專利名稱：從海水中馴化與篩選石油烴降解菌群的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于受溢油污染海水的生物降解處理技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種從海水中馴化與篩選石油烴降解菌群的方法。
背景技術(shù)：
近年來，隨著世界各國對石油及其制品日漸增長的需求，在海上開采、裝卸、運輸以及利用石油過程中溢油事故時有發(fā)生，不但造成大量的原油流失，還對環(huán)境造成嚴重污染，日趨嚴重地威脅著海洋及陸域的生態(tài)環(huán)境，對海洋環(huán)境、自然資源和養(yǎng)殖資源等都有長期的危害，因此，海洋溢油污染已經(jīng)成為人們必須面對的重大環(huán)境問題。在海洋溢油處理技術(shù)中，生物修復(fù)技術(shù)具有高效、經(jīng)濟、安全、無二次污染等特點，已成為現(xiàn)場去除海洋溢油污染的重要選擇途徑，特別是對機械裝置無法清除的薄油層，同時又限制使用化學藥劑時，運用生物修復(fù)可顯出其更大的優(yōu)越性。若在海洋溢油處理修復(fù)工程中使用內(nèi)源微生物進行降解，由于內(nèi)源微生物生長速度慢及活性低而修復(fù)的效率不高，因此，需要接種一些降解石油烴污染物的高效菌，即通過向海洋溢油環(huán)境中加入大量的可存活的并能表現(xiàn)降解活性的石油烴降解菌，以提高海洋中石油污染物的降解速率和程度。然而由于缺少高效的可應(yīng)用于海洋溢油處理的石油烴降解菌，制約了海洋溢油生物修復(fù)技術(shù)的進一步發(fā)展和應(yīng)用。因此，需要從海水中馴化與篩選出降解速率較快的土著微生物菌群，然后再把它們應(yīng)用于實際海洋溢油污染環(huán)境的生物治理，這對于治理和修復(fù)海洋溢油污染有重要的意義。但是常規(guī)馴化與篩選微生物菌群的技術(shù)無法適用于對海洋溢油污染環(huán)境處理的石油烴微生物群的馴化與篩選。而且馴化的環(huán)境條件，馴化周期，及馴化的過程參數(shù)選定等都對馴化出菌群的降解效能有密切的關(guān)系，這些都需要經(jīng)過一系列的試驗研究后才能確定出最佳范圍。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的提供一種從海水中馴化與篩選石油烴降解菌群的方法。其具體步驟如下(1)選取海水樣品2000mL，放置于4°C冰箱中保存?zhèn)溆茫?2)向體積為IOOOmL的開口玻璃瓶中加入4. 5 5. Og原油，加入7mL正己烷溶解后均勻平鋪于玻璃瓶瓶底，為除去正己烷將玻璃瓶開口放置3天；(3)向步驟O)的開口玻璃瓶中加入500 600mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基、5. OmL微量金屬液和0.5mL維生素c溶液；然后加入步驟(1)中的海水樣品50mL;然后置于溫度為10 15°C的環(huán)境中在轉(zhuǎn)速為lOOr/min的條件下攪拌富集馴化培養(yǎng)10 12個月，為維持玻璃瓶內(nèi)液體總量不變，每隔一周補充步驟(1)中海水樣品；其中基礎(chǔ)培養(yǎng)基的組成為=NH4NO3 2. Og .IANaCl 10. 5g/L, KH2PO4 :2. 5g .171 ,FeCl3 :0. IOg .171 ,MgSO4 :3. 5g ·Γ1，CaCl2 ·2Η20 0. 15g · L—1 ；微量金屬液的組成為=CoCl2 · 6H20 :45mg · Λ CuCl2 :0. 25mg · Λ H3BO3 6. 5mg · ΙΛ MnCl2 · 4H20 :35mg · Λ Na2MoO4 · 2H20 :3. 5mg · Λ NiCl2 · 2H20 :2. 5mg · Λ ZnCl2 :3. 5mg · L-1 ；(4)向體積為100 200mL的錐形瓶中加入0. 5g原油，加入2mL正己烷溶解后均勻平鋪于錐形瓶瓶底，為除去正己烷將玻璃瓶開口放置2天；(5)按水與有機大孔吸附劑DlOl的質(zhì)量比為5 1的比例用去離子水將吸附劑清洗5次，然后按乙醇與吸附劑的質(zhì)量比為3 1的比例用99%的乙醇將吸附劑清洗3次，為徹底除去吸附劑中的乙醇將清洗后的吸附劑在溫度為60°C的烘箱中放置2天；(6)向步驟中的錐形瓶中入50mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基、0. 5mL微量金屬液和0. ImL維生素c溶液；(7)向步驟(6)中的錐形瓶內(nèi)加入步驟(5)處理后的吸附劑0. 50g，將其密封后放置在轉(zhuǎn)速為lOOr/min的振蕩器中平衡2天；(8)向步驟(7)中的錐形瓶內(nèi)接入步驟(3)馴化結(jié)束后的水樣lmL，然后置于溫度為10 15°C轉(zhuǎn)速為lOOr/min的振蕩器中培養(yǎng)6 8天，每天打開瓶口一次以恢復(fù)錐形瓶內(nèi)的溶解氧；按接種體積比為50 1的比例轉(zhuǎn)入另一按步驟(4)至(7)處理后的錐形瓶內(nèi)，當轉(zhuǎn)接次數(shù)大于6之后即可獲得高效去除溢油污染海水中石油烴的降解菌群。本發(fā)明的有益效果是所述的方法能夠富集與馴化篩選到高效去除溢油污染海水中石油烴的降解菌群。
具體實施例方式本發(fā)明提供一種從海水中馴化與篩選石油烴降解菌群的方法。向加入原油、基礎(chǔ)培養(yǎng)基、微量金屬液、維生素c溶液的開口玻璃瓶內(nèi)加入海水樣品進行石油烴降解菌群的富集與馴化10 12個月，然后向加入原油、基礎(chǔ)培養(yǎng)基、微量金屬液和維生素c溶液的錐形瓶內(nèi)接入富集馴化的海水樣品。在溫度為10 15°C、轉(zhuǎn)速為lOOr/min的振蕩器中培養(yǎng) 6 8天后，進行循環(huán)轉(zhuǎn)接，在循環(huán)次數(shù)大于6次后即可得到高效去除溢油污染海水中石油烴的降解菌群。下面是以運用馴化的石油烴的降解菌群進行了溢油污染海水中石油烴的降解試驗，進一步說明本發(fā)明。實施例運用本發(fā)明方法馴化與篩選得到的石油烴降解菌群進行了溢油污染海水中石油烴的降解試驗，結(jié)果表明該菌群能夠?qū)κ蜔N進行有效的降解當石油烴的初始濃度為 6. 9g/L時，6天后能降解到2. lg/L，對石油烴的降解率可達到69. 56%。
權(quán)利要求
1. 一種從海水中馴化與篩選石油烴降解菌群的方法，其特征在于，該方法的具體步驟如下(1)選取海水樣品2000mL，放置于4°C冰箱中保存?zhèn)溆茫?2)向體積為IOOOmL的開口玻璃瓶中加入4.5 5. Og原油，加入7mL正己烷溶解后均勻平鋪于玻璃瓶瓶底，為除去正己烷將玻璃瓶開口放置3天；(3)向步驟⑵的開口玻璃瓶中加入500 600mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基、5.OmL微量金屬液和 0.5mL維生素c溶液；然后加入步驟(1)中的海水樣品50mL;然后置于溫度為10 15°C 的環(huán)境中在轉(zhuǎn)速為lOOr/min的條件下攪拌富集馴化培養(yǎng)10 12個月，為維持玻璃瓶內(nèi)液體總量不變，每隔一周補充步驟⑴中海水樣品；其中基礎(chǔ)培養(yǎng)基的組成為=NH4NO3: 2. Og .IANaCl 10. 5g/L, KH2PO4 :2. 5g .171 ,FeCl3 :0. IOg .171 ,MgSO4 :3. 5g ·Γ1，CaCl2 ·2Η20 0. 15g · L—1 ；微量金屬液的組成為=CoCl2 · 6H20 :45mg · Λ CuCl2 :0. 25mg · Λ H3BO3 6. 5mg · ΙΛ MnCl2 · 4H20 :35mg · Λ Na2MoO4 · 2H20 :3. 5mg · Λ NiCl2 · 2H20 :2. 5mg · Λ ZnCl2 :3. 5mg · L-1 ；(4)向體積為100 200mL的錐形瓶中加入0.5g原油，加入2mL正己烷溶解后均勻平鋪于錐形瓶瓶底，為除去正己烷將玻璃瓶開口放置2天；(5)按水與有機大孔吸附劑DlOl的質(zhì)量比為5 1的比例用去離子水將吸附劑清洗5 次，然后按乙醇與吸附劑的質(zhì)量比為3 1的比例用99%的乙醇將吸附劑清洗3次，為徹底除去吸附劑中的乙醇將清洗后的吸附劑在溫度為60°C的烘箱中放置2天；(6)向步驟中的錐形瓶中入50mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基、0.5mL微量金屬液和0.ImL維生素 c溶液；(7)向步驟(6)中的錐形瓶內(nèi)加入步驟( 處理后的吸附劑0.50g，將其密封后放置在轉(zhuǎn)速為lOOr/min的振蕩器中平衡2天；(8)向步驟(7)中的錐形瓶內(nèi)接入步驟(3)馴化結(jié)束后的水樣lmL，然后置于溫度為 10 15°C轉(zhuǎn)速為lOOr/min的振蕩器中培養(yǎng)6 8天，每天打開瓶口一次以恢復(fù)錐形瓶內(nèi)的溶解氧；按接種體積比為50 1的比例轉(zhuǎn)入另一按步驟(4)至(7)處理后的錐形瓶內(nèi)， 當轉(zhuǎn)接次數(shù)大于6之后即可獲得高效去除溢油污染海水中石油烴的降解菌群。
全文摘要
本發(fā)明公開了屬于受溢油污染海水的生物降解處理技術(shù)領(lǐng)域的一種從海水中馴化與篩選石油烴降解菌群的方法。向加入原油、基礎(chǔ)培養(yǎng)基、微量金屬液、維生素c溶液的開口玻璃瓶內(nèi)加入海水進行石油烴降解菌群的富集與馴化10～12個月，然后向加入原油、基礎(chǔ)培養(yǎng)基、微量金屬液和維生素c溶液的錐形瓶內(nèi)接入富集馴化的海水樣品。在溫度為10～15℃、轉(zhuǎn)速為100r/min的振蕩器中培養(yǎng)6～8天后，進行循環(huán)轉(zhuǎn)接，在循環(huán)次數(shù)大于6次后即可得到高效去除溢油污染海水中石油烴的降解菌群。
文檔編號C12N1/26GK102329767SQ201110282069
公開日2012年1月25日 申請日期2011年9月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月22日
發(fā)明者丁愛中, 李帥冉, 王鴻婷, 程莉蓉, 范福強, 豆俊峰, 鄭蕾, 馬夢嬌 申請人:北京師范大學