專利名稱：一種利用dna甲基化的方法檢測苯丙酮尿癥的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于氨基酸代謝紊亂疾病診斷技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用DNA甲基化的方法檢測苯丙酮尿癥的試劑盒。
背景技術(shù)：
苯丙酮尿癥(PKU)是一種常染色體隱性遺傳病，涉及位于第12號染色體長臂上的苯丙氨酸羥化酶基因缺陷，導(dǎo)致肝臟內(nèi)苯丙氨酸羥化酶活性喪失，引起苯丙氨酸代謝障礙。苯丙酮尿癥在我國發(fā)病率約為1/11800。苯丙酮尿癥在遺傳上屬于單基因遺傳病，呈世界性分布，在人群中的發(fā)生率隨地區(qū)、種族而異，如日本1 70000、美國1 12000 1 18000，通過氨基酸分析發(fā)現(xiàn)苯丙酮尿癥患者血液苯丙氨酸含量高出正常人15倍。氨基酸是構(gòu)成生命大廈的磚石，人體各種體液中氨基酸組成的變化能夠直接反映機(jī)體的健康水平和營養(yǎng)狀況，并與多種病理過程有關(guān)。本發(fā)明的發(fā)明人臨床氨基酸分析25例PKU患者血清及85例正常人血清，發(fā)現(xiàn)PKU 患者血清精氨酸含量為(0.014士0.008)，正常人血清精氨酸含量為(0. 129 士0.014)數(shù)據(jù)顯示兩者差異明顯(P<0. 001)，提示PKU患者精氨酸合成障礙。肝臟是鳥氨酸循環(huán)的重要器官，鳥氨酸循環(huán)又稱“尿素循環(huán)”。是機(jī)體對氨的一種解毒方式。它的重要生物學(xué)意義是將體內(nèi)蛋白質(zhì)代謝產(chǎn)生的較高毒性的氨轉(zhuǎn)化為低毒的尿素，從而排出體外。肝臟是哺乳類動物生成尿素的主要器官，由于精氨酸代琥珀酸合成酶(ASS)的作用使精氨酸水解為鳥氨酸及尿素。而精氨酸代琥珀酸合成酶是鳥氨酸循環(huán)的關(guān)鍵酶之一。通過進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn) PKU患者精氨酸代琥珀酸合成酶基因的啟動子區(qū)域CpG島呈甲基化狀態(tài)，這也可能解釋為精氨酸合成障礙的原因。CpG島通常位于基因的啟動子區(qū)或是第一個外顯子區(qū)。健康人基因組中，CpG島中的CpG位點通常是處于非甲基化狀態(tài)，而在CpG島外的CpG位點則通常是甲基化的。這種甲基化的形式在細(xì)胞分裂的過程中能夠穩(wěn)定的保留。表遺傳學(xué)研究基因表達(dá)的變化，這種變化可通過減數(shù)分裂遺傳，但不涉及有關(guān)基因DNA序列的改變。表觀遺傳是一種沒有DNA序列變化并且可以遺傳的基因功能變化。甲基化是表遺傳修飾的一種重要形式，是基因型和表型間的重要紐帶。DNA甲基化受到DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的調(diào)控，并在細(xì)胞增殖分化的過程中，將基因的甲基化狀態(tài)遺傳給后代。真核生物DNA甲基化的差異，在基因表達(dá)的調(diào)節(jié)過程中以多種形式起著重要作用。隨著DNA甲基化研究方法的不斷發(fā)展和進(jìn)步， 人類正加快探索DNA甲基化的奧秘。DNA甲基化在遺傳等疾病的研究中取得進(jìn)展。甲基化已成為生物學(xué)研究的熱點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種利用DNA甲基化的方法檢測苯丙酮尿癥的試劑盒。本發(fā)明的目的還在于提供一種利用DNA甲基化的方法檢測苯丙酮尿癥的標(biāo)志物。本發(fā)明的目的還在于提供利用DNA甲基化的方法檢測苯丙酮尿癥的試劑盒的使用方法。
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一種利用DNA甲基化的方法檢測苯丙酮尿癥的試劑盒，包括dNTP、IOxPCR buffer、MgCl2、ddH20、Taq DNA 聚合酶、標(biāo)準(zhǔn)血液 DNA、引物 MSP-R、引物 MSP-L、引物 UMSP-R、 弓I物UMSP-L、弓I物BSP-Rl、引物BSP-Ll、弓|物BSP-R2、引物BSP-L2 ；所述弓|物MSP-R的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNo. 1所示，引物MSP-L的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 2所示，引物UMSP-R的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 3所示，引物UMSP-L的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 4所示，引物BSP-Rl的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 5所示，引物BSP-Ll的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 6所示，引物BSP-L2的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 7所示，引物BSP-R2的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 8所示；上述引物用于做甲基化特異性PCR，PCR時，引物的配對方案為引物MSP-R、MSP-L 配對，引物 UMSP-R、UMSP-L 配對，引物 BSP-Rl、BSP-Ll 配對，引物BSP-R2、BSP-L2配對，用于檢測ASS基因(GeneBankNGJ) 11542，精氨酸代琥珀酸合成酶基因)啟動子區(qū)甲基化情況。所述標(biāo)準(zhǔn)血液DNA為取自無苯丙酮尿癥健康人血液提取的基因組DNA并經(jīng)過重亞硫酸鹽處理。一種利用DNA甲基化的方法檢測苯丙酮尿癥的標(biāo)志物，所述標(biāo)志物為ASS基因 (GeneBank NG_011542，精氨酸代琥珀酸合成酶基因)甲基化的啟動子區(qū)域，該區(qū)域包括一個或多個甲基化的CpG島；所述ASSteeneBank NG_011542，精氨酸代琥珀酸合成酶基因) 基因甲基化的啟動子區(qū)域核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 9、SEQ ID No. 10和SEQ ID No. 11所示。利用DNA甲基化的方法檢測苯丙酮尿癥的試劑盒的使用方法，包括如下步驟(1)從血液樣品中提取基因組DNA ；(2)將基因組DNA經(jīng)重亞硫酸鹽處理，使未甲基化的胞嘧啶全部轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏ぃ?3)利用權(quán)利要求1所述試劑盒及引物配對方案，以ddH20、標(biāo)準(zhǔn)血液DNA、經(jīng)重亞硫酸鹽處理的血液樣品基因組DNA為模板，進(jìn)行甲基化特異性PCR反應(yīng)；(4)用1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR結(jié)果，如果以ddH20、標(biāo)準(zhǔn)血液DNA為模板的 PCR無擴(kuò)增條帶，而以經(jīng)重亞硫酸鹽處理的血液樣品基因組DNA為模板的PCR擴(kuò)增有擴(kuò)增條帶，且擴(kuò)增條帶與預(yù)測的條帶大小一致，則認(rèn)為所檢測的血液樣品來自苯丙酮尿癥患者。本發(fā)明的有益效果采用本發(fā)明的試劑盒，通過檢測ASS基因啟動子區(qū)的甲基化情況判斷基因的表達(dá)情況，配合體內(nèi)精氨酸含量的測量，進(jìn)而能夠提前預(yù)測苯丙酮尿癥的患病概率，及時采取預(yù)防措施，減輕苯丙酮尿癥患者的痛苦。


圖1為苯丙酮尿癥患者和正常人血清中精氨酸的含量。圖2為Ass基因啟動子區(qū)DNA甲基化PCR擴(kuò)增(MSP)；圖中，1為ddH20對照、2-3為正常人血清DNA、4_7為苯丙酮尿癥患者血清DNA。圖3為Ass基因啟動子區(qū)DNA甲基化PCR擴(kuò)增(BSP)。圖4為Ass基因CpG島區(qū)域在正常人和苯丙酮尿癥患者的BSP測序結(jié)果；圖中，白點為CpG非甲基化位點，黑點為CpG甲基化位點，苯丙酮尿癥患者甲基化位點在+45 ；-118。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。以下實施例未說明的實驗步驟參照《分子克隆實驗指南》第三版，或參照相應(yīng)試劑盒的說明書。以下實施例使用的Taq DNA聚合酶購自invitrogen公司，大腸桿菌菌株T0P10購自北京TIANGEN公司，DNA提取kit購自Qiagen公司，DNA甲基化kit購自ZYMO RESEARCH 公司。實施例1生物樣本選擇及其氨基酸分析選擇山西省婦幼保健院提供的17例苯丙酮尿癥患者為實驗對象。年齡8個月 10歲，根據(jù)新生兒疾病篩查方法，嬰兒出生72h取足跟部血，發(fā)現(xiàn)血液苯丙氨酸濃度> 120ymol/L(2mg/dL)時，診斷為高苯丙氨酸血癥，均無并發(fā)癥和其他基礎(chǔ)疾病。由院方告之家長同意后取血。體質(zhì)量均正常。835型全自動氨基酸分析儀(日立公司)，氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma公司)。取苯丙酮尿癥患者空腹靜脈血lmL，3000r/min 15min,取血清0. 5mL與 5%的磺基水揚(yáng)酸1 1混勻，充分振搖，離心機(jī)lOOOOr/min，IOmin,取上清液，直接進(jìn)行氨基酸含量分析。分析17例苯丙酮尿癥患者血清和38例正常人血清，數(shù)據(jù)采用SPSS 10. 0軟件作統(tǒng)計學(xué)處理，Excel作圖，采用t檢驗，結(jié)果見圖1，苯丙酮尿癥患者血清中的精氨酸含量顯著低于正常人血清的含量。實施例2引物設(shè)計(1)根據(jù)ASS基因(GeneBank NG_011542，精氨酸代琥珀酸合成酶基因)序列，篩選甲基化靶序列區(qū)域，其堿基序列如SEQ ID No. 9、SEQ ID No. 10和SEQ ID No. 11所示。(2)根據(jù)SEQ ID No. 9,SEQ ID No. 10和SEQ ID No. 11所示的甲基化靶序列和特異性甲基化位點，使用“MethPrimer ”軟件，設(shè)計甲基化PCR的特異性引物序列如下MSP-R :5，-TAGGAGGTAAGTTTTTCGAAGGAC-3，(SEQ ID No. 1)；MSP-L :5，-GATTCCTAACCCTAACCCGC-3，(SEQ ID No. 2)；UMSP-R :5，-GTTAGGAGGTAAGTTTTTTGAAGGAT-3，(SEQ ID No. 3)；UMSP-L :5，-CAATTCCTAACCCTAACCCA-3，(SEQ ID No. 4)；BSP-Rl :5，-TATTAGAGGTTATGGTTGGGGAG-3，(SEQ ID No. 5)；BSP-Ll :5，-CCCAAATCTCCATATAAAAACTTCA-3‘ (SEQ ID No. 6)；BSP-R2 5' -GGTTTTGGGGGTTGTAGAAGGTT-3，(SEQ ID No. 7)；BSP-L2 5' -AAAACCCCTTCCCTCCTACCTC-3，(SEQ ID No. 8)。實施例3血液樣品中DNA的提取和甲基化修飾抽取正常人和苯丙酮尿癥患者足跟部血液各200 μ L，按照Qiagen kit試劑盒說明書進(jìn)行DNA提取，紫外分光光度計測定A260，計算含量。將提取的DNA按照DNA甲基化kit試劑盒說明書進(jìn)行DNA的甲基化修飾(重亞硫酸鹽處理)，經(jīng)重亞硫酸鹽處理使未甲基化的胞嘧啶全部轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏?，甲基化的胞嘧啶保持不變，未甲基化的胞嘧啶全部轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變。實施例4甲基化特異性PCR
以無苯丙酮尿癥人血液提取并經(jīng)重亞硫酸鹽處理的DNA和ddH20為對照模板，苯丙酮尿癥患者血液提取并經(jīng)重亞硫酸鹽處理的DNA為模板，采用下述方案做甲基化特異性 PCR 引物MSP-R、MSP-L配對，引物UMSP-R、UMSP-L配對檢測ASS基因啟動子區(qū)的甲基
化情況，反應(yīng)體系如下
10 X PCR buffer2μ1 IOmMdNTP0.5μ1 上游引物(ΙΟμΜ)0.5μ1 下游引物(ΙΟμΜ)0.5μ1
模板 DNA2μ1 TaqDNA 聚合酶0.25μ1 _ddH20_14.25μ1
Total20μ1PCR 反應(yīng)過程為:94°C，3min ；然后 94°C，30s ；55°C, 30s ；72°C，60s，反應(yīng) 32 個循環(huán)；72°C延伸 IOmin0擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1. 0% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠(0. 5mg/L溴化乙錠)電泳(如圖2所示)，引物MSP-R、MSP-L擴(kuò)增產(chǎn)物長度為116bp(SEQ ID No. 9)，UMSP-R、UMSP_L擴(kuò)增產(chǎn)物長度為 119bp(SEQ ID No. 10)。引物BSP-Rl、BSP-Ll配對，引物BSP-R2、BSP-L2配對進(jìn)行巢式PCR檢測ASS基因啟動子區(qū)的甲基化情況，反應(yīng)分兩輪進(jìn)行第一輪PCR，引物為BSP-Rl、BSP-Ll，反應(yīng)體系如下
10 X PCR buffer2μ1IOmMdNTP0.5μ1 上游引物(ΙΟμΜ)0.5μ1 下游引物(ΙΟμΜ)0.5μ1
模板DNA2μ1TaqDNA 聚合酶0.25μ1 _ddH2Q_14.25μ1
Total20μ1PCR 反應(yīng)過程為95°C，3min ；然后 94°C，30s ；62°C, 30s ；72°C，60s，反應(yīng) 32 個循環(huán)；72°C 延伸 5min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1. 0% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠(0. 5mg/L溴化乙錠)電泳(如圖3所示)，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為950bp (SEQ ID No. 11)。第二輪PCR，引物為BSP-R2、BSP-L2，模板為第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋100倍，取Iul反應(yīng)體系如下
PCR 反應(yīng)過程為95°C，3min ；然后 94°C，30s ；62°C, 30s ；72°C，60s，反應(yīng) 32 個循環(huán)；72°C 延伸 5min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1. 0% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠(0. 5mg/L溴化乙錠)電泳，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為 721bp(SEQ ID No. 12)。實施例4PCR產(chǎn)物TA克隆、細(xì)菌轉(zhuǎn)化與克隆測序按照Trans GenPpEASY2TVector試劑盒說明進(jìn)行載體連接和細(xì)菌轉(zhuǎn)化，藍(lán)白斑篩選陽性克隆并以白斑菌液為模板，利用通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選插入目的片段的陽性 克隆。PCR反應(yīng)體系2. 0μ 1 IOX緩沖液、0.5μ1 dNTP、上下游引物10 μ mol/1各 0· 5μ 1、0· 25μ 1 DNA Taq 酶、14. 25 μ 1 ddH20 和 2 μ 1 模板。PCR 反應(yīng)條件94°C預(yù)變性 3min，94°C 30s，55°C 30s, 72°C 60s, 32 個循環(huán)；72°C延伸lOmin。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠(0. 5mg/L溴化乙錠)電泳。將陽性克隆菌液100 μ 1送TIANGEN生化科技(北京)有限公司測序。測序結(jié)果如圖4所示，白點為CpG非甲基化位點，黑點為CpG甲基化位點，苯丙酮尿癥患者甲基化位點在+45 ；-118。
權(quán)利要求
1.一種利用DNA甲基化的方法檢測苯丙酮尿癥的試劑盒，包括dNTP、IOxPCR buffer、 MgCl2, ddH20、Taq DNA聚合酶，其特征在于，還包括標(biāo)準(zhǔn)血液DNA、引物MSP-R、引物MSP-L、 弓I物UMSP-R、弓I物UMSP-L、弓|物BSP-Rl、引物BSP-Ll、引物BSP-R2、引物BSP-L2 ；所述引物 MSP-R的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 1所示，引物MSP-L的核苷酸序列如序列表中 SEQ ID No. 2所示，引物UMSP-R的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 3所示，引物UMSP-L 的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 4所示，引物BSP-Rl的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 5所示，引物BSP-Ll的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 6所示，引物BSP-L2的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 7所示，引物BSP-R2的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 8所示；上述引物用于做甲基化特異性PCR，PCR時，引物的配對方案為引物MSP-R、MSP-L配對，引物UMSP-R、UMSP-L配對，引物BSP-Rl、BSP-Ll配對，引物 BSP-R2、BSP-L2配對，用于檢測ASS基因(GeneBankNGJ)11542，精氨酸代琥珀酸合成酶基因)啟動子區(qū)甲基化情況。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種利用DNA甲基化的方法檢測苯丙酮尿癥的試劑盒，其特征在于，所述標(biāo)準(zhǔn)血液DNA為取自無苯丙酮尿癥健康人血液提取的基因組DNA并經(jīng)過重亞硫酸鹽處理。
3.一種利用DNA甲基化的方法檢測苯丙酮尿癥的標(biāo)志物，其特征在于，所述標(biāo)志物為 ASS基因(GeneBank NG_011542，精氨酸代琥珀酸合成酶基因)甲基化的啟動子區(qū)域，該區(qū)域包括一個或多個甲基化的CpG島；所述ASS (GeneBankNGJ)11542，精氨酸代琥珀酸合成酶基因)基因甲基化的啟動子區(qū)域核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 9,SEQ ID No. 10和SEQ ID No. 11 所示。
4.權(quán)利要求1所述利用DNA甲基化的方法檢測苯丙酮尿癥的試劑盒的使用方法，其特征在于，包括如下步驟(1)從血液樣品中提取基因組DNA;(2)將基因組DNA經(jīng)重亞硫酸鹽處理，使未甲基化的胞嘧啶全部轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏ぃ?3)利用權(quán)利要求1所述試劑盒及引物配對方案，以ddH20、標(biāo)準(zhǔn)血液DNA、經(jīng)重亞硫酸鹽處理的血液樣品基因組DNA為模板，進(jìn)行甲基化特異性PCR反應(yīng)；(4)用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR結(jié)果，如果以ddH20、標(biāo)準(zhǔn)血液DNA為模板的PCR 無擴(kuò)增條帶，而以經(jīng)重亞硫酸鹽處理的血液樣品基因組DNA為模板的PCR擴(kuò)增有擴(kuò)增條帶， 且擴(kuò)增條帶與預(yù)測的條帶大小一致，則認(rèn)為所檢測的血液樣品來自苯丙酮尿癥患者。
全文摘要
本發(fā)明屬于氨基酸代謝紊亂疾病診斷技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用DNA甲基化的方法檢測苯丙酮尿癥的試劑盒。采用本發(fā)明的試劑盒，通過檢測ASS基因啟動子區(qū)的甲基化情況判斷基因的表達(dá)情況，配合體內(nèi)精氨酸含量的測量，能夠提前預(yù)測苯丙酮尿癥的患病概率，及時采取預(yù)防措施，減輕苯丙酮尿癥患者的痛苦。
文檔編號C12Q1/68GK102424856SQ20111044986
公開日2012年4月25日 申請日期2011年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月9日
發(fā)明者周柔麗, 李莉, 楊華, 林明, 肖軍軍, 邵根澤 申請人:北京大學(xué)