專利名稱：檢測登革病毒及分型的方法及專用芯片和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測登革病毒及分型的方法及專用芯片和試劑盒。
背景技術(shù)：
登革病毒(dengue virus)屬于黃病毒科黃病毒屬中的一個(gè)血清型亞群，形態(tài)結(jié)構(gòu)與乙腦病毒相似，但體積較小，約17 25nm。登革病毒基因組RNA約含有11000個(gè)核苷酸， 其5'端為I型帽子結(jié)構(gòu)，3'端缺乏poly(A)尾，基因組的5'端和3'端均有一段非編碼區(qū)?；蚪M只有一個(gè)開放讀碼框，其5'端1/4編碼病毒3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白0:、PrM和E)，3'端 3/4編碼7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(NSl、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b*NS5)。根據(jù)病毒包膜蛋白E 的抗原性不同，登革病毒分為1 4個(gè)血清型(I、II、III、IV)。各型病毒之間抗原性有交叉，但與黃病毒科的其它抗原群無交叉性。病毒包膜蛋白E的抗原決定簇既可以誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生保護(hù)性的中和抗體和血凝抑制抗體，還可能參與登革出血熱(DHF)和登革休克綜合征 (DSS)的發(fā)生。目前對于登革病毒的檢測主要有病毒分離、血清學(xué)診斷和病毒核酸檢測。目前廣泛應(yīng)用的主要是RT-PCR方法，該方法具有操作簡便、快捷；敏感性高；特異性強(qiáng)；對起始材料質(zhì)量要求低的特點(diǎn)，但存在假陽性高的缺點(diǎn)，基于TaqMan探針的熒光定量PCR方法解決了這一問題，但仍然存在通量低的缺點(diǎn)。生物芯片是指能對生物成分或生物分析進(jìn)行快速處理和分析的固體薄型器件，將微陣列技術(shù)與生物微機(jī)電技術(shù)相結(jié)合，通過微加工技術(shù)和微電子技術(shù)在固體基片表面構(gòu)建的微型生物化學(xué)分析系統(tǒng)，以實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞、蛋白質(zhì)、DNA以及其他生物組分的準(zhǔn)確、快速、大信息量的檢測。生物芯片能同時(shí)檢測樣本中的多個(gè)生物大分子，檢測原理是利用分子間的相互作用，如核酸雜交、抗原-抗體特異性結(jié)合、蛋白-蛋白間特異性結(jié)合等，將待測樣品標(biāo)記后與生物芯片反應(yīng)，樣品種的標(biāo)記分子與芯片上的探針“對號(hào)入座”，標(biāo)記的待測樣品與之結(jié)合，通過激光共聚焦熒光掃描儀等檢測手段獲取信息，由于芯片上可以固定成千上萬的探針，因此可以同時(shí)檢測成千上萬的生物大分子，而傳統(tǒng)的檢測方法一次只能檢測一個(gè)或幾個(gè)生物大分子，因此一次芯片實(shí)驗(yàn)就成了成千上萬個(gè)傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)，即一次生物芯片實(shí)驗(yàn)室多次傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)的集成。生物芯片和傳統(tǒng)儀器相比具有體積小、重量輕、便于攜帶、無污染、 分析過程自動(dòng)化、分析速度快、所需樣品和試劑少等諸多優(yōu)點(diǎn)。生物芯片的出現(xiàn)正在給生命科學(xué)研究、疾病診斷、新藥開發(fā)、司法鑒定以及食品衛(wèi)生監(jiān)督等領(lǐng)域帶來一場革命。生物芯片技術(shù)平臺(tái)一般包括5個(gè)部分芯片的基質(zhì)材料、把探針分配到芯片上的機(jī)械手、核酸雜交需要的控制系統(tǒng)、讀取雜交信號(hào)的光學(xué)掃描系統(tǒng)以及讀取和分析數(shù)據(jù)的計(jì)算機(jī)軟件工具，由于不同的文獻(xiàn)對探針(probe)和靶標(biāo)(target)有不同的定義。自芯片技術(shù)誕生以來，許多標(biāo)記檢測方法應(yīng)運(yùn)而生，如同位素、酶類、半抗原、熒光素、納米金等。當(dāng)前，熒光標(biāo)記具有種類多、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，是最為常用的標(biāo)記檢測手段。 但是，這種標(biāo)記方法依賴于昂貴的檢測儀器，檢測成本較高，且檢測結(jié)果不能長期保存。除此之外，納米顆粒，如金納米顆粒作為非熒光類的標(biāo)記物，也已廣泛應(yīng)用于微陣列信號(hào)的檢測。然而，基于金納米顆粒的檢測方法通常需要額外的銀染步驟，操作較為繁瑣且時(shí)間冗長。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種用于檢測登革病毒血清型的探針。本發(fā)明所提供的用于檢測登革病毒血清型的探針，為如下1)至4)中的至少一種1)、用于檢測I型登革病毒的探針，其核心雜交序列為SEQ ID NO=I所示，2)、用于檢測II型登革病毒的探針，其核心雜交序列為SEQ ID NO 2所示，3)、用于檢測III型登革病毒的探針，其核心雜交序列為SEQ ID NO 3所示，4)、用于檢測IV型登革病毒的探針，其核心雜交序列為SEQ ID NO 4所示。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種用于檢測登革病毒血清型的生物芯片。本發(fā)明所提供的用于檢測登革病毒血清型的生物芯片，包括生物芯片片基和連接在其上的檢測探針；所述檢測探針為如下1)和2)所示1)用于檢測登革病毒的通用探針，其核心雜交序列為SEQ ID NO 5所示；2)如下2)-1至2) -4中的至少一種2)_1、用于檢測I型登革病毒的探針，其核心雜交序列為SEQ ID NO 1所示，2)-2、用于檢測II型登革病毒的探針，其核心雜交序列為SEQ ID NO 2所示，2)-3、用于檢測III型登革病毒的探針，其核心雜交序列為SEQ ID NO 3所示，2)-4、用于檢測IV型登革病毒的探針，其核心雜交序列為SEQ ID NO 4所示。上述生物芯片中，所述檢測探針的核心雜交序列的5'端連接有由聚T組成的直鏈DNA片段和一個(gè)伯氨基。上述任一所述生物芯片中，所述由聚T組成的直鏈DNA片段為15個(gè)T組成的直鏈 DNA片段。上述任一所述生物芯片中，所述生物芯片片基為表面為醛基的生物芯片片基。上述任一所述生物芯片中，所述探針與所述片基通過所述探針上的伯氨基與所述片基上的醛基共價(jià)連接。上述任一所述生物芯片中，所述檢測探針、陽性質(zhì)控探針和陰性質(zhì)控探針的5'末端連接15個(gè)堿基T和伯氨基；所述探針的伯氨基與所述醛基共價(jià)連接，更便于探針與片基的連接；15個(gè)T的作用使探針分子在芯片上伸展開來，利于靶標(biāo)探針的雜交。如此結(jié)構(gòu)和連接方式，使生物分子間的作用更穩(wěn)定，結(jié)合更牢固。上述任一所述生物芯片中，上述用于固定DNA探針的芯片片基可為尼龍膜、纖維素膜、玻片、金屬片、硅片、陶瓷片、各種有機(jī)高分子制作的薄膜等，優(yōu)選為玻片。玻片的優(yōu)點(diǎn)在于來源方便；其表面經(jīng)過化學(xué)處理后，能夠共價(jià)結(jié)合DNA ；玻片能耐受高溫及高離子溶液環(huán)境；玻片表面光滑，對液體來說是非浸透性的，故雜交體系的體積可以很小，有利于探針和靶標(biāo)的結(jié)合；玻片的背景熒光低，不會(huì)給檢測帶來較大的噪音。上述任一所述生物芯片中，所述生物芯片包括連接于所述片基之上的陽性質(zhì)控探針和陰性質(zhì)控探針；所述陽性質(zhì)控探針便是與雜交陽性對照樣品雜交，具體所述陽性質(zhì)控探針的核心雜交序列為SEQ ID NO 16所示；陰性質(zhì)控探針是與人、動(dòng)物以及微生物無交叉雜交反應(yīng)，且不與雜交陽性對照樣品雜交的DNA片段；具體陰性質(zhì)控探針的核心雜交序列為SEQ ID N0:17所示。所述陽性質(zhì)控探針和陰性質(zhì)控探針的核心雜交序列的5'端分別連接有由聚T組成的直鏈DNA片段和一個(gè)伯氨基。所述的雜交陽性對照樣品是與人、動(dòng)物以及微生物無交叉雜交反應(yīng)的DNA片段， 尤其不與檢測探針雜交的DNA片段，是用于監(jiān)測雜交過程的對照品。上述任一所述生物芯片中，還包括連接在所述片基之上的磁標(biāo)；所述磁標(biāo)為15個(gè) T連接成的直鏈DNA片段，該直鏈DNA片段的5 ’端修飾有一個(gè)伯氨基，該直鏈DNA片段的 3'端用生物素標(biāo)記，具體序列如SEQ ID N0:19。磁標(biāo)作用主要有兩個(gè)一是監(jiān)控鏈霉親和素雜交過程，二是以此為基準(zhǔn)分辯雜交結(jié)果。上述任一所述生物芯片中，所述檢測探針、陽性質(zhì)控探針、陰性質(zhì)控探針和磁標(biāo)分別通過其5'端的伯氨基與生物芯片片基上的醛基形成共價(jià)鍵，從而分別固定在所述生物芯片片基上；上述任一所述生物芯片中，所述生物芯片按照包括如下步驟的方法制備將所述檢測探針及陽性質(zhì)控探針和陰性質(zhì)控探針和磁標(biāo)分別點(diǎn)在所述生物芯片片基上，得到點(diǎn)樣后的生物芯片片基；將點(diǎn)樣后的生物芯片片基35°C-39°C或37°C水盒(或者濕盒)過夜，用去離子水清洗，再將點(diǎn)樣后的生物芯片片基放入硼酸鹽溶液中孵育5分鐘，去離子水清洗， 空氣中干燥，即得到所述生物芯片。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種用于檢測登革病毒血清型的試劑盒。本發(fā)明所提供的用于檢測登革病毒血清型的試劑盒，包括上述任一所述的生物芯片和擴(kuò)增樣品中與所述探針雜交的目的片段的引物對組合物；所述引物對組合物為如下I和II所示I、用于擴(kuò)增通用型登革病毒目的片段的引物對SEQ ID NO 6和SEQ ID NO 7 ；II、如下II-I至II-4中的至少一種11-1、用于擴(kuò)增I型登革病毒目的片段的引物對=SEQ ID NO :8和SEQ ID NO 9 ；11-2、用于擴(kuò)增II型登革病毒目的片段的引物對SEQ ID N0:10和SEQ ID NO: 11 ；11-3、用于擴(kuò)增III型登革病毒目的片段的引物對=SEQ ID NO 12和SEQ ID NO 13 ；11-4、用于擴(kuò)增IV型登革病毒目的片段的引物對SEQ ID N0:14和SEQ ID NO: 15。上述試劑盒中，所述引物對組合物中每對引物中至少一個(gè)引物上標(biāo)記了生物素；上述試劑盒中，還包括鏈霉親和素修飾的信號(hào)分子。上述試劑盒中，所述鏈霉親和素修飾的信號(hào)分子為磁珠顆粒、納米金顆粒、熒光顆粒、化學(xué)發(fā)光顆?；蚧瘜W(xué)顯色顆粒；上述試劑盒中，還包括雜交陽性對照樣品；所述雜交陽性對照為來源于苦瓜的 242bp的DNA片段(自GENBANK號(hào)為AF498100的5 ‘端第342-511位核苷酸序列)，具體如SEQ ID N0:18所示。人工合成該DNA片段(5’端生物素修飾)，用去離子水調(diào)定濃度為 lug/ul0本發(fā)明的最后一個(gè)目的是提供一種用于檢測登革病毒血清型的方法。本發(fā)明所提供的用于檢測登革病毒血清型的方法，包括如下步驟
1)提取待測樣品的RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA ；2)用上述任一所述試劑盒中的引物對組合物對所述cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物；3)將所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與上述任一所述試劑盒中的生物芯片雜交；4)將步驟3)雜交后的生物芯片用鏈霉親和素包被的信號(hào)分子標(biāo)記，檢測結(jié)果；如果所述生物芯片上連接有用于檢測I型登革病毒的探針的部位顯示標(biāo)記上被鏈霉親和素包被的信號(hào)分子，則確定該待測樣品中含有I型登革病毒；如果所述生物芯片上連接有用于檢測II型登革病毒的探針的部位顯示標(biāo)記上鏈霉親和素包被的信號(hào)分子標(biāo)記，則確定該待測樣品中含有II型登革病毒；如果所述生物芯片上連接有用于檢測III型登革病毒的探針的部位顯示標(biāo)記上鏈霉親和素包被的信號(hào)分子標(biāo)記，則確定該待測樣品中含有III型登革病毒；如果所述生物芯片上連接有用于檢測IV型登革病毒的探針的部位顯示標(biāo)記上鏈霉親和素包被的信號(hào)分子標(biāo)記，則確定該待測樣品中含有IV型登革病毒。本發(fā)明的探針特異性好，可同時(shí)使用檢測出各種型的病毒，混合使用時(shí)，也不相互影響，可以分別與各自的目的片段雜交。本發(fā)明的鑒定登革病毒及分型的試劑盒在芯片上采用生物素標(biāo)記的核酸為樣品進(jìn)行核酸雜交，再通過鏈霉親和素與生物素的親和作用，對芯片上的雜交結(jié)果進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng)，最終使得雜交結(jié)果肉眼可見，或可通過普通顯微鏡觀測，所得結(jié)果可長期保存，且定性檢測成本低。特異性等同于熒光檢測，靈敏度可達(dá)到50ng(PCR模板量)。實(shí)驗(yàn)所的結(jié)果經(jīng)進(jìn)一步的圖像采集，可進(jìn)行定量分析。本發(fā)明的試劑盒可檢測登革病毒，并對登革病毒進(jìn)行分型鑒定，可以將登革病毒分類直接鑒定為登革病毒、I型登革病毒、II型登革病毒、III 型登革病毒和IV型登革病毒，基于這種方法進(jìn)行了登革病毒分類的實(shí)驗(yàn)，取得了較好的效果，真陽性率達(dá)100%，真陰性率為100%。鑒別四型登革病毒的準(zhǔn)確率達(dá)到100%。


圖1為微陣列芯片上點(diǎn)陣的分布。圖2為點(diǎn)陣探針排布圖。圖3為磁珠檢測原理。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。本文中，固定在基質(zhì)載體上的DNA被稱為探針，而來自生物樣品的核酸被稱為靶標(biāo)。實(shí)施例1、生物芯片的結(jié)構(gòu)及其制備一、生物芯片的結(jié)構(gòu)
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1、生物芯片由生物芯片片基和連接在其上的檢測探針、陽性質(zhì)控探針(PC)、陰性質(zhì)控探針(NC)和磁標(biāo)構(gòu)成；2、所述檢測探針為如下1)和2)所示1)用于檢測登革病毒的通用探針，其核心雜交序列為SEQ ID NO 5所示；2)為如下四種2)-1、用于檢測I型登革病毒的探針，其核心雜交序列為SEQ ID NO=I所示，2)-2、用于檢測II型登革病毒的探針，其核心雜交序列為SEQ ID NO 2所示，2)-3、用于檢測III型登革病毒的探針，其核心雜交序列為SEQ ID NO 3所示，2)-4、用于檢測IV型登革病毒的探針，其核心雜交序列為SEQ ID NO 4所示。在每個(gè)檢測探針的核心雜交序列的5'端連接有由15個(gè)T連接而成的直鏈DNA片段，且在和每個(gè)檢測探針的核心雜交序列的5'端連接一個(gè)伯氨基。3、陽性質(zhì)控探針的核心雜交序列為SEQ ID NO :16所示；(陽性質(zhì)控探針是可以與所述雜交陽性對照樣品雜交的片段)陰性質(zhì)控探針的核心雜交序列為SEQ ID NO :17所示；(是與人、動(dòng)物以及微生物無交叉雜交反應(yīng)，且不與所述雜交陽性對照樣品雜交的DNA片段)分別在陽性質(zhì)控探針和陰性質(zhì)控探針的核心雜交序列的5'端連接有由15個(gè)T連接而成的直鏈DNA片段，且在和每個(gè)質(zhì)控探針的核心雜交序列的5'端連接一個(gè)伯氨基。4、磁標(biāo)；為15個(gè)T連接成的直鏈DNA片段，該直鏈DNA片段的5'端修飾有一個(gè)伯氨基，該直鏈DNA片段的3'端用生物素標(biāo)記。5、生物芯片片基為表面為醛基的生物芯片片基；6、連接方式檢測探針、陽性質(zhì)控探針、陰性質(zhì)控探針和磁標(biāo)分別通過其5'端的伯氨基與片基上的醛基形成共價(jià)鍵，從而使其固定在片基上。二、制備方法(一)片基的選擇和檢測1、片基醛基化的玻片片基，購自博奧生物有限公司(貨號(hào)420022)。2、醛基片基的性能檢測1)基片背景檢測將購買的醛基基片經(jīng)晶芯 LuXSCan IOK微陣列芯片掃描儀在PMT/Power = 90/900的掃描參數(shù)下掃描，其Cy3通道熒光背景< 1000 ；Cy5通道熒光背景< 300為熒光背景合格基片，結(jié)果表明上述醛基基片的熒光背景合格。2)醛基基片固定能力的檢測將醛基基片進(jìn)行核酸固定能力的檢測，主要是通過固定在醛基基片表面的激發(fā)波長為532nm的熒光標(biāo)記Oligo樣品和要雜交的Oligo樣品分別判斷醛基基片的表面化學(xué)特性和生物樣品固定能力等指標(biāo)。對于2. 5 μ M激發(fā)波長為532nm的熒光標(biāo)記的Oligo樣品， 在固定化處理后經(jīng)晶S LuxScanTM IOK微陣列芯片掃描儀在PMT/Power = 90/750的掃描參數(shù)下，Cy3通道熒光背景> 10000，且雜交后10. 0μ M的PBH(—種Oligo樣品)Cy3通道信號(hào)> 15000的基片，其固定能力合格，結(jié)果表明選用的醛基基片的固定能力合格，可以用于作為本實(shí)驗(yàn)中的探針固定及后續(xù)檢測。(二)探針的設(shè)計(jì)
對登革病毒的核酸序列和蛋白序列進(jìn)行比對，在保守序列上設(shè)計(jì)分型引物和探針。對登革病毒的核酸序列保守性進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)相對保守區(qū)域在登革病毒基因組3’非轉(zhuǎn)錄區(qū)域(UTR)。該區(qū)域被認(rèn)為是潛在的目標(biāo)序列，在登革病毒不同的血清型中此區(qū)域中存在多少的堿基錯(cuò)配。通用型登革病毒目標(biāo)序列為基因組3’非轉(zhuǎn)錄區(qū)域(UTR)、I型登革病毒目標(biāo)序列為非結(jié)構(gòu)蛋白5(NS5)、II型、III型和IV型目標(biāo)序列為衣殼蛋白區(qū)域。根據(jù)上述序列分析結(jié)果，設(shè)計(jì)的探針序列如下檢測I型登革病毒的探針序列(DEN-I) =SEQ ID NO=I ；檢測II型登革病毒的探針序列(DEN-2) =SEQ ID NO 2 ；檢測III型登革病毒的探針序列(DEN-3) =SEQ ID NO 3 ；檢測IV型登革病毒的探針序列(DEN-4) =SEQ ID NO 4 ；檢測通用型登革病毒的探針序列為(DEN-T)) =SEQ ID NO :5。探針設(shè)計(jì)完畢后使用NCBI BLAST中的nr數(shù)據(jù)庫進(jìn)行特異性的檢驗(yàn)，并使用 Primer premier 5檢測是否有發(fā)夾結(jié)構(gòu)或者二聚體形成，結(jié)果表明設(shè)計(jì)探針滿足特異性要求，且不會(huì)形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)或者二聚體。(三)芯片的制備1、探針的合成(1)檢測探針的合成合成SEQ ID NO =I-SEQ ID NO 5所示探針時(shí)，在每個(gè)探針的5，端加上15個(gè)T后再加上一個(gè)伯氨基即得到用于檢測登革病毒通用及分型的探針。伯氨基通過6-12個(gè)碳原子間隔臂連接在探針5’核苷酸的磷酸基團(tuán)上。伯氨基的作用醛基玻片固定DNA存在兩個(gè)反應(yīng)，共價(jià)結(jié)合反應(yīng)和還原反應(yīng)。伯氨基與醛基進(jìn)行共價(jià)結(jié)合，從而使探針與片基連接，具體是伯氨基上的非鍵電子對和醛基基團(tuán)上電正性的碳原子形成共價(jià)鍵，該反應(yīng)是共價(jià)結(jié)合反應(yīng)。在多數(shù)芯片點(diǎn)樣過程，如果濕度 < 40 %時(shí)，通常在隨后的脫水步驟中，會(huì)使得在氨基化DNA分子和芯片表面間形成共價(jià)鍵， 結(jié)果是形成了一個(gè)取代亞胺，通常被稱為希夫堿(Schiff base)，然后必須通過還原反應(yīng)得到可用于雜交的標(biāo)記探針的醛基修飾基因芯片。15個(gè)T的作用使探針分子在芯片上伸展開來，利于靶標(biāo)探針的雜交。(2)陽性質(zhì)控探針、陰性質(zhì)控探針合成SEQ ID NO :16、SEQ ID NO :17所示陽性質(zhì)控探針和陰性質(zhì)控探針時(shí)，在每個(gè)探針的5’端加上15個(gè)T后再加上一個(gè)伯氨基。(3)磁標(biāo)合成SEQ ID NO :19所示磁標(biāo)，并且在該直鏈DNA片段的5'端修飾有一個(gè)伯氨基， 在該直鏈DNA片段的3'端用生物素標(biāo)記。2、點(diǎn)樣步驟1合成好的探針分別先溶解在雙蒸水中，得到DEN-I終濃度為40 μ M的探針核酸溶液(檢測登革病毒I型的探針溶液)、DEN-2終濃度均為40 μ M的探針核酸溶液(檢測登革病毒II型的探針溶液)、DEN-3終濃度均為40 μ M的探針核酸溶液(檢測登革病毒 III型的探針溶液)、DEN-4終濃度均為40 μ M的探針核酸溶液(檢測登革病毒IV型的探針溶液)、DEN-T終濃度均為40 μ M的探針核酸溶液(檢測通用型登革病毒的探針溶液)，分別轉(zhuǎn)5μ L上述探針溶液到384孔板或96孔板中，分別加入5μ L 2Χ晶芯 基因芯片點(diǎn)樣液(博奧生物，產(chǎn)品目錄號(hào)440010)，并用移液器充分混合后，即可用于基因芯片點(diǎn)樣。雜交陽性質(zhì)控(PC)探針和雜交陰性質(zhì)控(NC)探針和磁標(biāo)按照也先分別溶解在雙蒸水中至終濃度均為40 μ M，用于基因芯片點(diǎn)樣。將上述檢測登革病毒的通用及分型探針，同時(shí)設(shè)置雜交陽性質(zhì)控(PC)探針、雜交陰性質(zhì)控(NC)探針和磁標(biāo)(Biotin)由博奧生物有限公司生產(chǎn)的晶芯 SmartArrayerTM48 微陣列芯片點(diǎn)樣系統(tǒng)按點(diǎn)樣步驟點(diǎn)樣到醛基片基上。芯片設(shè)計(jì)探針、雜交陽性質(zhì)控、雜交陰性質(zhì)控和磁標(biāo)以點(diǎn)陣(微陣列)的形式分布在片基上。每個(gè)片基上有四個(gè)點(diǎn)陣。四個(gè)點(diǎn)陣的設(shè)計(jì)完全相同，其排列和間距如圖1和點(diǎn)陣探針排布圖2所示；圖中I為檢測登革病毒I型的探針DEN-1P，II為檢測登革病毒II 型的探針DEN-2P，III為檢測登革病毒III型的探針DEN-3P，IV為檢測登革病毒IV型的探針DEN-4P，T為通用探針。PC為雜交陽性質(zhì)控探針，NC為雜交陰性質(zhì)控探針，B為磁標(biāo)。3、探針固定點(diǎn)好樣的片基在37°C水盒過夜，去離子水清洗2遍，將芯片放入硼酸鹽溶液 (1. 0gNaBH4+300ml PBS+100ml無水乙醇)中孵育5分鐘，去離子水清洗2遍，空氣中干燥后，即得到檢測登革病毒通用探針及分型探針的基因芯片。每1升PH7. 4的PBS緩沖液按照如下方法制備在IOOOml水中加入8. 5g NaCl,2. 2g Na2HPO4以及0. 2g NaH2PO4,用HCl 或NaOH調(diào)PH為7. 4，得到pH 7. 4的PBS緩沖液。4、芯片的質(zhì)量控制制備完成后的芯片經(jīng)晶芯 LuxSCanTM10K微陣列芯片掃描儀在PMT/Power = 90/900的掃描參數(shù)下掃描，在同一張芯片內(nèi)，同一根針點(diǎn)樣，點(diǎn)直徑偏差小于20%。點(diǎn)陣整齊，無明顯連點(diǎn)現(xiàn)象，即證明芯片是合格的。結(jié)果表明步驟A制備的基因芯片合格。實(shí)施例2、用于檢測登革病毒血清型的試劑盒一、試劑盒組成如下1、實(shí)施例1中的生物芯片。2、擴(kuò)增樣品中目的條帶的引物對組合物，如I至V所示I、SEQ ID NO 8和SEQ ID NO 9所示引物對；該引物對I型登革病毒的擴(kuò)增產(chǎn)物可與探針DEN-I雜交。II、SEQ ID NO :10和SEQ ID NO 11所示引物對；該引物對II型登革病毒的擴(kuò)增產(chǎn)物可與探針DEN-2雜交。III、SEQ ID N0:12和SEQ ID NO 13所示引物對；該引物對III型登革病毒的擴(kuò)增產(chǎn)物可與探針DEN-3雜交。IV、SEQ ID NO 14和SEQ ID NO 15所示引物對；該引物對IV型登革病毒的擴(kuò)增產(chǎn)物可與探針DEN-4雜交。V,SEQ ID NO :6和SEQ ID NO :7所示引物對；該引物對登革病毒基因組3，非轉(zhuǎn)錄區(qū)域(UTR)的擴(kuò)增產(chǎn)物可與探針DEN-T雜交。上述引物對的上游引物5’端用生物素(Biotin)標(biāo)記。在正向引物的5'端都加上了 I^stI的酶識(shí)別位點(diǎn)(CTGCAG)，反向引物的5'端加上了 McI酶識(shí)別位點(diǎn)(GAGCTC)，并都在酶切位點(diǎn)5'端加上了保護(hù)堿基。加上酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基可以提高PCR反應(yīng)擴(kuò)增效率。3、鏈霉親和素包被的磁珠購自北京思爾成生物(112-06D)。4、雜交液含有3 X SSC，0.2% (質(zhì)量百分含量)SDS，25% (質(zhì)量百分含量)甲酰胺，5XDenhardt' s的溶液。SSC為含有0. 15M氯化鈉以及0. 015M檸檬酸鈉的緩沖液； Denhardt' s溶液為含有0.02% (質(zhì)量百分含量)聚蔗糖、0.02% (質(zhì)量百分含量)聚乙烯吡咯烷酮以及0. 02% (質(zhì)量百分含量)BSA的混合溶液。聚蔗糖的數(shù)均分子量(或重均分子量)為4X 105。5、芯片清洗液芯片清洗液洗液I 含2XSSC，0.2% (質(zhì)量百分含量)SDS的水溶液；洗液II 0. 2 X SSC的水溶液。6、信號(hào)反應(yīng)緩沖液由羊血清、TEN緩沖液和(質(zhì)量百分含量)BSA-PBS溶液按照4 10 1的體積比混合而成的溶液。每1升TEN緩沖液按照如下方法制備將10mM、 ρΗ7· 5 的 Tris-HCl 緩沖液、Im mol EDTA 和 2. Omol NaCl 混合，用 10mM、pH7. 5 的 Tris-HCl 緩沖液補(bǔ)足體積。每1升(質(zhì)量百分含量)BSA-PBS溶液按照如下方法制備將Ig BSA 溶于PH 7. 4的PBS緩沖液中，用PBS緩沖液補(bǔ)足體積。PBS緩沖液(pH 7.4)按照如下方法制備在 IOOOml 水中加入 8. 5g NaCl,2. 2g Na2HPO4 以及 0. 2g NaH2PO4，用 HCl 或NaOH調(diào) PH為7. 4，得到PBS緩沖液。7、雜交陽性對照樣品其核苷酸序列具體為SEQ ID NO 18所示，且該DNA片段的 5’端生物素標(biāo)記。用去離子水調(diào)定濃度為lug/ul。二、試劑盒檢測原理試劑盒原理如圖3所示，具體過程是用生物素標(biāo)記的引物對樣品進(jìn)行擴(kuò)增，如果該樣品中含有登革病毒，則其相應(yīng)的引物可擴(kuò)增得到生物素標(biāo)記的相應(yīng)型別的登革病毒基因片段，將擴(kuò)增得到的產(chǎn)物與芯片雜交，然后用鏈霉親和素包被的磁珠進(jìn)行標(biāo)記，如果探針跟擴(kuò)增產(chǎn)物可以雜交結(jié)合，則結(jié)合上的生物素標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物可被鏈霉親和素包被的磁珠標(biāo)記，反應(yīng)結(jié)果可以直接肉眼觀察，或采用普通光學(xué)照相裝置照相成像觀察結(jié)果，也可以用晶芯LuxScan 10K/A微陣列芯片掃描儀在Power/PMT = 90/800下進(jìn)行掃描圖像。如果在相應(yīng)的位置有成像反應(yīng)點(diǎn)則可確定該樣品中是否含有該探針檢測的登革病毒并可以對其進(jìn)行分型；反之，則沒有。實(shí)施例3、試劑盒的應(yīng)用I型登革病毒陽性樣本感染I型登革病毒而未感染其他型別登革病毒的人的血清標(biāo)本，取自深圳市疾病預(yù)防控制中心，均經(jīng)過患者的同意；鑒定方法參見KRGurukumar， D Priyadarshini, JA Patil, A Bhagat, A Singh. Development of real time PCR for detection and quantitation of Dengue Viruses. Virology Journal, 2009,1, 23 :1-8)。II型登革病毒陽性樣本感染II型登革病毒而未感染其他型別病毒的人的血清標(biāo)本，取自廣東省疾病預(yù)防控制中心，均經(jīng)過患者的同意；鑒定方法參見KR Gurukumar, D Priyadarshini，JA Patil, A Bhagat, A Singh. Development of real time PCR for detection and quantitation of Dengue Viruses. Virology Journal，2009，1，23 :1-8)·一、試劑盒的檢測登革病毒效果1、病毒RNA提取及PCR擴(kuò)增目標(biāo)基因
1)病毒總RNA提取分別取5份I型登革病毒陽性樣本和5份II型登革病毒陽性樣本，每份分別取 IOOul，加入200ul TRIzol試劑，劇烈振蕩60秒，加入IOOul氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫防治5分鐘，然后于12000g離心15分鐘，將水相轉(zhuǎn)移到新離心管內(nèi)，加入500ul異丙醇，4°C， 12000g離心10分鐘，棄上清，用70%乙醇洗滌RNA沉淀，然后12000g離心2分鐘，干燥10 分鐘，將沉淀溶于DEPC水中。2)反轉(zhuǎn)錄采用Omniscript RT kit試劑盒(北京華美生科生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)Qiagen-205111)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，具體方法為將隨機(jī)引物2 μ L，dNTP Mix(IOmM)(各 2. 5mM) 1 μ L，樣品總RNA(lng至5 μ g)6 μ L混勻，65°C加熱變性5分鐘，冰浴5分鐘；然后加入 10 X First-Strand Buffer 2 μ L, MgCL2 (25mM) 4 μ L，DTT (0· 1M) 2 μ L, RNaout 1 μ L,混勻，25°C加熱 anin，然后加入 superscript II 反轉(zhuǎn)錄酶(5U/uL) 1 μ L，混勻，25°C IOmin, 42°C 50min,70°C 15min，得到反轉(zhuǎn)錄的 cDNA。3)PCR擴(kuò)增通用型登革病毒基因片段和四型登革病毒基因片段以上述步驟2)得到的cDNA為模板，用引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系為10 XPCR Buffer 2μ L,25mM MgCL22 μ L, 2. 5mM dNTP mixl. 6μ L, 登革病毒基因片段通用擴(kuò)增引物的下游引物(5μΜ)和四型登革病毒基因片段擴(kuò)增引物的下游引物(5 μ Μ) 0.5 μ L，登革病毒基因片段通用擴(kuò)增引物的上游引物(生物素標(biāo)記40 μ Μ) 和四型登革病毒基因片段擴(kuò)增引物的上游引物(生物素標(biāo)記40 μ Μ) 0.5 μ L，登革病毒陽性樣本反轉(zhuǎn)錄得到的CDNA 2 μ L，LA-TagE (5U/ML) 0. 2 μ L, H2O 11. 2 μ L。每個(gè)PCR反應(yīng)體系中，是加入一種型的引物對。PCR擴(kuò)增程序?yàn)橄?94°C IOmin ；然后 94°C 30sec，51°C 30sec，72°C 30sec，40 個(gè)循環(huán)；最后 72 °C 5min。2、PCR產(chǎn)物芯片雜交根據(jù)堿基互補(bǔ)配對的原則，在適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)條件下，帶有生物素標(biāo)記的PCR產(chǎn)物與芯片上的互補(bǔ)探針結(jié)合形成穩(wěn)定的雙鏈，再與鏈霉親和素包被的磁珠反應(yīng)，通過鏈霉親和素與生物素的親和作用，對芯片上的雜交結(jié)果進(jìn)行磁珠標(biāo)記后，得到檢測分析結(jié)果。具體方法如下所述1)芯片雜交將基因芯片放到雜交盒中，取7.8ul雜交液，0.2ul雜交陽性對照樣品，分別和7ul 步驟2得到通用及分型登革病毒陽性樣本PCR產(chǎn)物混合，用移液器混勻后3000rpm離心 30s，95°C熱變性:3min (在PCR儀中)。冰浴驟冷lmin。然后用移液器通過雜交盒的蓋片上的小孔注到基因芯片的點(diǎn)陣上，使其覆蓋芯片上的點(diǎn)陣。確認(rèn)雜交液覆蓋芯片上的點(diǎn)陣后， 蓋緊雜交盒蓋，放入42°C恒溫水浴鍋中，雜交2小時(shí)，使樣品與探針充分反應(yīng)。注雜交細(xì)菌PCR產(chǎn)物時(shí)，需兩體系PCR產(chǎn)物混合后雜交。每個(gè)點(diǎn)陣15yL。一張芯片共4個(gè)點(diǎn)陣，可雜交四份樣本。2)芯片清洗芯片清洗使用不同離子強(qiáng)度的溶液依次漂洗芯片，以除去游離的及非特異性結(jié)合的樣品。
將步驟2)雜交結(jié)束后的芯片，快速從雜交盒中拿出(蓋片可以重復(fù)利用)，將芯片轉(zhuǎn)移到盛放預(yù)熱至42°C的洗液I的清洗盒中，雜交面朝上，放在水平搖床上清洗％iin，以洗去沒有與探針特異結(jié)合的樣品。在洗液I中清洗結(jié)束后，迅速用鑷子將芯片轉(zhuǎn)移到盛放預(yù)熱至42°C的洗液II的清洗盒中，雜交面朝上，放在水平搖床上清洗^iin。然后，將芯片放在50mL錐形離心管中 1500rpm離心1分鐘。3、信號(hào)反應(yīng)1)將步驟2經(jīng)雜交后的芯片每個(gè)點(diǎn)陣點(diǎn)12yL羊血清，37°C孵育30分鐘，然后用 lXPBS(pH 7. 4)(配方為在 1000ml 水中分別加入 8. 5g NaCl,2. 2g Na2HPO4 以及 0. 2g NaH2PO4,用HCl或NaOH調(diào)PH為7. 4)清洗2次，1500rpm離心1分鐘。2)信號(hào)反應(yīng)鏈霉親和素標(biāo)記取清洗后的鏈霉親和素包被的磁珠與鏈霉親和素雜交緩沖液以 1 3的體積比混合，然后點(diǎn)到步驟1)處理過的芯片上，點(diǎn)樣量為12ul/點(diǎn)陣，37°C雜交10 分鐘。然后用 IXPBS(1000ml 水中分別加入 8. 5g NaCl,2. 2g Na2HPO4 以及 0. 2gNaH2P04，用 HCl或NaOH調(diào)PH為7. 4得到的溶液)清洗2次，1500rpm離心1分鐘，即得到全部反應(yīng)完畢的芯片。4、結(jié)果分析芯片雜交結(jié)果可以用肉眼直接辨別，達(dá)到了直觀可視化檢測要求。結(jié)果也可以采用直接光學(xué)成像設(shè)備照相，如CCD照片、普通相機(jī)照片等顯示。結(jié)果表明，5份I型登革病毒陽性樣本的結(jié)果均為I型登革病毒陽性；5份II型登革病毒陽性樣本的檢測結(jié)果均為II 型登革病毒陽性。二、試劑盒穩(wěn)定性驗(yàn)證按照步驟一的方法用試劑盒對I型登革病毒陽性樣本(感染I型登革病毒而未感染其他型登革病毒的人的血清標(biāo)本)，平行四次同時(shí)檢測，比較四次檢測結(jié)果，考察芯片檢測方法是否穩(wěn)定，結(jié)果顯示，檢測結(jié)果都為I型登革病毒陽性其他型登革病毒陰性，四次結(jié)果之間并無顯著性差異，證明芯片檢測方法相當(dāng)穩(wěn)定。三、試劑盒的靈敏度檢測以DNA模板起始量為基準(zhǔn)對該芯片的檢測靈敏度進(jìn)行了初步研究。取I型登革病毒陽性樣品，提取病毒RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后，將cDNA依次進(jìn)行梯度稀釋(100ng，50ng，25ng， IOng)，按步驟一的方法用試劑盒進(jìn)行雜交檢測。cDNA量檢測結(jié)果顯示，熒光信號(hào)檢測靈敏度為模板量25ng，本發(fā)明的芯片檢測當(dāng)模板量降至25ng時(shí)缺失一個(gè)位點(diǎn)，檢測靈敏度為模板量50ng。結(jié)果表明本發(fā)明的方法可視化芯片檢測靈敏度為cDNA模板量50ng。四、實(shí)際樣品的檢測取臨床檢測樣本25例(人血清樣品，由廣東省疾控中心提供，均經(jīng)過患者同意)，用試劑盒檢測，操作同步驟一，同時(shí)用PCR方法進(jìn)行檢測(PCR檢測方法參見KR Gurukumar, D Priyadarshini, JA Patil, A Bhagat, A Singh. Development of real time PCR for detection and quantitation of Dengue Viruses. Virology Journal,2009,1, 23 :1-8)。結(jié)果如下表1所示，結(jié)果表明，本發(fā)明的檢測方法對登革病毒進(jìn)行檢測的真陽性率為5/5 = 100%，真陰性率為20/20 = 100%，對登革病毒進(jìn)行分型檢測的準(zhǔn)確率達(dá)到 100%。表1.實(shí)際樣品的檢測結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種用于檢測登革病毒血清型的探針，為如下1)至4)中的至少一種1)、用于檢測I型登革病毒的探針，其核心雜交序列為SEQID NO 1所示，2)、用于檢測II型登革病毒的探針，其核心雜交序列為SEQID NO 2所示，3)、用于檢測III型登革病毒的探針，其核心雜交序列為SEQID NO 3所示，4)、用于檢測IV型登革病毒的探針，其核心雜交序列為SEQID NO 4所示。
2.一種用于檢測登革病毒血清型的生物芯片，包括生物芯片片基和連接在其上的檢測探針；所述檢測探針為如下1)和2、所示1)用于檢測登革病毒的通用探針，其核心雜交序列為SEQID N0:5所示；2)如下2)-1至2)-4中的至少一種2)_1、用于檢測I型登革病毒的探針，其核心雜交序列為SEQ ID NO 1所示， 2)_2、用于檢測II型登革病毒的探針，其核心雜交序列為SEQ ID NO 2所示， 2)_3、用于檢測III型登革病毒的探針，其核心雜交序列為SEQ ID NO 3所示， 2)_4、用于檢測IV型登革病毒的探針，其核心雜交序列為SEQ ID N0:4所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的生物芯片，其特征在于所述檢測探針的核心雜交序列的5' 端連接有由聚T組成的直鏈DNA片段和一個(gè)伯氨基。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的生物芯片，其特征在于所述由聚T組成的直鏈DNA片段為 15個(gè)T組成的直鏈DNA片段。
5.根據(jù)權(quán)利要求2-4中任一所述的生物芯片，其特征在于所述生物芯片片基為表面為醛基的生物芯片片基。
6.根據(jù)權(quán)利要求2-5中任一所述的生物芯片，其特征在于所述探針與所述片基通過所述探針上的伯氨基與所述片基上的醛基共價(jià)連接。
7.一種用于檢測登革病毒血清型的試劑盒，包括權(quán)利要求2-6中任一所述的生物芯片和擴(kuò)增樣品中與所述探針雜交的目的片段的引物對組合物；所述引物對組合物為如下I和II所示I、用于擴(kuò)增通用型登革病毒目的片段的引物對SEQID NO :6和SEQ ID NO 7 ；II、如下II-I至II-4中的至少一種11-1、用于擴(kuò)增I型登革病毒目的片段的引物對SEQ ID NO 8和SEQ ID NO 9 ； Π-2、用于擴(kuò)增II型登革病毒目的片段的引物對SEQ ID NO :10和SEQ ID NO Π-3、用于擴(kuò)增III型登革病毒目的片段的引物對SEQ ID N0:12和SEQ ID NO 13 ； 11-4、用于擴(kuò)增IV型登革病毒目的片段的引物對SEQ ID N0:14和SEQ ID NO :15。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于所述引物對組合物中每對引物中至少一個(gè)引物上標(biāo)記了生物素；所述試劑盒還包括鏈霉親和素修飾的信號(hào)分子。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的試劑盒，其特征在于所述鏈霉親和素修飾的信號(hào)分子為磁珠顆粒、納米金顆粒、熒光顆粒、化學(xué)發(fā)光顆粒或化學(xué)顯色顆粒。
10.一種用于檢測登革病毒血清型的方法，包括如下步驟 1)提取待測樣品的RNA，反轉(zhuǎn)錄成CDNA ；2)用權(quán)利要求7-9中任一所述試劑盒中的引物對組合物對所述cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；3)將所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與權(quán)利要求7-9中任一所述試劑盒中的生物芯片雜交；4)將步驟幻雜交后的生物芯片用鏈霉親和素包被的信號(hào)分子標(biāo)記，檢測結(jié)果；如果所述生物芯片上連接有用于檢測I型登革病毒的探針的部位顯示標(biāo)記上被鏈霉親和素包被的信號(hào)分子，則確定該待測樣品中含有I型登革病毒；如果所述生物芯片上連接有用于檢測II型登革病毒的探針的部位顯示標(biāo)記上鏈霉親和素包被的信號(hào)分子標(biāo)記，則確定該待測樣品中含有Π型登革病毒；如果所述生物芯片上連接有用于檢測III型登革病毒的探針的部位顯示標(biāo)記上鏈霉親和素包被的信號(hào)分子標(biāo)記，則確定該待測樣品中含有III型登革病毒；如果所述生物芯片上連接有用于檢測IV型登革病毒的探針的部位顯示標(biāo)記上鏈霉親和素包被的信號(hào)分子標(biāo)記，則確定該待測樣品中含有IV型登革病毒。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測登革病毒及分型的方法及專用芯片和試劑盒。本發(fā)明的試劑盒包括生物芯片和擴(kuò)增樣品中與所述探針雜交的目的片段的引物對組合物引物對SEQ ID NO6和SEQ ID NO7；引物對SEQ ID NO8和SEQ ID NO9；引物對SEQ ID NO10和SEQ ID NO11；引物對SEQ ID NO12和SEQ ID NO13；引物對SEQ ID NO14和SEQ ID NO15。本發(fā)明的試劑盒可檢測登革病毒，并對登革病毒進(jìn)行分型鑒定，可以將登革病毒分類直接鑒定為登革病毒、I型登革病毒、II型登革病毒、III型登革病毒和IV型登革病毒，基于這種方法進(jìn)行了登革病毒分類的實(shí)驗(yàn)，取得了較好的效果，真陽性率達(dá)100％，真陰性率為100％。鑒別四型登革病毒的準(zhǔn)確率達(dá)到100％。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK102286636SQ20111020348
公開日2011年12月21日 申請日期2011年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月20日
發(fā)明者冬冰, 劉春曉, 史蕾, 徐云慶, 楊燕秋, 趙純中, 顧大勇 申請人:深圳市檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院