專利名稱：用于dmo的有效靶向的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物生物技術(shù)領(lǐng)域。更具體的說(shuō)，本發(fā)明涉及允許有效加工和定位植物中的麥草畏單加氧酶的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的鑒定和用途。相關(guān)技術(shù)描述DMO (麥草畏單加氧酶)在植物中催化除草劑麥草畏(3，6-二氯-鄰茴香酸)降解為無(wú)毒的3，6_ 二氯水楊酸(3，6-DCSA)，從而賦予除草劑耐受性。DMO的活性需要用于將電子從NADH向麥草畏轉(zhuǎn)移的兩種中間蛋白質(zhì)還原酶和鐵氧還蛋白(美國(guó)專利7，022，896 ； Herman等人，200 。然而，轉(zhuǎn)基因植物中的麥草畏耐受性已通過(guò)單獨(dú)用DMO轉(zhuǎn)化得到證明， 表明植物內(nèi)源性的還原酶和鐵氧還蛋白可以在電子轉(zhuǎn)移中代替。參與電子轉(zhuǎn)移的植物鐵氧還蛋白位于質(zhì)體中。因此，為了獲得DMO的高效性能并因此獲得提高的麥草畏耐受性，需要將DMO靶向至葉綠體。在許多情況下，這種靶向可以通過(guò)被稱作葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽(CTP)或者質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的 N-末端延伸的存在而實(shí)現(xiàn)。如果表達(dá)的多肽將要在植物質(zhì)體(如葉綠體)中區(qū)室化，細(xì)菌來(lái)源的染色體轉(zhuǎn)基因必須具有與編碼表達(dá)的多肽的序列相融合的編碼CTP序列的序列。因此，將外源多肽定位到葉綠體中通常是借助于將編碼CTP序列的多核苷酸序列可操作地連接到編碼外源多肽的多核苷酸的5’區(qū)域上來(lái)完成的。CTP在向質(zhì)體內(nèi)轉(zhuǎn)移過(guò)程中通過(guò)加工步驟被去除。但是，加工效率可能受CTP的氨基酸序列和肽氨基端附近的序列影響。Weeks等人(美國(guó)專利7，022, 896)描述了玉米cab_m7信號(hào)序列(參見(jiàn)，Becker 等人，1992和PCT WO 97/41228 ；GenBank登記號(hào)X53398)和豌豆谷胱甘肽還原酶信號(hào)序列 (Creissen等人，1992和PCT WO 97/41228)在將DMO靶向至植物質(zhì)體方面的潛在用途，但是沒(méi)有給出關(guān)于加工或者靶向效率的數(shù)據(jù)。含有包括豌豆核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶 (Rubisco)小亞基編碼序列的27個(gè)氨基酸序列的豌豆核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶小亞基(RbcS) CTP，也已經(jīng)用于將DMO靶向至葉綠體(例如，美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)60/811，152)。然而， 已經(jīng)在蛋白質(zhì)印跡(Western blot)分析過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，這種豌豆RbcS CTP產(chǎn)生一個(gè)正確加工的DMO蛋白質(zhì)條帶( 38 kDa)，但是還產(chǎn)生一個(gè)與DMO和RbcS編碼區(qū)的27個(gè)氨基酸相對(duì)應(yīng)的較大的條帶( 41kDa)。額外的氨基酸可能不利地影響DMO的活性。此外，由于 DMO的不完全加工，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中額外的蛋白質(zhì)造成監(jiān)管方面的障礙，為了使產(chǎn)品在政府機(jī)構(gòu)注冊(cè)的目的，還需要在產(chǎn)品表征方面投入額外的努力，由此增加了產(chǎn)品注冊(cè)的費(fèi)用。因此，需要鑒定有效地產(chǎn)生正確加工的DMO的CTP，從而提供完全的DMO活性以及易于表征產(chǎn)品的優(yōu)點(diǎn)。
發(fā)明概述本發(fā)明的一方面涉及一種重組DNA分子，其包括可操作地連接到編碼麥草畏單加氧酶的核苷酸序列上的編碼葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的核苷酸序列，其中，該核苷酸序列編碼包括選自SEQ ID NOs :1-11的序列的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽。在某些實(shí)施方案中，重組DNA分子包括選自SEQ ID NOs 12-22的核苷酸序列。在某些實(shí)施方案中，重組DNA分子包括編碼選自SEQ IDNOs :24、沈、28、30、32、34、36、38和40的麥草畏單加氧酶的核苷酸序列。包括與在植物細(xì)胞中具有功能的啟動(dòng)子可操作地連接的DNA分子的DNA構(gòu)建體也是本發(fā)明的一方面。另一方面，本發(fā)明包括用DNA分子轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，所述DNA分子包括可操作地連接到編碼麥草畏單加氧酶的核苷酸序列上的編碼葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的核苷酸序列，其中，葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列選自SEQ ID NOs =I-Il0在某些實(shí)施方案中，重組DNA分子包括選自SEQ ID NOs 12-22的核苷酸序列。在某些實(shí)施方案中，DNA分子包括編碼選自SEQ ID NOs =24,26, 觀、30、32、34、36、38和40的麥草畏單加氧酶的核苷酸序列，其中，DNA分子可操作地連接到在植物細(xì)胞中具有功能的啟動(dòng)子上。在特定的實(shí)施方案中，DNA分子包括選自SEQ ID NOs 23、25、27、29、31、33、35、37 和 39 的核苷酸序列。在某些實(shí)施方案中，植物細(xì)胞是雙子葉植物細(xì)胞。在其它實(shí)施方案中，植物細(xì)胞是單子葉植物細(xì)胞。在特定的實(shí)施方案中，植物細(xì)胞是大豆、棉花、玉米或者油菜籽植物細(xì)胞。 本發(fā)明也涉及包括這樣的細(xì)胞的植物組織培養(yǎng)物，涉及包括這樣的細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因種子和轉(zhuǎn)基因植物。在某些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因種子或者植物是雙子葉種子或植物。在其它實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因種子或者植物是單子葉種子或者植物。轉(zhuǎn)基因種子或者植物可以是大豆、棉花、 玉米或者油菜籽種子或者植物。本發(fā)明進(jìn)一步涉及產(chǎn)生耐受麥草畏的植物的方法，包括將重組DNA分子引入植物細(xì)胞中，并由其再生植物，所述DNA分子包括可操作地連接到編碼麥草畏單加氧酶的核苷酸序列上的編碼葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的核苷酸序列，其中，編碼葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的序列選自SEQ ID NOs :12-22。在某些實(shí)施方案中，重組DNA分子包含編碼選自SEQ ID NOs :24,26,28,30, 32、34、36、38和40的麥草畏單加氧酶的核苷酸序列。DNA分子可以可操作地連接到在植物細(xì)胞中具有功能的啟動(dòng)子上。該方法可以進(jìn)一步包括通過(guò)將親本植株與它自身或者第二植株雜交產(chǎn)生耐受麥草畏的植物，其中親本植株和/或第二植株包括所述DNA構(gòu)建體，并且耐受麥草畏的植物從所述的親本植株和/或第二植株遺傳了該DNA構(gòu)建體。一種在植物細(xì)胞中表達(dá)麥草畏單加氧酶的方法是本發(fā)明的進(jìn)一步的方面，該方法包括將選擇的CTP可操作地連接到編碼麥草畏單加氧酶的序列上。另一方面，本發(fā)明涉及一種在農(nóng)作物生長(zhǎng)環(huán)境中控制雜草生長(zhǎng)的方法，包括種植這樣的植物或其種子，并向農(nóng)作物生長(zhǎng)環(huán)境施用有效控制雜草生長(zhǎng)的量的麥草畏除草劑。 麥草畏除草劑可以自上方向農(nóng)作物生長(zhǎng)環(huán)境施用，由此麥草畏除草劑的量不損傷所述的植物或其種子，卻損傷與該植物或其種子基因型相同但是缺乏構(gòu)建體的植物或者種子。本發(fā)明的進(jìn)一步的方面涉及生產(chǎn)食物、飼料或者工業(yè)產(chǎn)品的方法，包括a)獲得植物，該植物包括按照5’到3’的方向可操作地連接到編碼葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的核苷酸序列和編碼麥草畏單加氧酶的核苷酸序列或其部分上的編碼在植物細(xì)胞中具有功能的啟動(dòng)子的核苷酸序列；b)從所述植物或其部分制備食物、飼料、纖維或者工業(yè)產(chǎn)品。在該方法的某些實(shí)施方案中，食物或者飼料是谷物、粗粉、油、淀粉、面粉或者蛋白
4質(zhì)。在該方法的其它的實(shí)施方案中，工業(yè)產(chǎn)品是生物燃料、纖維、工業(yè)化學(xué)品、藥物或者營(yíng)養(yǎng)品 針對(duì)出土前(pre emergence)施用麥草畏提供保護(hù)的、包括可操作地連接到編碼麥草畏單加氧酶的DNA上的編碼葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的DNA的耐受麥草畏的種子，是本發(fā)明的進(jìn)一步的方面。在某些實(shí)施方案中，耐受麥草畏的種子包括編碼葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的核苷酸序列， 例如選自SEQ ID NOs :12-22的核苷酸序列。耐受麥草畏的種子可以進(jìn)一步包括編碼選自 SEQ ID NOs :M、26J8、30、32、34、36、38和40的麥草畏單加氧酶的核苷酸序列。本發(fā)明的另一方面涉及提高單子葉植物的直立能力(standability)的方法，包括a)獲得并培育通過(guò)將親本植株與它自身或者第二植株雜交產(chǎn)生的植物，其中該親本植株和/或第二植株包含所述DNA構(gòu)建體并且耐受麥草畏的植物從所述的親本植株和/或第二植株遺傳了該DNA構(gòu)建體；b)用麥草畏處理植物。在某些實(shí)施方案中，植物是玉米植物。 在其它的實(shí)施方式中，可以測(cè)量包括支柱根的形狀、數(shù)量、長(zhǎng)度和/或結(jié)構(gòu)、倒伏百分比和產(chǎn)量的與直立能力相關(guān)的參數(shù)。本發(fā)明提供以下實(shí)施方案1. 一種重組DNA分子，其包括可操作地連接到編碼麥草畏單加氧酶的DNA序列上的編碼葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的DNA序列，其中，編碼葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的DNA序列編碼選自SEQ ID NOs 1-11的序列。2.如第1項(xiàng)所述的重組DNA分子，其中，所述編碼葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的DNA序列包括選自 SEQID NOs 12-22 的序列。3. 一種重組DNA分子，其包括可操作地連接到編碼麥草畏單加氧酶的DNA序列上的編碼葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的DNA序列，其中，編碼葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的DNA序列編碼選自擬南芥5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶CTP2葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列和豌豆核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶小亞基葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列的序列。4.如第1項(xiàng)所述的重組DNA分子，其包括可操作地連接到編碼麥草畏單加氧酶的 DNA序列上的編碼葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的DNA序列，其中，編碼葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的DNA序列編碼選自 SEQ ID NOs 2-7 的序列。5.如第1項(xiàng)所述的重組DNA分子，其包括可操作地連接到編碼麥草畏單加氧酶的 DNA序列上的編碼葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的DNA序列，其中，編碼葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的DNA序列編碼選自 SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 4 和 SEQ ID NO 5 的序列。6.如第1項(xiàng)所述的重組DNA分子，其包括可操作地連接到編碼麥草畏單加氧酶的 DNA序列上的編碼葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的DNA序列，其中，編碼葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的DNA序列包括選自 SEQ ID NOs 13-18 的序列。7.如第1項(xiàng)所述的重組DNA分子，其包括可操作地連接到編碼麥草畏單加氧酶的 DNA序列上的編碼葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的DNA序列，其中，編碼葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的DNA序列包括選自 SEQ ID NOs 13,15 和 16 的序列。8.如第1項(xiàng)所述的重組DNA分子，其中，所述編碼麥草畏單加氧酶的DNA序列編碼選自 SEQ ID NOs :24、26、28、30、32、34、36、38 和 40 的多月太。9.如第8項(xiàng)所述的重組DNA分子，其中，所述DNA序列選自SEQ ID NOs :23、25、 27、29、31、33、35、37 和 39。
10. 一種DNA構(gòu)建體，其包括與啟動(dòng)子可操作地連接的如第1項(xiàng)所述的DNA分子。11.如第5項(xiàng)所述的DNA構(gòu)建體，其中，所述啟動(dòng)子選自FMV35S啟動(dòng)子、At. ANTl 啟動(dòng)子、FMV. 35S-EFla啟動(dòng)子、eIF4A10啟動(dòng)子、AGRtu. nos啟動(dòng)子、水稻胞質(zhì)磷酸丙糖異構(gòu)酶(OsTPI)啟動(dòng)子、水稻肌動(dòng)蛋白15基因(0sActl5)啟動(dòng)子和Y _薏苡醇溶蛋白啟動(dòng)子。12.如第10項(xiàng)所述的構(gòu)建體，其中，所述啟動(dòng)子在植物細(xì)胞中是具有功能的。13.用第10項(xiàng)所述的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。14.如第13項(xiàng)所述的細(xì)胞，其中，所述植物細(xì)胞是雙子葉植物細(xì)胞。15.如第13項(xiàng)所述的細(xì)胞，其中，所述植物細(xì)胞是單子葉植物細(xì)胞。16.如第13項(xiàng)所述的細(xì)胞，其中，所述植物細(xì)胞是大豆、棉花、玉米或者油菜籽植物細(xì)胞。17. 一種植物組織培養(yǎng)物，其包含第13項(xiàng)所述的細(xì)胞。18.如第17項(xiàng)所述的植物組織培養(yǎng)物，其包含雙子葉植物細(xì)胞。19.如第17項(xiàng)所述的植物組織培養(yǎng)物，其包含單子葉植物細(xì)胞。20.如第17項(xiàng)所述的植物組織培養(yǎng)物，其包含大豆、棉花、玉米或者油菜籽植物細(xì)胞。21.用第10項(xiàng)所述的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物。22.如第21項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中，所述植物是雙子葉植物。23.如第21項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中，所述植物是單子葉植物。24.如第21項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中，所述植物是大豆、棉花、玉米或者油菜籽植物。25. 一種產(chǎn)生耐受麥草畏的植物的方法，包括將第10項(xiàng)所述的構(gòu)建體引入植物細(xì)胞中，并由其再生包含第10項(xiàng)所述的構(gòu)建體的植物。26.如第25項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括通過(guò)將親本植株與它自身或者第二植株雜交產(chǎn)生耐受麥草畏的植物，其中，所述親本植株和/或第二植株包含DNA構(gòu)建體，并且耐受麥草畏的植物從所述的親本植株和/或第二植株遺傳了 DNA構(gòu)建體。27. 一種在植物細(xì)胞中表達(dá)麥草畏單加氧酶的方法，包括將選擇的CTP可操作地連接到編碼麥草畏單加氧酶的序列上。28. 一種在農(nóng)作物生長(zhǎng)環(huán)境中控制雜草生長(zhǎng)的方法，包括第20項(xiàng)所述的植物或其種子，并向農(nóng)作物生長(zhǎng)環(huán)境施用有效控制雜草生長(zhǎng)的量的麥草畏除草劑。29.如第觀項(xiàng)所述的方法，其中，所述麥草畏除草劑自上方向農(nóng)作物生長(zhǎng)環(huán)境施用。30.如第觀項(xiàng)所述的方法，其中，所述麥草畏除草劑的量不損傷第21項(xiàng)所述的植物或其種子，卻損傷與第20項(xiàng)所述的植物的基因型相同但是缺乏第10項(xiàng)所述的構(gòu)建體的植物。31. 一種生產(chǎn)食物、飼料或者工業(yè)產(chǎn)品的方法，包括a)獲得第21項(xiàng)所述的植物或其部分；和b)從該植物或者其部分制備食物、飼料、纖維或者工業(yè)產(chǎn)品。32.如第31項(xiàng)所述的方法，其中，所述食物或者飼料是谷物、粗粉、油、淀粉、面粉或者蛋白質(zhì)。
33.如第31項(xiàng)所述的方法，其中，所述工業(yè)產(chǎn)品是生物燃料、纖維、工業(yè)化學(xué)品、藥物或者營(yíng)養(yǎng)品。34. 一種針對(duì)出土前施用麥草畏提供保護(hù)的耐受麥草畏的種子，其包含可操作地連接到編碼麥草畏單加氧酶的DNA上的編碼葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的DNA。35.如第34項(xiàng)所述的耐受麥草畏的種子，其中，所述DNA編碼選自SEQ ID NOs 1-11的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽。36.如第35項(xiàng)所述的耐受麥草畏的種子，其中，所述編碼葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的DNA包含選自SEQ ID NOs 12-22的序列。37.如第34項(xiàng)所述的耐受麥草畏的種子，其中，所述DNA編碼包含選自SEQID NOs 24J6、28、30、32、34、36、38和40的序列的麥草畏單加氧酶。38. 一種提高單子葉植物的直立能力的方法，包括a)培育通過(guò)第沈項(xiàng)所述的方法產(chǎn)生的植物或種子；和b)用麥草畏處理該植物或種子。39.如第38項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括c)測(cè)量選自支柱根的數(shù)量、形狀、長(zhǎng)度或結(jié)構(gòu)、倒伏百分比和產(chǎn)量的與直立能力相關(guān)的參數(shù)。附圖簡(jiǎn)述

圖1 :CTP-DM0構(gòu)建體在DMO的正確加工和提供麥草畏耐受性中的應(yīng)用。發(fā)明詳述根據(jù)本發(fā)明，提供了用于在植物細(xì)胞中更有效地表達(dá)和向葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)麥草畏單加氧酶(DMO)多肽的組合物和方法。因此本發(fā)明的組合物和方法在增強(qiáng)植物和細(xì)胞對(duì)除草劑麥草畏的耐受性方面有用。尤其通過(guò)用葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽(CTP)將DMO靶向至葉綠體，可以實(shí)現(xiàn)提高的DMO表達(dá)和對(duì)麥草畏的耐受性。然而，令人驚奇的是，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)某些CTP與DMO組合不能很好地發(fā)揮功能。例如，一些CTP不能導(dǎo)致足夠的蛋白質(zhì)表達(dá)。這包括蛋白質(zhì)的不正確表達(dá)，以及改變大小的蛋白質(zhì)的產(chǎn)生和不完全的體內(nèi)活性。這會(huì)導(dǎo)致不完全的除草劑耐受性并且使注冊(cè)審批變得復(fù)雜。本發(fā)明提供CTP，當(dāng)該CTP與DMO聯(lián)合使用時(shí)，提供意想不到的益處，包括但不限于提高的轉(zhuǎn)運(yùn)至葉綠體的水平、在表達(dá)DMO的轉(zhuǎn)基因植物中增強(qiáng)的除草劑耐受性、正確大小的蛋白質(zhì)表達(dá)的理想水平和適當(dāng)?shù)姆g后修飾。當(dāng)與DMO組合后提供意想不到的益處的 CTP的一個(gè)例子是轉(zhuǎn)運(yùn)肽CTP2，包括SEQ ID NO :4或5的核酸，并且包括編碼SEQ ID NOs 15和16的序列。在其它實(shí)施方案中，使用豌豆(Pisum sativum)核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶小亞基CTP編碼序列，例如由SEQ ID NO :2所代表的或者編碼SEQ ID NO :13。因此， 包括可操作地連接到CTP2和/或豌豆核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶小亞基CTP轉(zhuǎn)運(yùn)肽編碼序列上的DMO編碼序列的DNA構(gòu)建體構(gòu)成本發(fā)明的一個(gè)方面，由其編碼的蛋白質(zhì)也構(gòu)成本發(fā)明的一個(gè)方面。嗜麥芽假單胞菌O^seudomonas maltophilia)菌株DI6的麥草畏單加氧酶 (Herman等人，2005 ；美國(guó)專利公開(kāi)20030115626 ；GenBank登記AY786443，本文引入其編碼 DMO的序列作為參考)催化除草劑麥草畏的解毒。DMO是用于將麥草畏解毒成無(wú)毒的3， 6-二氯水楊酸(3，6-DCSA)的三組分體系中的一部分，且如上所述需要還原酶和鐵氧還蛋白功能來(lái)轉(zhuǎn)移電子。由于參與電子轉(zhuǎn)移的內(nèi)源性植物鐵氧還蛋白定位于質(zhì)體中，為了獲得 DMO的有效活性和例如在雙子葉植物中的麥草畏耐受性或者例如在單子葉植物中增強(qiáng)的麥草畏耐受性，優(yōu)選DMO靶向至質(zhì)體(例如葉綠體)。測(cè) 試葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽(CTP)在將DMO靶向至質(zhì)體和DMO加工中的效率。與這些CTP 有關(guān)的DMO的質(zhì)體定位和加工從沒(méi)有或部分到完全不等。發(fā)現(xiàn)只有一些CTP允許將DMO完全加工成正確的大小。因此，基于它的蛋白質(zhì)或者核苷酸序列，任意給定的CTP提供完全和有效的DMO加工的能力是難以預(yù)料和出人意料的。此外，也已經(jīng)在擬南芥中發(fā)現(xiàn)，在沒(méi)有合適的CTP的情況下，幾乎沒(méi)有或者沒(méi)有 DMO的表達(dá)與幾乎沒(méi)有或者沒(méi)有麥草畏耐受性相關(guān)。這表明葉綠體靶向?qū)τ邴湶菸返慕舛具M(jìn)而對(duì)于耐受性是重要的。允許有效加工DMO的CTP在將DMO靶向至農(nóng)作物的質(zhì)體例如葉綠體方面是有用的，因此提供以下優(yōu)勢(shì)完全的DMO活性和對(duì)麥草畏的較高的耐受性，以及易于表征產(chǎn)品和降低注冊(cè)費(fèi)用。包括可操作地連接到編碼麥草畏單加氧酶的DNA上的編碼葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的DNA的嵌合DNA分子可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的分子生物學(xué)方法制備(例如，Sambrook等人， 1989)。本發(fā)明提供了可操作地連接到已知的編碼DM0(包括表1中列出的那些)的DNA分子上的CTP，用于提高植物中DMO的表達(dá)。來(lái)自在細(xì)胞核中編碼的任何基因并且其產(chǎn)物可將多肽靶向至葉綠體的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽，可以進(jìn)行DMO有效表達(dá)的檢測(cè)?？梢苑蛛x或者合成葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列。為了在雙子葉植物、單子葉植物或者這兩者中表達(dá)，可以優(yōu)化編碼CTP的核苷酸序列。通過(guò)將每一個(gè)可操作地連接到DMO編碼序列上，測(cè)試下面的轉(zhuǎn)運(yùn)肽JsRbcS-衍生的CIPs (SEQ ID NO 1和 2 豌豆核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶小亞基CTP ;Coruzzi等人，1984) ；AtRbcS CTP (SEQ ID NO 3 擬南芥核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶小亞基IA CTP ；CTPl ；美國(guó)專利5，728，925)； AtShkG CTP (SEQ ID NO 4 擬南芥5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPQ ；CTP2 ；Klee 等人，1987) ；AtShkGZm CTP (SEQ ID NO :5 :CTP2合成的；為單子葉植物表達(dá)進(jìn)行密碼子優(yōu)化；W004009761 的 SEQ ID NO 14) ；PhShkG CTP (SEQ ID NO 6 矮牽牛(Petunia hybrida) EPSPS ;CTP4 ；為單子葉植物表達(dá)進(jìn)行密碼子優(yōu)化；Gasser等人，1988) ；Taffaxy CTP (SEQ ID NO 7 小麥(Triticum aestivum)結(jié)合顆粒的淀粉合酶CTP合成的，為玉米表達(dá)進(jìn)行密碼子優(yōu)化Clark 等人，1991) =Osffaxy CTP (SEQ ID NO :8 水稻(Oryza sativa)淀粉合酶 CTP ； Okagaki，1992) ；NtRbcS CTP (SEQ ID NO :9 煙草(Nicotiana tabacum)核酮糖 1，5-二磷酸羧化酶小亞基葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽；Mazur，等人，1985) ；ZmAS CTP (SEQ ID NO 10 玉米(Zea mays)鄰氨基苯甲酸合酶α 2亞單位基因CTP ；Gardiner等人，2004)；和RgAS CTP (SEQ ID NO 11 蕓香(Ruta graveolens)鄰氨基苯甲酸合酶 CTP ；Bohlmann，等人，1995)。編碼 SEQ ID NO I-SEQ ID NO 11 的核苷酸序列分別在 SEQ ID NO :12_SEQ ID NO :22 中給出?？赡苡杏玫钠渌D(zhuǎn)運(yùn)肽包括玉米cab-m7信號(hào)序列(Becker等人，1992 ；PCT WO 97/41228)和豌豆(Pisum sativum)谷胱甘肽還原酶信號(hào)序列(Creissen等人，1995 ；PCT WO 97/41228)。具有來(lái)自于基因編碼區(qū)的額外氨基酸的CTP(所述氨基酸是該基因編碼區(qū)的一部分或與它融合)，例如AtRbcS CTP (其包含轉(zhuǎn)運(yùn)肽，成熟核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶蛋白的M個(gè)氨基酸，然后是轉(zhuǎn)運(yùn)肽的最后6個(gè)氨基酸的重復(fù))，可以被用來(lái)產(chǎn)生DM0。ZmAS CTP7也包含來(lái)自于基因編碼區(qū)的額外18個(gè)氨基酸。其它CTP也可以用來(lái)產(chǎn)生DM0，它們具有來(lái)自于基因編碼區(qū)的額外的氨基酸(例如27個(gè)氨基酸)(所述氨基酸是該基因編碼區(qū)的一部分)，例如I3SRbcS CTP，緊接著是通過(guò)克隆方法引入的氨基酸(例如3個(gè)氨基酸)。具有較少的編碼全長(zhǎng)CTP的氨基酸(例如21個(gè)氨基酸)的CTPdf^BRgAs CTP，也可以被用來(lái)產(chǎn)生DM0。優(yōu)選地，使用編碼全長(zhǎng)CTP的核苷酸序列?？梢园ㄒ粋€(gè)或者多個(gè)核苷酸添加或者缺失，以便于CTP的克隆。這些添加或者缺失可以在其它表達(dá)元件和編碼區(qū)的前面或者后面，導(dǎo)致一個(gè)或者多個(gè)編碼氨基酸的修飾，例如在限制性酶識(shí)別位點(diǎn)處或者位于其附近。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及編碼葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的核酸序列，該葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽與SEQ ID NOs :1-11中的任意一個(gè)或者多個(gè)多肽序列至少具有70%的同一性，包括與這些序列有至少大約75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或者更高的序列同一性，包括100%的同一性。在特定的實(shí)施方案中，所述核酸序列編碼與SEQ ID NOs :1-11中的一個(gè)相同的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，編碼CTP的核酸序列與SEQ ID NOs :12-22中的任意一個(gè)或者多個(gè)核酸序列具有至少70%的序列同一性，包括與這些序列中的一個(gè)或者多個(gè)至少有大約75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或者更大的序列同一性，包括100%的同一性。這些序列和本文所述的任意其它序列的多肽或者多核苷酸比較和同一性的確定可以如本領(lǐng)域公知的那樣進(jìn)行，例如，使用MEGAlign(DNAMar，Inc.，1228S. Park St.，Madison, WI)，采用缺省參數(shù)。這樣的軟件通過(guò)確定相似性或者同一性的程度，匹配相似的序列。通過(guò)使用前序列可以將DMO靶向至其它細(xì)胞器例如線粒體，以利用存在于該細(xì)胞器中的鐵氧還蛋白氧化還原系統(tǒng)?；蛘撸ㄟ^(guò)雙靶向肽可以將DMO靶向至葉綠體和線粒體兩者，以利用兩個(gè)鐵氧還蛋白氧化還原系統(tǒng)，使工作更加有效。這樣的元件是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的。例如，線粒體前序列在Silva Filho等人，(1996)中有描述。編碼雙靶向肽序列的核酸序列可以從編碼下述已知能被靶向至葉綠體和線粒體兩者的蛋白質(zhì)的核苷酸序列中被鑒定出來(lái)&ι-ΜΡ (Moberg等人，2003)、谷胱甘肽還原酶(Rudhe等人，2002 ；Creissen 等人，1995)和組氨酰-tRNA合成酶(Akashi等人，1998)。例如，如表1所示，在編碼SEQ ID NOs M、26、觀、30、32、34、36、38、40多肽的序列中，發(fā)現(xiàn)可以用于這方面的DMO編碼序列的例子。表1.使用的DMO和DMO變體。
權(quán)利要求
1.一種重組DNA分子，其包括可操作地連接到編碼麥草畏單加氧酶的DNA序列上的編碼葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的DNA序列，其中，編碼葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的DNA序列編碼SEQ ID NO 6的多肽序列。
2.如權(quán)利要求1所述的重組DNA分子，其中，所述編碼葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的DNA序列包括 SEQ ID NO 17的核苷酸序列。
3.如權(quán)利要求1所述的重組DNA分子，其中，所述編碼麥草畏單加氧酶的DNA序列編碼選自 SEQ ID NO :24、26、28、30、32、34、36、38 和 40 的多月太。
4.如權(quán)利要求3所述的重組DNA分子，其中，所述DNA序列選自SEQID NO :23、25、27、 29、31、33、35、37 和 39。
5.如權(quán)利要求1所述的重組DNA分子，進(jìn)一步包含啟動(dòng)子。
6.一種轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其包括包含可操作地連接到編碼麥草畏單加氧酶的DNA序列上的編碼葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的DNA序列的重組DNA分子，其中，編碼葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的DNA序列編碼SEQ ID NO 6的序列。
7.—種產(chǎn)生耐受麥草畏的植物的方法，包括將包含可操作地連接到編碼麥草畏單加氧酶的DNA序列上的編碼葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的DNA序列的重組DNA分子引入植物細(xì)胞中，其中， 編碼葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的DNA序列編碼SEQ ID NO 6的序列；并由該植物細(xì)胞再生包含該重組 DNA分子的植物。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述植物是雙子葉植物。
9.如權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述植物是單子葉植物。
10.一種控制田地中的雜草的方法，包括培育包含重組DNA分子的轉(zhuǎn)基因植物，該重組DNA分子包含可操作地連接到編碼麥草畏單加氧酶的DNA序列上的編碼葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的 DNA序列，其中，編碼葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的DNA序列編碼SEQ ID NO 6的序列；并向所述田地中施用有效控制雜草生長(zhǎng)而不損傷所述轉(zhuǎn)基因植物的量的麥草畏除草劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于有效加工和定位轉(zhuǎn)基因植物中的麥草畏單加氧酶(DMO)的某些葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的鑒定和用途。本發(fā)明也提供了產(chǎn)生耐受麥草畏的植物的方法、控制雜草生長(zhǎng)的方法和產(chǎn)生食物、飼料和其它產(chǎn)品的方法，以及當(dāng)出土前或出土后施用麥草畏時(shí)提供麥草畏耐受性的種子。
文檔編號(hào)C12N5/10GK102337275SQ20111027598
公開(kāi)日2012年2月1日 申請(qǐng)日期2007年6月6日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月26日
發(fā)明者M·瑪爾文, P·C·C·馮, S·弗拉辛斯基 申請(qǐng)人:孟山都技術(shù)公司