(yǎng)后得到發(fā)酵菌劑。種子培養(yǎng)基為市售商品(生產(chǎn)廠家廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；批號201106293)，其成份為1%蛋白胨，1%牛肉浸膏，0. 5%酵母粉，0. 2%枸櫞酸二銨，2%葡萄糖，0. 5% 乙酸鈉，0. 2% 磷酸氫二鉀，0. 058% 的 MgSO4 7H20，0. 025% 的 MnSO4 4H20，0. 1% (V/V)的吐溫80，pH6. 5。本發(fā)明具有以下有益效果
本發(fā)明首次提出了非解乳糖鏈球菌alac tolyti cus ) LZMYFGM9 CGMCCNo. 4227，并將其擴(kuò)大培養(yǎng)為生產(chǎn)用的發(fā)酵菌劑，該菌劑能夠用于提取黃芪多糖，具有較高的提取率。本發(fā)明實(shí)用性強(qiáng)，操作簡便，對發(fā)酵設(shè)備及生產(chǎn)條件沒有特殊要求，利用一般發(fā)酵廠的設(shè)備和生產(chǎn)條件即可生產(chǎn)，投資少、見效快、效益高，不但適合于大規(guī)模的生產(chǎn)還適合于小批量的生產(chǎn)，具有廣闊的實(shí)際應(yīng)用前景。保藏信息
非解乳糖鏈球菌LZMYFGM9的拉丁文分類命名為Stre/ (ococctts alactolyticus ；
保藏日期2010年10月19日；
保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏單位簡稱=CGMCC ；
保藏單位地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號；
保藏編號CGMCC No. 4227。
具體實(shí)施例方式(一)菌種實(shí)施例
非解乳糖鏈球菌{Streptococcus alactolyticus^) LZMYFGM9,該菌株的保藏編號為 CGMCC No. 4227，其形態(tài)為革蘭氏陽性，鏡檢為球狀或橢圓，呈鏈狀排布，不形成芽孢。生理生化特性溶血試驗出現(xiàn)a溶血，生化鑒定出現(xiàn)苦杏仁苷、纖維二糖、七葉靈、果糖、半乳糖、葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、甘露糖、蜜二糖、棉子糖、水楊苷、蔗糖和海藻糖的陽性反應(yīng)；乳糖、接觸酶、氧化酶、阿拉伯糖、葡萄糖酸鈉、松三糖鼠李糖、核糖、山梨醇和木糖的陰性反應(yīng)。(二)包含非解乳糖鏈球菌LZMYFGM9的發(fā)酵菌劑的制備實(shí)施例 實(shí)施例I
(I)將非解乳糖鏈球菌alactolyticus ) LZMYFGM9 CGMCC No. 4227 菌株(接種量為IO3Cfu)接入MRS培養(yǎng)基斜面進(jìn)行培養(yǎng)時間16小時；環(huán)境厭氧發(fā)酵；溫度
37.50C ;初始 pH :6. 4。(2)將上步得到的培養(yǎng)物(接種量為IO3Cfu)接入一級或二級種子培養(yǎng)基培養(yǎng)時間16小時；環(huán)境厭氧發(fā)酵；溫度37. 5°C ;初始pH 5. 9，培養(yǎng)后得到發(fā)酵菌劑。實(shí)施例2
(I)將非解乳糖鏈球菌alactolyticus ) LZMYFGM9 CGMCC No. 4227 菌株(接種量為IO3Cfu)接入MRS培養(yǎng)基斜面進(jìn)行培養(yǎng)時間20小時；環(huán)境厭氧發(fā)酵；溫度36. 50C ;初始 pH :6. O。(2)將上步得到的培養(yǎng)物(接種量為IO3Cfu)接入一級或二級種子培養(yǎng)基培養(yǎng)時間20小時；環(huán)境厭氧發(fā)酵；溫度36. 5°C ;初始pH 5. 5，培養(yǎng)后得到發(fā)酵菌劑。實(shí)施例3
(I)將非解乳糖鏈球菌alactolyticus ) LZMYFGM9 CGMCC No. 4227 菌株(接種量為IO3Cfu)接入MRS培養(yǎng)基斜面進(jìn)行培養(yǎng)時間18小時；環(huán)境厭氧發(fā)酵；溫度370C ;初始 pH :6. 2。(2)將上步得到的培養(yǎng)物(接種量為IO3Cfu)接入一級或二級種子培養(yǎng)基培養(yǎng)時間18小時；環(huán)境厭氧發(fā)酵；溫度37°C ;初始pH 5. 7，培養(yǎng)后得到發(fā)酵菌劑。(三)應(yīng)用實(shí)施例
非解乳糖鏈球菌LZMYFGM9用于在發(fā)酵反應(yīng)中提取黃芪多糖，具體如下
(I)將制備的包含非解乳糖鏈球菌alac tolyti cus ) LZMYFGM9 CGMCCNo. 4227的發(fā)酵菌劑轉(zhuǎn)入提取黃芪多糖的發(fā)酵培養(yǎng)基，接入量為2%(V/V體積百分?jǐn)?shù))，置于厭氧罐中，于37攝氏度、120轉(zhuǎn)/分條件下反應(yīng)60小時，得到發(fā)酵產(chǎn)物。上述提取黃芪多糖的發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及指標(biāo)為乳清粉5. 158 g ;蛋白胨0. 456 g ;葡萄糖:0. 12 g ;酵母粉:0. 312 g ;無機(jī)鹽(磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀):0. 194 g ；黃芪粉16 g;水200 ml，加入500ml的三角瓶，于高壓鍋中121 °C，20min滅菌，調(diào)整pH至6.9備用。(2)發(fā)酵完畢后，將發(fā)酵產(chǎn)物離心法將固液分離，分離后，上清部分用95%乙醇沉淀2次；沉淀部分用水煮后離心，取液體部分濃縮，再用95%乙醇沉淀2次；兩部分沉淀提取物合并后冰凍干燥，稱得提取物的重量為2. 365克，提取率為14. 78%，黃芪多糖含量為31. 22%。最后應(yīng)說明的是以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明， 盡管參照前述實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，其依然可以對前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種非解乳糖鏈球菌(Stre/ (ococcys alactoIyticus) LZMYFGM9,該菌株的保藏編號為 CGMCC No. 4227。
2.一種包含非解乳糖鏈球菌(Stre/ (ococctts alac toIyticus ) LZMYFGM9 CGMCCNo. 4227的發(fā)酵菌劑，所述發(fā)酵菌劑經(jīng)以下步驟制得 (1)將非解乳糖鏈球菌alactolyticus) LZMYFGM9 CGMCC No. 4227 菌株接入MRS培養(yǎng)基斜面進(jìn)行培養(yǎng)，接種量為IO3Cfu ； (2)將步驟(I)得到的培養(yǎng)物接入一級或二級種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)后得到發(fā)酵菌劑，接種量為 103cfu。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的發(fā)酵菌劑，所述步驟(I)的培養(yǎng)條件為時間16-20小時；環(huán)境厭氧發(fā)酵；溫度:36. 5-37. 50C ;初始pH :6. 0-6. 4。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的發(fā)酵菌劑，所述步驟(2)的培養(yǎng)條件為時間16-20小時；環(huán) 境厭氧發(fā)酵；溫度:36. 5-37. 5 0C ;初始pH :5. 5-5. 9。
5.權(quán)利要求I 所述非解乳糖鏈球菌alac toIyticus )LZMYFGM9 CGMCCNo. 4227在提取黃芪多糖中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明首次公開了一種非解乳糖鏈球菌(Streptococcusalactolyticus)LZMYFGM9，該菌株的保藏編號為CGMCCNo.4227，同時公開了包含該菌株的發(fā)酵菌劑及其應(yīng)用。本發(fā)明提出的非解乳糖鏈球菌(Streptococcusalactolyticus)LZMYFGM9CGMCCNo.4227可用于黃芪多糖的提取，該方法具有實(shí)用性強(qiáng)、操作簡便、效益高的優(yōu)點(diǎn)，具有廣闊的實(shí)際應(yīng)用前景。
文檔編號C12R1/46GK102676427SQ20121014182
公開日2012年9月19日 申請日期2012年5月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月9日
發(fā)明者孟嘉仁, 張凱, 張景艷, 李建喜, 楊志強(qiáng), 王學(xué)智 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所