專利名稱：一種檢測宮頸癌血漿Bmi-1 mRNA的專用試劑盒及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測宮頸癌血漿Bmi-I mRNA的專用試劑盒，以及檢測宮頸癌血漿 ani-lmRNA表達量的方法，屬于分子生物學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
宮頸癌是婦科最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在女性惡性腫瘤中位居第二位， 據(jù)統(tǒng)計，全球每年有新增病例49. 3萬，死亡約27. 4萬，嚴(yán)重危害婦女的身心健康。早期診斷和早期治療是預(yù)防和控制宮頸癌的關(guān)鍵，宮頸癌如及時發(fā)現(xiàn)，并進行恰當(dāng)?shù)奶幚?，其治愈率幾乎達100%。傳統(tǒng)的細(xì)胞學(xué)檢查Pap細(xì)胞涂片檢查，曾經(jīng)大大降低了宮頸癌的死亡率， 但其發(fā)展受到多方面的限制，如對細(xì)胞檢查技術(shù)人員的要求高，存在判斷主觀性，另外取材也容易出現(xiàn)假陰性。陰道鏡加上病理檢查是早期宮頸癌檢查的金標(biāo)準(zhǔn)，但其不適用于篩選檢查。因此，尋找敏感性和特異性更強的早期診斷標(biāo)志物，建立一種經(jīng)濟準(zhǔn)確、安全有效的血清學(xué)宮頸癌篩查方法是目前關(guān)注的焦點。近年來，腫瘤相關(guān)mRNA陸續(xù)在腫瘤患者的血漿/血清中被檢測出來，為腫瘤的無創(chuàng)性早期診斷、治療監(jiān)測和預(yù)后判斷提供了一條新的途徑。并且，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，通過實時熒光定量PCR方法檢測血漿/血清中微量的腫瘤相關(guān)mRNA已成為可能。所謂實時熒光定量PCR技術(shù)是指在PCR反映體系中加入熒光基因，利用熒光信號的積累實時監(jiān)測PCR的進程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對待測模板進行定量分析。由于該技術(shù)具有敏感性高、重復(fù)性好、操作簡便、檢測快速等特點，目前已在臨床核苷酸檢測領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。Bmi-I (B cell-specific moloney leukemia virus integration site-1)基因為一種屬于PcG(P0lyC0megr0up)家族成員的致癌基因，自1991年在鼠淋巴瘤中被發(fā)現(xiàn)后即引起生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的高度關(guān)注。人類ani-1基因克隆和定位在10號染色體短臂13區(qū)， 含有10個外顯子和10個內(nèi)含子。人類ani-1 cDNA長3203bp，共有959個腺嘌呤、591個胞嘧啶、678個鳥嘌呤和975個胸腺嘧啶。aiii-Ι開放的閱讀框編碼一個含3 個氨基酸的蛋白質(zhì)，相對分子質(zhì)量為44000-46000。氨基酸序列分析表明，Bmi-I蛋白有幾個重要的模序(1)環(huán)指模序(ring finger domain, RF)位于N-末端的環(huán)指結(jié)構(gòu)域，由鋅指和 C3HC4保守序列組成。aiii-Ι通過環(huán)指與其他蛋白結(jié)合形成多聚復(fù)合物。RING結(jié)構(gòu)域則控制著BMI-I蛋白在細(xì)胞核內(nèi)的亞定位，該結(jié)構(gòu)域缺失后BMI-I蛋白不再主要局限在細(xì)胞核邊緣分布而是散在分布于整個細(xì)胞核中。(2)位于中心保守DNA結(jié)合模序螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋-轉(zhuǎn)角(DNA bandinghelix-turn-helix-turn motif，H-T-H-T)介導(dǎo) Bmi-I 與 DNA 結(jié)合， 可以和c-myc共同作用導(dǎo)致細(xì)胞增殖和腫瘤形成。HTHTHT結(jié)構(gòu)域決定了 toi-l的轉(zhuǎn)錄抑制功能，而與ani-1蛋白的分布無關(guān)。(3)&iii-l蛋白分子內(nèi)還有兩個核定位信號(nuclear
localization signal, NLS)-NLSI和NLS2，其中NLS2是Bmi-I蛋白定位于細(xì)胞核所必
需的。(4)&iii-l的C-末端部分是富含脯氨酸、谷氨酸、絲氨酸和蘇氨酸殘基的PEST區(qū)域， 與ani-1蛋白在細(xì)胞內(nèi)快速降解有關(guān)。ani-1基因作為c-myc癌基因的協(xié)同基因，在細(xì)胞的中心體擴增調(diào)節(jié)中起著重要的作用，異常的中心體可以導(dǎo)致染色體的異常分裂，最終使遺傳穩(wěn)定性發(fā)生改變，干擾細(xì)胞正?；顒佣l(fā)生癌變。目前已發(fā)現(xiàn)ani-1基因表達異常與人類多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供了一種快速、簡便、準(zhǔn)確的檢測宮頸癌血漿中 Bmi-I基因mRNA的專用試劑盒，以及檢測宮頸癌血漿toi-l mRNA表達量的方法。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的一種檢測宮頸癌血漿aiii-1 mRNA的專用試劑盒，包括基因、GAPDH基因和 EEFlAl基因的mRNA的引物，引物序列如下所示(如SEQUENCE LISTING所示)Bmi-I-F :5，-GAGCGTACTACATTGATGTCACAAC-3，；Bmi-I-R :5，-GCTGGTCTCCAGGTCGCGAACAATA-3，；GAPDH-F :5，-TGCACCACGAACTGCTTAGC-3，；GAPDH-R 5 ’ -GGCATGGACTGTTATCATGAG-3 ’ ；EEFlAl-F :5’ -CTGGCAAGTCCACCAAGTCT-3’ ；EEFlAl-R :5，-CCGTTCTTCACCCACTGATT-3，。所述專用試劑盒還包括PCR反應(yīng)液，PCR反應(yīng)液由Syber Green I熒光染料、DNA 聚合酶、dNTPs、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、氯化鉀和氯化鎂組成。本發(fā)明所提供的試劑盒的引物序列是根據(jù)GeneBank序列號為的基因序列匪 005180、匪002046和匪001402為模板所設(shè)計的，其序列、Tm值及擴增產(chǎn)物長度見表1，該引物序列均跨越了原基因序列中的兩個外顯子，省去了 DNA酶對樣本的處理，避免了基因組DNA對實驗結(jié)果的影響。一種檢測宮頸癌血漿aiii-1 mRNA表達量的方法，步驟如下(1)提取樣本血漿的總RNA ；(2)RT-PCR擴增將上述提取的mRNA進行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，取cDNA為模板，加入引物和PCR反應(yīng)液，進行PCR反應(yīng)，檢測樣本閾值Cq(test sample)；同時以宮頸癌細(xì)胞株 Hela細(xì)胞中提取mRNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA作為校對樣本，在每個PCR反應(yīng)板中進行檢測；(3)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線從宮頸癌細(xì)胞株Hela細(xì)胞中提取mRNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，梯度稀釋后，作為標(biāo)準(zhǔn)品，同步驟⑵進行RT-PCR擴增，檢測Cq值；然后拷貝數(shù)以10為底取對數(shù)作為橫坐標(biāo)，Cq值為縱坐標(biāo)作圖，給出數(shù)據(jù)點的趨勢線，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算斜率slope， 然后根據(jù)公式E = 10(_lM°pe)_l，計算擴增效率E ；(4)計算選中樣本和校對樣本檢測孔，應(yīng)用實時熒光定量PCR儀的隨機軟件得出樣本閾值Cq(test sample)和校對樣本閾值Cq(calibrator sample)，根據(jù)公式Q = (E +1ΓΔ&1，ACq= [Cq(test sample)-Cq(calibrator sample)]，得出基因的校正起始拷貝數(shù) Q ；將樣本目的基因aiii-Ι的Q值與內(nèi)參基因GAPDH基因和EEFlAl的Q值的幾何平均數(shù)相比，得到目的基因ani-1的相對表達量。本發(fā)明建立的宮頸癌血漿aiii-1 mRNA檢測方法，為宮頸癌的早期發(fā)現(xiàn)、早期治療提供了重要的參考依據(jù)。本發(fā)明使用了在宮頸癌中表達相對穩(wěn)定的GAPDH基因和EEFlAl基因作為內(nèi)參基因，對標(biāo)本中的aiii-Ι基因mRNA進行相對定量分析，避免了單一內(nèi)參基因表達不穩(wěn)定對結(jié)果產(chǎn)生的影響。本發(fā)明任意選取一個已知目標(biāo)檢測基因表達的樣品的總RNA(或cDNA)，按10進行系列稀釋，提供5個濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出斜率(slope)，避免了傳統(tǒng)方法構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)品需要通過克隆和體外轉(zhuǎn)錄獲得，實驗過程繁瑣。然后根據(jù)公式E = 10HM°pe)-l，計算擴增效率(E)，根據(jù)公式Q = (Ε+1)_Δ&1計算aiii-Ι基因相對GAPDH基因和 EEFlAl基因的表達量，避免了傳統(tǒng)2_Δ Δ&1法必須要求PCR擴增效率為100%的限制，使結(jié)果分析更加可靠。


圖1為EEFlAl基因、GAPDH基因和Bmi-I基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中，A =EEFlAl基因； B :GAPDH 基因；C =Bmi-I 基因。圖2為血漿ani-1 mRNA在80例健康對照者(healthy)、42例Cim級患者(CINl)， 45例CIN2級患者(CIN2)，51例CIN3級(CIN3)和138例宮頸癌患者(UCC)中的相對表達水平。圖3為血漿aiii-1 mRNA檢測對宮頸癌診斷的ROC曲線。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的說明。下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例一1、試劑盒的組成及配制根據(jù)GeneBank序列號為的基因序列NM_005180、NM_002046和NM_001402為模板， 設(shè)計的檢測目標(biāo)基因(aiii-Ι)和內(nèi)參基因(GAPDH和EEFlADmRNA的引物，其引物序列、Tm 值及擴增產(chǎn)物長度見表1。該引物序列均跨越了原基因序列中的兩個外顯子，省去了 DNA酶對樣本的處理，避免了基因組DNA對實驗結(jié)果的影響。表1引物序列、Tm值及擴增產(chǎn)物長度
權(quán)利要求
1.一種檢測宮頸癌血漿aiii-1 mRNA的專用試劑盒，其特征在于包括ani-l基因、 GAPDH基因和EEFlAl基因的mRNA的引物，引物序列如下所示Bmi-I-F :5’ -GAGCGTACTACATTGATGTCACAAC-3’ ；Bmi-I-R :5’ -GCTGGTCTCCAGGTCGCGAACAATA-3’ ；GAPDH-F :5’ -TGCACCACGAACTGCTTAGC-3’ ；GAPDH-R :5’ -GGCATGGACTGTTATCATGAG-3’ ；EEFlAl-F :5’ -CTGGCAAGTCCACCAAGTCT-3’ ；EEFlAl-R :5’ -CCGTTCTTCACCCACTGATT-3，。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測宮頸癌血漿ani-1mRNA的專用試劑盒，其特征在于還包括PCR反應(yīng)液，PCR反應(yīng)液由Syber Green I熒光染料、DNA聚合酶、dNTPs、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、氯化鉀和氯化鎂組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測宮頸癌血漿aiii-1mRNA的專用試劑盒，其特征在于 所述上游引物和下游引物的體積均為1μ 1，其中，Bmi-l-F, Bmi-l-R, GAPDH-F, GAPDH-R、 EEFlAl-F和EEFlAl-R的濃度均為10 μ M ；所述PCR反應(yīng)液中，各組分的濃度為DNA聚合酶的濃度為100U/ml，dNIPs的濃度為0. 2mM，三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽的濃度為16. 5mM，氯化鎂的濃度為6mM，氯化鉀的濃度為89. 3mM和IXSyber Green I熒光染料。
4.一種檢測宮頸癌血漿aiii-1 mRNA表達量的方法，其特征在于，步驟如下(1)提取樣本血漿的總RNA；(2)RT-PCR擴增將上述提取的mRNA進行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，取cDNA為模板，加入引物和 PCR反應(yīng)液，進行PCR反應(yīng)，檢測樣本閾值Cq(test sample)；同時以宮頸癌細(xì)胞株Hela細(xì)胞中提取mRNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA作為校對樣本，在每個PCR反應(yīng)板中進行檢測；(3)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線從宮頸癌細(xì)胞株Hela細(xì)胞中提取mRNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，梯度稀釋后，作為標(biāo)準(zhǔn)品，同步驟⑵進行RT-PCR擴增，檢測CT值；然后拷貝數(shù)以10為底取對數(shù)作為橫坐標(biāo)，CT值為縱坐標(biāo)作圖，給出數(shù)據(jù)點的趨勢線，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算斜率slope，然后根據(jù)公式E = 10(_lM°pe)-l，計算擴增效率E ；(4)計算選中樣本和校對樣本檢測孔，應(yīng)用實時熒光定量PCR儀的隨機軟件得出樣本閾值 Cq(test sample)和校對樣本閾值 Cq(calibrator sample)，根據(jù)公式 Q = (E+1 廣Δ&1， ACq= [Cq(test sample)-Cq(calibrator sample)]，得出基因的校正起始拷貝數(shù) Q ；將樣本目的基因ani-1的Q值與內(nèi)參基因GAPDH基因和EEFlAl的Q值的幾何平均數(shù)相比，得到目的基因ani-1的相對表達量。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測宮頸癌血漿Bmi-1 mRNA的專用試劑盒，具有結(jié)果穩(wěn)定、分析可靠等優(yōu)點，包括Bmi-1基因、GAPDH基因和EEF1A1基因的mRNA的引物，如SEQUENCE LISTING所示。本發(fā)明還公開了一種檢測宮頸癌血漿Bmi-1 mRNA表達量的方法，具有操作簡便易行等優(yōu)點，步驟如下(1)提取樣本血漿的總RNA；(2)RT-PCR擴增；(3)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算斜率slope，根據(jù)公式E＝10(-1/slope)-1，計算擴增效率E；(4)計算選中樣本和校對樣本檢測孔，應(yīng)用實時熒光定量PCR儀的隨機軟件得出樣本閾值和校對樣本閾值，根據(jù)公式Q＝(E+1)-ΔCq，得出基因的校正起始拷貝數(shù)Q；將樣本目的基因的Q值與內(nèi)參基因的Q值的幾何平均數(shù)相比，得到目的基因Bmi-1的相對表達量。
文檔編號C12Q1/68GK102230014SQ201110167829
公開日2011年11月2日 申請日期2011年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月21日
發(fā)明者張欣, 王傳新 申請人:山東大學(xué)齊魯醫(yī)院