專利名稱：立體選擇性α-羥酸脫氫酶的篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及立體選擇性a -羥酸脫氫酶的篩選方法。
背景技術(shù)：
立體選擇性a -羥酸脫氫酶為一類特殊的氧化還原酶，能立體選擇性催化外消旋a-羥羧酸類化合物中的一種異構(gòu)體生成相應(yīng)的a -酮酸，反應(yīng)液中留下另外一種異構(gòu)體(見下式)，由于產(chǎn)物中光學(xué)活性的a-羥酸與酮酸的性質(zhì)差異較大，易于分離。利用該酶可以用于生產(chǎn)手性的a-羥酸和酮酸，具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景。
權(quán)利要求
1.ー種立體選擇性α -羥酸脫氫酶的篩選方法，所述方法包括 (1)取待測含α-羥酸脫氫酶的樣品溶于pH 6 9的緩沖液中，添加結(jié)構(gòu)如式(I)所示的α -羥酸手性單體作為底物至底物終濃度為I IOOmM,于20 50°C水浴中進行轉(zhuǎn)化反應(yīng);
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，步驟(2)中呈現(xiàn)藍綠色時，所述方法進ー步包括步驟⑶和⑷ (3)另取呈現(xiàn)藍綠色的待測樣品溶于pH為6 9的緩沖液中，添加立體構(gòu)型與步驟(I)相反的手性単體作為底物至底物終濃度為I IOOmM,于20 50°C水浴中進行轉(zhuǎn)化反應(yīng)； (4)轉(zhuǎn)化反應(yīng)結(jié)束后，取轉(zhuǎn)化液按照步驟(2)方法進行顯色反應(yīng)，顯色反應(yīng)結(jié)束后，若呈現(xiàn)顏色均一的藍綠色，則表明待測樣品中含有的α-羥酸脫氫酶沒有立體選擇性；若呈現(xiàn)淡黃色，表明待測樣品中含有與步驟(I)底物的立體構(gòu)型一致的α-羥酸脫氫酶。
3.如權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于所述α-羥酸為苯基乳酸或?qū)αu基苯基乳酸。
4.如權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于所述pH6 9的緩沖液為pH7. 5 8. O的磷酸ニ氫鈉-磷酸氫ニ鈉緩沖液。
5.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述待測樣品為微生物菌體，所述方法如下 (A)取微生物菌體均勻分散于pH6.O 9. O的磷酸鹽緩沖液中，制成0D_值為5 10的菌懸液，添加結(jié)構(gòu)如式(I)所示α-羥酸的外消旋體作為底物至底物終濃度為I IOOmM,于20 50°C水浴中進行反應(yīng)，取轉(zhuǎn)化液10 μ L添加200 300 μ L的FeC13顯色劑溶液進行反應(yīng)5 30min，反應(yīng)結(jié)束后，呈現(xiàn)藍緑色的為α -羥酸脫氫酶陽性樣品，呈淡黃色的為α-羥酸脫氫酶陰性樣品； (B)另取脫氫酶陽性樣品兩份，溶于ρΗ7.5 8. O的磷酸ニ氫鈉-磷酸氫ニ鈉緩沖液中，各自添加手性的結(jié)構(gòu)如式(I)所示的R-或S-α-羥酸單體作為底物至底物終濃度為I lOOmM，于20 50°C水浴中進行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，轉(zhuǎn)化反應(yīng)結(jié)束后，取轉(zhuǎn)化液10 μ L添加200 300 μ L的FeCl3顯色劑溶液進行反應(yīng)5 30min，顯色反應(yīng)結(jié)束后，若僅有ー份呈現(xiàn)藍綠色，則表明樣品中所含的α-羥酸脫氫酶的光學(xué)選擇性與呈藍綠色樣品中添加的手性α-羥酸的立體構(gòu)型一致，若兩份轉(zhuǎn)化液均呈現(xiàn)藍綠色則表明樣品中所含的α-羥酸脫氫酶沒有光學(xué)選擇性； 所述FeCl3顯色劑溶液組成如下FeCl3*6H20 2mmol/L，ニ甲基亞砜400ml/L，冰醋酸 20ml/L，溶劑為水。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種立體選擇性α-羥酸脫氫酶的篩選方法。所述方法包括(1)取待測含α-羥酸脫氫酶的樣品溶于pH 6～9的緩沖液中，添加結(jié)構(gòu)如式(I)所示的α-羥酸手性單體作為底物，于20～50℃水浴中進行轉(zhuǎn)化反應(yīng)；(2)轉(zhuǎn)化反應(yīng)結(jié)束后，取轉(zhuǎn)化液添加FeCl3顯色劑溶液進行顯色反應(yīng)5～30min，反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)反應(yīng)液呈現(xiàn)的顏色判斷結(jié)果；本發(fā)明方法不需要對擬篩選的底物進行衍生化，能夠利用簡單的比色法快速鑒定所篩選的微生物的脫氫酶活性及光學(xué)選擇性，具有篩選流程簡單、速度快、設(shè)備要求低、通用性強等優(yōu)點，為以外消旋的扁桃酸及其相關(guān)衍生物為底物來進行生物酶法拆分獲得光學(xué)純的產(chǎn)品帶來了極大的便利。
文檔編號C12Q1/32GK102660631SQ201210109290
公開日2012年9月12日 申請日期2012年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月13日
發(fā)明者沈寅初, 王威, 薛亞平, 鄭裕國 申請人:浙江工業(yè)大學(xué)